吳偉鋒 侯浩楠 涂柯玲 寧翠玲 楊成民 董學(xué)會 曹海祿 孫群

（1 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/中國農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材研究中心/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)作物種子全程技術(shù)研究北京創(chuàng)新中心/北京市作物遺傳改良重點(diǎn)實驗室，北京 100193；2 承德恒德本草農(nóng)業(yè)科技有限公司，河北承德 067000；3 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；4 恒德本草（北京）農(nóng)業(yè)科技有限公司，北京 100070）

紫蘇（Perilla frutescens（L.）Britt.）為唇形科紫蘇屬一年生草本植物，是我國傳統(tǒng)中藥的重要一味，以全草入藥，葉可解表散寒，籽可潤肺平喘，?？衫須鈱捴衃1]。紫蘇市場需求廣泛，在我國各地均有規(guī)?；斯しN植。但目前市場上銷售的紫蘇種子多從大田或野外直接采收而來，種子質(zhì)量難以控制，種子凈度、發(fā)芽率、出苗整齊度偏低[2]。從紫蘇種子質(zhì)量相關(guān)的3個現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，即中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2494—2013《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南 紫蘇》[3]、中華中醫(yī)藥學(xué)會團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)T/CACM 1056.83—2019《中藥材種子種苗 紫蘇種子》[4]和河北省地方標(biāo)準(zhǔn)DB13/T 1320.1—2010《中藥材種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 第1 部分：紫蘇》[5]來看，這3個文件規(guī)定的發(fā)芽率標(biāo)準(zhǔn)（≥75%）均遠(yuǎn)低于農(nóng)作物種子的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。種子質(zhì)量已成為制約紫蘇規(guī)范化生產(chǎn)和發(fā)展的“瓶頸”。種子作為最基本的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資料，在儲藏的過程中會發(fā)生自然老化，隨著老化程度的增加，種子的活力會持續(xù)下降，對種子播種后萌發(fā)以及田間出苗等會產(chǎn)生極大的影響。傳統(tǒng)檢測種子生活力或活力的方法是進(jìn)行發(fā)芽試驗，測量周期長，對種子具破壞性，而且由于發(fā)芽環(huán)境及人為操作等因素，結(jié)果穩(wěn)定性不夠理想。種子清選是提升種子質(zhì)量的重要手段之一，主要按種子的物理特性（如寬度、厚度、長度、比重、臨界懸浮速度、顏色等）除去種子中的夾雜物質(zhì)，如未成熟的、破碎的以及遭受病蟲害的種子和雜草種子，提升種子的凈度和發(fā)芽率。在判斷加工程序的有效性方面，多肉眼判斷凈度，無法快速評判種子的活力。中藥材種業(yè)市場的種子質(zhì)量監(jiān)管、種子質(zhì)量提升手段有效性的及時判斷等均需要對種子活力進(jìn)行快速檢測。

種皮葉綠素含量是作為判定種子成熟度及種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一，種子葉綠素含量高，則成熟度低；反之，葉綠素含量低則成熟度相對高。歐洲廣泛采用葉綠素?zé)晒鈨x對種子葉綠素含量進(jìn)行快速檢測[6-8]，葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)的操作原理是當(dāng)波長650～730nm 的光照在種子表皮上，種子表皮上的葉綠素將以熒光和熱的形式散發(fā)能量，通過對種子表皮上葉綠素?zé)晒獾臋z測，實現(xiàn)種子成熟度或種子活力的快速判別。Jalink等[9]依靠葉綠素?zé)晒夂繉ΨN子活力進(jìn)行分級；Kenanoglu等[10]使用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)種子分選機(jī)對辣椒種子進(jìn)行分級。目前光學(xué)葉綠素?zé)晒鈾z測儀便攜易操作，檢測快速，但仍存在成本較高的問題。

機(jī)器視覺技術(shù)近年來發(fā)展迅速，是一種計算機(jī)技術(shù)和圖像識別處理技術(shù)相結(jié)合的多領(lǐng)域新型交叉技術(shù)[11]，具有計算能力強(qiáng)、價格低、非破壞性和高效率等特點(diǎn)[12]，在農(nóng)作物種子質(zhì)量分類、品種鑒別等方面已有廣泛應(yīng)用[13-16]。Xu等[17]通過機(jī)器視覺技術(shù)采集提取了黃芪種子的多個顏色特征，其中R 值和G 值與葉綠素含量的決定系數(shù)R2達(dá)到0.969 和0.965，基于多個特征建立的葉綠素含量預(yù)測模型，其R2達(dá)到0.940 以上。

