薛超，劉東璞,2，盛延良,2，呂婷，盧鳳美,2*

（1.佳木斯大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江佳木斯 154000；2.黑龍江省微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點實驗室，黑龍江佳木斯 154000）

近年來，過敏性疾病發(fā)病率明顯增高，已成為嚴(yán)重影響人們身體健康和生活質(zhì)量的全球性疾病。流行病學(xué)調(diào)查資料表明，目前我國的過敏性疾病發(fā)病率有不斷上升的趨勢[1-2]。由于過敏性猝死發(fā)病急驟，難以預(yù)見，極易引起醫(yī)療糾紛等一系列法律問題[3]。因此，與過敏反應(yīng)有關(guān)的死亡引起了法醫(yī)學(xué)家尤其是法醫(yī)病理學(xué)家關(guān)注[4]。當(dāng)前過敏性疾病死亡的法醫(yī)學(xué)診斷仍是在排除其他疾病的基礎(chǔ)上結(jié)合死者的病史、組織病理學(xué)觀察和生物化學(xué)指標(biāo)檢測等做出診斷。因此，找到過敏性疾病死亡的特異性診斷指標(biāo)成為了近年來法醫(yī)學(xué)的熱門研究方向。

HK-1是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型神經(jīng)肽，屬于速激肽家族。HK-1的相關(guān)作用首先在B淋巴細(xì)胞內(nèi)得到證實[5]。而典型的速激肽受體有NI1R、NK2R和NK3R，研究表明HK-1明顯偏好于NK1R[6]。在哺乳動物中，速激肽家族廣泛分布在各種組織和體液中，包括肺臟和胃腸組織的間質(zhì)成分中[7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在重度過敏性疾病的肥大細(xì)胞脫顆粒通路中存在一個HK-1/NK1R自分泌通路，可達(dá)到增強(qiáng)致敏持續(xù)性的效果，和嚴(yán)重的過敏性休克及猝死關(guān)系密切[8]。

為了探究HK-1在過敏性猝死中的表達(dá)及表達(dá)穩(wěn)定性、分析不同保存環(huán)境對尸體中相關(guān)指標(biāo)的干擾程度，在卵蛋白（Ovalbumin，OVA）致大鼠過敏性猝死模型的基礎(chǔ)上，對各指標(biāo)進(jìn)行ELISA和qRTPCR檢測，以期在蛋白表達(dá)方面和mRNA表達(dá)方面對HK-1的表達(dá)進(jìn)行全面系統(tǒng)的檢測，為過敏性疾病的法醫(yī)學(xué)診斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型建立

健康SD雄性大鼠50只（由佳木斯大學(xué)動物實驗中心提供），體質(zhì)量（250±10）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)分為實驗組和對照組，實驗組40只，對照組10只。實驗組再次隨機(jī)分為0 h死亡組（10只）、24 h常溫組（10只）、48 h冷藏組（10只）、7 d冷凍組（10只）[9]。

實驗組按體重給予過敏原，每100 g體重給予10 mg卵蛋白（溶于0.5 mL生理鹽水，弗氏完全佐劑1∶1混合），分別于第1、3、5、7天腹腔注射給藥1次，用以增強(qiáng)致敏效果，第18天尾靜脈注射110%卵蛋白3 mL[10]。對照組按體重給予生理鹽水，每100 g體重給予0.5 mL生理鹽水，分別于第1、3、5、7天腹腔注射生理鹽水1次，第18天尾靜脈注射3 mL生理鹽水，乙醚吸入麻醉后斷頸處死。本研究通過佳木斯大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器

雞卵蛋白和弗氏完全佐劑，美國Sigma-Aldrich公司；大鼠酶聯(lián)免疫分析試劑盒（SP、HK-1、NK1R），上海勁馬實驗設(shè)備有限公司；Total RNA提取試劑（TRIzol），美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR反應(yīng)體系，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；蘇木素，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；伊紅溶液，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

FA2104A型電子天平，上海精天電子儀器有限公司；EG1160智能包埋機(jī)，中國科學(xué)器材進(jìn)口總公司；RM2235型切片機(jī)，德國Leica公司；TEC-2800-C攤片機(jī)，郝恩琳（常州）醫(yī)用儀器有限公司；TProfessional Thermocycler PCR儀，德國Biometra公司；LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀，美國Roche公司；CX23LEDRFS1C型生物顯微鏡，奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HE染色

各組肺部和胃腸組織固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片后進(jìn)行常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.2 ELISA法

