胡居吾

（江西省科學(xué)院應(yīng)用化學(xué)研究所，江西南昌 330096）

大腸桿菌（Escherichia coli）為典型的革蘭氏陰性桿菌，是一類人畜共患的病原體，一般不致病，為人和動(dòng)物腸道中的常居菌，在一定條件下可引起腸道外感染，常引起嬰兒和幼畜（禽）嚴(yán)重腹瀉和敗血癥[1]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）為典型的革蘭氏陽(yáng)性菌，是人類化膿感染中最常見(jiàn)的病原菌，可引起局部化膿感染，也可在人體內(nèi)產(chǎn)生腸毒素，從而刺激腸道，引起嘔吐、腹瀉、發(fā)熱等癥狀。酵母菌屬于真菌，在有氧和無(wú)氧環(huán)境下都能生長(zhǎng)，在釀造、食品、醫(yī)藥工業(yè)方面占有重要地位，可以用來(lái)制造面包，生產(chǎn)酒精和含有酒精的飲料；在醫(yī)藥上將其制造成酵母片，用于治療消化不良等。但是，有些酵母菌對(duì)生物有害，對(duì)人體有致病性，比如白色假絲酵母菌（白色念珠菌）會(huì)生長(zhǎng)在潮濕的陰道壁黏膜上引發(fā)陰道炎，也可能出現(xiàn)在口腔上引起鵝口瘡等，如果酵母菌在食品加工上應(yīng)用量超標(biāo)，也會(huì)引起食品腐爛變質(zhì)，引發(fā)腸道疾病。

綠原酸是由咖啡酸（Caffeic acid）與奎尼酸（Quinic acid）生成的縮酚酸，異名咖啡鞣酸，化學(xué)名3-O-咖啡?？崴帷＞G原酸大量存在于咖啡、杜仲、金銀花中。研究表明，綠原酸主要具有抗菌、阻止病毒入侵等眾多功效[2-6]。異綠原酸是二咖啡?？崴犷惢衔?，是一類由奎尼酸與數(shù)目不等的咖啡酸通過(guò)酯化反應(yīng)縮合而成的有機(jī)酸類，包括異綠原酸A（3,5-二咖啡?？崴幔惥G原酸B（3,4-二咖啡?？崴幔?、異綠原酸C（4,5-二咖啡?？崴幔?，廣泛存在于植物界中。主要的藥理活性有抗菌、抗氧化、抗炎、抗病毒等[7]。

蔓三七 [Gynura procumbens（Lour.）Merr.]為菊科菊三七屬植物，學(xué)名平臥菊三七，又名蛇接骨、續(xù)命草、神仙草，為多年生草本藥食兩用植物，2012年5月平臥菊三七被原衛(wèi)生部批準(zhǔn)為新資源食品，2019年批準(zhǔn)為普通食品。近代藥理研究表明，蔓三七具有消炎、抗癌、降壓、降糖、降脂、抗菌、抗氧化的藥理活性。課題組對(duì)蔓三七葉（干葉，含水量為8.2%）中成分進(jìn)行了檢測(cè)，其綠原酸含量3.05%，異綠原酸A含量0.37%、異綠原酸B含量0.65%，異綠原酸C含量0.29%。

到目前為止，大部分研究人員只研究了蔓三七中綠原酸的抑菌作用，而對(duì)蔓三七中異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C是否具有抑菌作用研究的不多。因此，本研究以抑菌圈直徑和最低抑制濃度為活性追蹤指標(biāo)，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母菌為供試菌，研究了蔓三七中綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的抑菌效果，為進(jìn)一步深入研究蔓三七的功效提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌種

大腸埃希氏菌（CICC 10899），中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）；金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、白色假絲酵母菌（ATCC10225），美國(guó)模式培養(yǎng)物研究所（ATCC）。

1.2 試驗(yàn)材料

營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，上海锃嘉生物工程有限公司；蔓三七葉綠原酸（含量99.2%）、異綠原酸A（含量98.0%）、異綠原酸B（含量99.1%）、異綠原酸C（含量99.2%），實(shí)驗(yàn)室自制。

1.3 儀器設(shè)備

DSHZ-300A型水浴恒溫振蕩器，蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GNP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；QL-861型漩渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；ELx800型酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-ICU雙人單面垂直潔凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌用培養(yǎng)基）：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂20 g，pH調(diào)至7.2，蒸餾水定容至1 000 mL。

豆芽培養(yǎng)基（酵母菌用培養(yǎng)基）：黃豆芽100 g，葡萄糖50 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

1.4.2 菌懸液的制備

菌種活化之后用接種環(huán)挑取一環(huán)菌體或孢子放入50 mL無(wú)菌水中，加入玻璃珠，充分振搖2 min，制成含菌量109～1010cfu/mL的菌懸液或孢子懸浮液備用。

1.4.3 供液試液的配制

將蔓三七葉綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C各取0.25 g，分別用5 mL丙酮溶解得50 mg/mL的藥液，再以丙酮為溶劑對(duì)上述溶液分別進(jìn)行2倍稀釋，每種萃取物得到50.0 mg/mL、25.0 mg/mL、12.5 mg/mL三個(gè)濃度梯度的供試藥液并用丙酮作為空白對(duì)照。

