王淑嫻，許 拉，樊 英，王友紅，葉海斌，吳海一

(山東省海洋科學(xué)研究院 海洋食品與醫(yī)藥研究中心，山東 青島 266104)

水蛭，別名馬蛭、麻黃蜞、馬蟥等，屬于蛭綱，水蛭科動(dòng)物，具有很高的藥用價(jià)值。水蛭分布于世界各地，共有300多種，在我國有100余種。其中寬體金線蛭、茶色蛭及日本醫(yī)蛭干燥的動(dòng)物全體被《中華人民共和國藥典》認(rèn)定為中藥藥材[1]。水蛭在我國分布范圍很廣，在內(nèi)陸淡水水域內(nèi)生長繁殖，棲息于水田、溝渠中，吸食人、畜血液，是中國傳統(tǒng)的特種藥用水生動(dòng)物。其干制品具有止痛、活血通經(jīng)等功效，可用于治療產(chǎn)后腹痛、高血壓、中風(fēng)偏癱、肝損傷、腎病綜合征等。另外活水蛭外用能吸血消腫，可用于治療癰腫、丹毒等證。近年來由于農(nóng)藥、化肥等濫用，加之養(yǎng)殖戶對(duì)水質(zhì)綜合調(diào)控的重視程度不夠，致使水蛭生活環(huán)境逐漸惡化，各類病害頻繁爆發(fā)，給水蛭養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大損失。

2022年10月，山東某水蛭養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)病情，患病水蛭食欲不振，懶于活動(dòng)，身體收縮，解剖可見內(nèi)臟中有氣泡。本研究從瀕死的患病水蛭體內(nèi)通過分離純化獲得一株優(yōu)勢(shì)菌株，并利用生理生化、分子生物學(xué)、Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)該菌進(jìn)行鑒定，旨在為生產(chǎn)中水蛭的疾病防治提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

TSA胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(購自青島海博生物有限公司)用于細(xì)菌培養(yǎng)；生理生化鑒定管(購自杭州微生物試劑有限公司)用于細(xì)菌的生理生化分析；細(xì)菌快速鑒定板(購自美國Biolog公司)用于Biolog鑒定；細(xì)菌DNA提取和PCR試劑盒(Takara)用于模板提取及擴(kuò)增，其他化學(xué)試劑和引物均購自上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 優(yōu)勢(shì)菌株分離純化 挑取患病的水蛭內(nèi)臟組織，在TSA培養(yǎng)基上劃線，28 ℃過夜培養(yǎng)，挑取優(yōu)勢(shì)菌落繼續(xù)轉(zhuǎn)接至純培養(yǎng)，置于超低溫冰箱(-80 ℃)中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌落形態(tài)及理化特性檢測(cè) 28 ℃下培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)特征；將細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)；預(yù)先測(cè)定菌液濃度，將適量細(xì)菌接種于生理生化鑒定管中，過夜培養(yǎng)后觀察結(jié)果。

1.2.3 Biolog分析 將供試菌株接入GenIII 第三代鑒定板，96孔板分布有陽性、陰性對(duì)照以及71種碳源、23化學(xué)敏感物質(zhì)，培養(yǎng)24 h后通過Biolog微生物鑒定軟件對(duì)測(cè)試板上的“表型指紋”進(jìn)行分析。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 利用廣譜型基因組DNA小量提取試劑盒(TaKaRa)提取細(xì)菌DNA作為PCR反應(yīng)模板。通用引物27F和1 492R作為16S rRNA 基因PCR擴(kuò)增引物。50 μL PCR反應(yīng)體系包含：DNA模板1 μL，引物( 10 μmol/L) 各2 μL，PremixTaqTM ( Ex TaqTM Version 2.0 plus dye) 25 μL，ddH2O 20 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸l min 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃溫育10 min。吸取6 μL的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳20 min，利用凝膠成像儀觀察。參考陸夢(mèng)瑩等[2]的方法，PCR產(chǎn)物送至上海生工生物有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登陸GenBank進(jìn)行BLAST比對(duì)，使用MEGA 4.0軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 患病水蛭優(yōu)勢(shì)菌的分離純化

從患病水蛭的病灶處，分離獲得一株大小、形態(tài)、顏色一致的優(yōu)勢(shì)菌，命名為SZ-1，該菌在TSA 平板上生長菌落形態(tài)為圓形、磚紅色、邊緣不光滑。革蘭氏染色鏡檢顯示，該菌為革蘭氏陰性菌，桿狀，兩端鈍圓，有極生鞭毛。