標(biāo)準(zhǔn)品按照ELISA試劑盒說明書配制，提取肺部和胃腸組織研磨后提取組織液，稀釋加樣后溫育加酶并顯色，并以空白孔為參照，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品物質(zhì)濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=-0.175 0+145.813 8X，R2=0.996 8。

1.3.3 qRT-PCR法

按照說明書提取肺部和胃腸組織總RNA，之后將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再用熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并采用2-△△CT法對HK-1的相對含量進(jìn)行定量分析。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR反應(yīng)的引物設(shè)計

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0軟件和GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組間的比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 動物建模觀察

對照組尾靜脈注射生理鹽水后無明顯變化。實驗組尾靜脈注射OVA溶液后，大鼠先是叫聲尖利，后出現(xiàn)躁動，呼吸急促，隨后抽搐，最后趴伏，約60 min內(nèi)死亡[11]。

2.2 組織學(xué)觀察

切片進(jìn)行HE染色后，顯微鏡下觀察，各組織HE染色結(jié)果如圖1所示。

圖1 大鼠肺部和胃腸組織HE染色組織學(xué)觀察（×400）

實驗組大鼠可見喉頭、氣管黏膜水腫，黏膜下層可見嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。肺泡壁間隔增寬，且部分肺泡壁破裂，間質(zhì)毛細(xì)血管內(nèi)淤積大量紅細(xì)胞，且有炎癥細(xì)胞滲出至肺泡腔內(nèi)。肺泡腔有少許均質(zhì)粉染的水腫液和纖維滲出。肺泡壁間質(zhì)內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤（圖1A～圖1E）。胃腸壁淤血，胃腸黏膜間質(zhì)血管擴(kuò)張充血且腺體細(xì)胞和血管周圍有大量中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。7 d冷凍組組織自溶嚴(yán)重，但亦可見炎性細(xì)胞浸潤。對照組除了可見不同程度組織自溶外，其余均正常（圖1F～圖1J）。這說明實驗組大鼠有明顯的過敏性病理組織學(xué)癥狀的表現(xiàn)，本實驗OVA致大鼠過敏性猝死模型建造成功。

2.3 ELISA結(jié)果

由表2可知，與對照組相比，各實驗組肺部和胃腸組織中HK-1蛋白相對表達(dá)量均增高，且0 h死亡組、24 h常溫組、48 h冷藏組表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），但3個處理組間差異不顯著（P＞0.05）；7 d冷凍組表達(dá)量與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ELISA結(jié)果表明，長時間的冷凍后解凍和反復(fù)凍融導(dǎo)致的尸體腐敗和組織自溶可能對HK-1蛋白的檢測有一定的影響。

表2 大鼠肺部及胃腸組織HK-1的ELISA檢測結(jié)果（單位：pg/mL）

2.4 qRT-PCR結(jié)果

由表3可知，與對照組相比，7 d冷凍組的肺部和胃腸組織中HK-1 mRNA的相對表達(dá)量沒有顯著變化（P＞0.05）；0 h死亡組、24 h常溫組和48 h冷藏組肺部組織中HK-1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），且隨著保藏時間的延長而下降，各處理組間差異顯著（P＜0.05）；0 h死亡組、24 h常溫組和48 h冷藏組胃腸組織中HK-1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組（P＜0.05），且隨著保藏時間的延長而先上升后下降，各處理組間差異顯著（P＜0.05）。qRT-PCR結(jié)果說明，長時間的冷凍后解凍和反復(fù)凍融導(dǎo)致的尸體腐敗和組織自溶對HK-1mRNA的檢測有一定的影響。

表3 大鼠肺部及胃腸組織HK-1 mRNA相對表達(dá)量水平

3 結(jié)論

通過對HK-1在大鼠過敏性猝死時肺部和胃腸組織中的實驗性研究，觀察其在不同時間和儲存條件下的表達(dá)和變化情況，從而判斷其在過敏性猝死中的法醫(yī)學(xué)診斷意義和價值。結(jié)果表明，過敏性猝死大鼠肺部和胃腸組織0 h死亡組、24 h常溫組、48 h冷藏組中HK-1蛋白和mRNA的表達(dá)水平均高于正常對照組，7 d冷凍組與對照組差別不明顯。說明過長時間冷凍及解凍尸體可降低HK-1的表達(dá)，可為過敏性猝死48 h內(nèi)的法醫(yī)學(xué)鑒定提供一定的參考價值，但缺乏一定的定量結(jié)果，故對長時間冷凍尸體的過敏性猝死的法醫(yī)學(xué)鑒定仍需進(jìn)一步的研究和探索。