1.4.4 平板培養(yǎng)基的制備

將配制好的培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌冷卻至50～60 ℃，采用無(wú)菌操作倒入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每培養(yǎng)皿裝15～20 mL即可,于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5 體外抑菌試驗(yàn)

本試驗(yàn)采用濾紙片法。選用直徑為12 cm優(yōu)質(zhì)濾紙，121 ℃高壓滅菌40 min，再經(jīng)85 ℃烘干，置于干燥器中備用。取制備好的紙片分別放入不同濃度的供試液中，浸泡2 h后取出。每種濃度每個(gè)供試菌設(shè)3個(gè)重復(fù)。然后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，比較各自抑菌圈直徑，取平均值。抑菌圈越大表明抑菌效果越好。

1.4.6 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定蔓三七葉綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C抑制3種供試菌的最低抑制濃度，采用4組96孔板進(jìn)行行實(shí)驗(yàn)，每組1種供試藥液，根據(jù)魏宇超等[8]的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)結(jié)束后在600 nm處測(cè)量各供試液的OD值。與無(wú)藥有菌組進(jìn)行比較，推算出每個(gè)樣品濃度下的細(xì)菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)，換算為細(xì)菌的百分比抑制率，以最少能抑制80%細(xì)菌成長(zhǎng)（細(xì)菌生長(zhǎng)百分?jǐn)?shù)≤20%）的樣品最低濃度為其最低抑菌濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)供試菌的抑制效果

由表1可知，綠原酸在濃度為12.5～50.0 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑是12.4～16.2 mm，對(duì)白色假絲酵母菌的抑菌圈直徑為12.4～16.8 mm，表明試驗(yàn)濃度綠原酸對(duì)金黃色葡萄球菌、白色假絲酵母菌具有較好的抑制效果；當(dāng)濃度在25.0～50.0 mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑是12.4～14.5 mm，在濃度小于25.0 mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌有一定的抑制作用，但抑菌圈的直徑小于10 mm。

表1 綠原酸和異綠原酸的抑菌活性

異綠原酸A在濃度為50.0 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別是13.5 mm和12.5 mm；濃度低于50.0 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制效果不佳，沒(méi)有明顯的抑菌圈。在濃度為25.0～50.0 mg/mL時(shí)，對(duì)白色假絲酵母菌的抑菌圈直徑為12.7～14.1 mm；濃度小于25 mg/mL時(shí)，對(duì)白色假絲酵母菌的抑制作用也不明顯。

異綠原酸B在濃度為25.0～50.0 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果明顯，抑菌圈直徑分別是12.3～13.6 mm和13.0～15.3 mm；在濃度低于25.0 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制效果不佳，沒(méi)有明顯的抑菌圈；而異綠原酸B只有在高濃度（50.0 mg/mL）情況下，對(duì)白色假絲酵母菌才有抑制作用，此時(shí)的抑菌圈直徑是12.3 mm。

異綠原酸C在濃度為25.0～50.0 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯，抑菌圈直徑12.7～13.3 mm，在濃度低于25.0 mg/mL時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果不佳，沒(méi)有明顯的抑菌圈；試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)大腸桿菌沒(méi)有明顯的抑制作用，只有在高濃度（50.0 mg/mL）情況下對(duì)白色假絲酵母菌才有抑制作用。表明異綠原酸C對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制效果，而對(duì)大腸桿菌和白色假絲酵母菌的抑制作用不明顯。

2.2 綠原酸和異綠原酸對(duì)供試菌的最低抑制濃度

由表2可知，綠原酸對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色假絲酵母菌的最低抑菌濃度分別為8.5 mg/mL、10.3 mg/mL和7.2 mg/mL，對(duì)白色假絲酵母菌的抑制效果略優(yōu)于其他兩種菌。異綠原酸A對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色假絲酵母菌的最低抑菌濃度分別為30.5 mg/mL、32.6 mg/mL和20.5 mg/mL。異綠原酸B對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色假絲酵母菌的最低值抑制細(xì)菌濃度分別為22.2 mg/mL、23.1 mg/mL和33.2 mg/mL，對(duì)白色假絲酵母菌的抑制效果略差于其他兩種菌。異綠原酸C對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和白色假絲酵母菌的最低抑菌濃度分別為21.8 mg/mL、85.6 mg/mL和27.3 mg/mL，對(duì)大腸桿菌的抑制作用較差。整體來(lái)看，綠原酸的抑菌能力最強(qiáng)。

3 結(jié)論

蔓三七葉中綠原酸，異綠原酸A、B和C能起到一定的抑菌效果，主要可能通過(guò)改變供試菌細(xì)胞膜的通透性，破壞供試菌細(xì)胞壁的完整性，阻礙物質(zhì)和能量的代謝及細(xì)菌蛋白合成，造成胞內(nèi)電解質(zhì)、酶及RNA、DNA的泄出，導(dǎo)致細(xì)胞的衰亡，從而發(fā)揮抑菌作用[7-8]。