基于上述研究進(jìn)展，本研究利用收集到的大量不同來源、不同加工方式處理后的紫蘇種子，通過機(jī)器視覺技術(shù)采集種子的尺寸、顏色和紋理等表型指標(biāo)，通過比較單粒種子各表型指標(biāo)與活力之間的相關(guān)性，以篩選到的指標(biāo)在不同活力紫蘇種子批間進(jìn)行比較驗證，確定可以代替葉綠素含量的種子活力快檢指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料試驗以15個批次（來源）紫蘇種子作為試驗材料（表1），其中單粒試驗使用Lot 3 批次紫蘇種子，千粒重為3.134g，發(fā)芽率為69.3%。以33份不同加工環(huán)節(jié)（篩選、比重選、色選處理）的紫蘇種子（Lot 1加工后的3份種子，Lot 2加工后的4份種子，Lot 3 加工后的10 份種子，Lot 12 加工后的6 份種子，Lot 13 加工后的2 份種子，Lot 14 加工后的6 份種子，Lot 15 加工后的2 份種子）為快檢指標(biāo)驗證樣品。

表1 15個批次的紫蘇種子

1.2 試驗方法

1.2.1 單粒試驗從Lot 3 中選取凈種600 粒，置于Microtek MiCardWizard 掃描儀（上海中晶科技有限公司）上，進(jìn)行種子掃描，獲得分辨率為300dpi 的圖片，保存為.tif 無損格式。

使用種子表型全自動提取系統(tǒng)（PhenoSeed，南京智農(nóng)云芯大數(shù)據(jù)科技有限公司與中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種子科學(xué)與技術(shù)研究中心共同研發(fā)）進(jìn)行種子表型指標(biāo)的提取。尺寸指標(biāo)包括長（Length，單位mm）、寬（Width，單位mm）、長寬比（L/W Ratio）、投影面積（Area，單位mm2）、周長（Perimeter，單位mm）、圓度（Roundness）；顏色指標(biāo)包括紅色值（Red，R）、綠色值（Green，G）、藍(lán)色值（Blue，B）、色相（Hue，H）、飽和度（Saturation，S）、明度（Value，V）、亮度（Luminosity，L）、從紅色至綠色的范圍（a）、從藍(lán)色至黃色的范圍（b）、灰度（Gray）的平均值（mean）及標(biāo)準(zhǔn)差（std）；紋理指標(biāo)包括Gray、R、G、B 這4個分量下的對比度（Contrast）、相異性（Dissimilarity）、同質(zhì)性（Homogeneity）、能量（Energy）、自相關(guān)（Correlation）、角二階矩（ASM）、熵（Entropy）。

將種子按掃描時的序號放入發(fā)芽盒中，25℃光照條件下進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗，每天檢查種子是否發(fā)芽，統(tǒng)計到第8 天。

然后采用Excel 2016、SPSS 21.0 對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計，分析單粒種子發(fā)芽情況與種子表型指標(biāo)之間的相關(guān)性。

1.2.2 群體試驗測定15個批次紫蘇種子的尺寸、顏色、紋理指標(biāo)，分析種子的表型指標(biāo)與種子發(fā)芽率之間的相關(guān)性。

1.2.3 快檢指標(biāo)的篩選與驗證以33 份不同加工環(huán)節(jié)處理（篩選、比重選、色選）后的紫蘇種子建立驗證樣品池。采用FluoMini Pro 光學(xué)葉綠素?zé)晒猓–F）檢測儀檢測其葉綠素含量，補(bǔ)充提取機(jī)器視覺指標(biāo)和發(fā)芽率，進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單粒紫蘇種子活力與機(jī)器視覺指標(biāo)的相關(guān)性分析相關(guān)性分析表明，多項指標(biāo)與單?；盍Υ嬖谙嚓P(guān)性，篩選出20個與單粒發(fā)芽結(jié)果顯著或極顯著相關(guān)的指標(biāo)。由表2 可知，顏色指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)（紅色值、綠色值、藍(lán)色值、從紅色至綠色的范圍、從藍(lán)色至黃色的范圍、色相、飽和度、明度）多高于尺寸指標(biāo)（長、寬、長寬比、投影面積、圓度）。其中從紅色至綠色的范圍、從藍(lán)色至黃色的范圍、色相、飽和度這幾個指標(biāo)與活力的相關(guān)系數(shù)較高，絕對值達(dá)到0.437 以上。后續(xù)將重點(diǎn)關(guān)注這幾個顏色指標(biāo)。