2.2 菌株SZ-1生理生化特征及Biolog分析

菌株SZ-1在生理生化管中的生長情況顯示：該菌能液化明膠，葡萄糖發(fā)酵、蔗糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵均為陽性；甲基紅試驗(yàn)、檸檬酸鹽發(fā)酵、接觸酶反應(yīng)均為陽性；乙醇、L-鼠李糖利用為陰性；水解淀粉、脂酶反應(yīng)陰性。根據(jù)《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)( 第八版) 》[3]，各項(xiàng)指標(biāo)經(jīng)對(duì)比，與假單胞菌屬相近。

通過Biolog GenIII第三代鑒定板檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)鑒定該菌株為熒光假單胞菌B(PseudomonasfluorescensB)，相似度(SIM )為0.541，位距(DIST)為4.439。測(cè)試板上的“表型指紋”分析結(jié)果如表1所示。

表1 菌株SZ-1 Biolog 鑒定板分析結(jié)果

2.3 16S rRNA基因序列分析與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

菌株SZ-1的16S rRNA 基因序列長度為1 443 bp，其序列通過NCBI-BLAST進(jìn)行同源性檢索顯示其與熒光假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株MH304226.1的16S rRNA基因序列同源性最高，一致性達(dá)99.86%。從Genebank上選取典型的序列，包括熒光假單胞菌、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、鰻弧菌(Vibrioanguillarum)、燦爛弧菌(V.splendidus)、需鈉弧菌(V.natriegens)、地中?；【?V.mediterranei)、歐式弧菌(V.owensii)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)的16S rRNA 基因序列，利用MEGA 4.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，結(jié)果顯示細(xì)菌SZ-1與熒光假單胞菌(MH304226.1和MG576170.1)聚合在一起(如圖1所示)。

根據(jù)細(xì)菌SZ-1的生理生化特征、Biolog分析、16S rRNA基因序列分析以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，將細(xì)菌SZ-1鑒定為熒光假單胞菌。

注：分支上的數(shù)字表示這一分支的可靠程度；長度表示進(jìn)化距離。

3 討論

假單胞菌屬(Pseudomonas)廣泛分布于土壤、淡水、海水以及生物體中，是一類生長適應(yīng)能力較強(qiáng)的革蘭氏陰性菌，大多不致病，還有一部分是條件致病菌。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，熒光假單胞菌是一類常見的水生生物條件致病菌，因感染熒光假單胞菌而引發(fā)各種細(xì)菌性疾病的情況越來越普遍，該菌能感染無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物，對(duì)魚蝦的危害尤其嚴(yán)重[4-5]。徐國成等[6]發(fā)現(xiàn)熒光假單胞桿菌感染對(duì)蝦后引起熒光病，蝦苗出現(xiàn)活力下降，食欲不振，直至死亡。王高學(xué)等[7]發(fā)現(xiàn)大鯢感染該菌會(huì)患赤皮癥，體表呈現(xiàn)出化膿性潰瘍并且布滿紅斑塊。中國常見的水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類中，熒光假單胞菌能夠引起草魚、鯉和大菱鲆等發(fā)生赤皮病[5]，但是目前還未有該菌引起水蛭患病的報(bào)道。

致病性熒光假單胞菌對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的危害日益嚴(yán)重，且有研究表明它可能是一種潛在的人畜共患病原，能夠引起菌血癥、皮膚病、消化系統(tǒng)和呼吸道感染等疾病的爆發(fā)[8]，這警示人們應(yīng)該對(duì)該菌引起重視。

本研究中通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)特征、生理生化結(jié)果初步鑒定SZ-1菌株屬于假單胞菌屬。Biolog GenIII微孔板可對(duì)細(xì)菌進(jìn)行71種碳源利用測(cè)試以及23 種化學(xué)敏感性測(cè)試，其“表型指紋”被用來在種水平上鑒定該微生物，本研究中Biolog GenIII分析鑒定該菌株為熒光假單胞菌。細(xì)菌SZ-1的16S rRNA 基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，顯示該菌的16S rRNA基因序列與已報(bào)道的熒光假單胞菌(MH304226.1和MG576170.1) 16S rRNA基因序列的相似性高達(dá)99%以上，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹也表明，SZ-1菌株與熒光假單胞菌聚為一支。

綜上所述，本研究中利用微生物學(xué)和分子生物學(xué)方法，對(duì)患病水蛭進(jìn)行了病原菌的分離和鑒定，研究結(jié)果可為水蛭養(yǎng)殖過程中熒光假單胞菌的疾病防治提供基礎(chǔ)資料。