表2 紫蘇單粒種子表型指標(biāo)與發(fā)芽率相關(guān)指標(biāo)篩選

2.2 不同批次紫蘇種子活力與機(jī)器視覺指標(biāo)的相關(guān)性分析以15 份紫蘇種子為材料進(jìn)行群體試驗，對種子批發(fā)芽率和群體表型指標(biāo)平均值進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明多個顏色指標(biāo)與發(fā)芽率存在顯著相關(guān)或極顯著相關(guān)，相較于單粒試驗，未篩選到尺寸指標(biāo)。從表3 可以看出，與單粒發(fā)芽試驗相比，顯著或極顯著相關(guān)的指標(biāo)數(shù)量減少至10個。其中葉綠素含量與發(fā)芽率呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.549。單粒試驗中篩選到的從紅色至綠色的范圍、從藍(lán)色至黃色的范圍、色相、飽和度指標(biāo)同樣出現(xiàn)在群體試驗結(jié)果中，相關(guān)系數(shù)分別為-0.826、-0.949、0.922、-0.820。除了指標(biāo)平均值外，雖然從紅色至綠色的范圍標(biāo)準(zhǔn)差、從藍(lán)色至黃色的范圍標(biāo)準(zhǔn)差、飽和度標(biāo)準(zhǔn)差與發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)絕對值超過0.549（參考葉綠素與發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)），考慮到檢測的方便性，舍棄不用。后面的驗證試驗將重點(diǎn)驗證從紅色至綠色的范圍、從藍(lán)色至黃色的范圍、色相、飽和度這幾個指標(biāo)。

表3 15 份紫蘇種子表型指標(biāo)與發(fā)芽率相關(guān)指標(biāo)篩選

2.3 快檢指標(biāo)篩選以33 份不同加工環(huán)節(jié)（機(jī)器篩選、液體比重選及G、R 值分選）的紫蘇種子進(jìn)行驗證，獲得與前面相對一致的結(jié)果，篩選出22個與發(fā)芽率顯著或極顯著相關(guān)指標(biāo)。其中葉綠素含量與發(fā)芽率呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.569（表4）。從紅色至綠色的范圍、從藍(lán)色至黃色的范圍、色相、飽和度這幾個指標(biāo)中色相與發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)降到0.380，不如其余3個指標(biāo)穩(wěn)定。從紅色至綠色的范圍、從藍(lán)色至黃色的范圍、飽和度均與發(fā)芽率呈極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.596、-0.730、-0.699，雖略低于15 份紫蘇種子中與發(fā)芽率的相關(guān)系數(shù)，但仍均高于葉綠素含量與發(fā)芽率之間的相關(guān)系數(shù)。進(jìn)一步比較不同加工環(huán)節(jié)分選得到的不同組別種子間從紅色至綠色的范圍、從藍(lán)色至黃色的范圍、飽和度這3個指標(biāo)的變異系數(shù)，探究其在區(qū)分種子發(fā)芽率上的有效性，結(jié)果表明從紅色至綠色的范圍平均值在不同組別之間變異系數(shù)最高，穩(wěn)定高于不同組別的葉綠素變異系數(shù)，因此優(yōu)先推薦通過檢測從紅色至綠色的范圍平均值進(jìn)行生產(chǎn)上加工或處理手段的有效性判斷。

表4 33 份紫蘇種子表型指標(biāo)與發(fā)芽率相關(guān)指標(biāo)篩選

3 結(jié)論與討論

3.1 單粒試驗發(fā)現(xiàn)紫蘇種子活力與顏色指標(biāo)相關(guān)性強(qiáng)進(jìn)行紫蘇種子單粒發(fā)芽試驗的目的是為了將每粒種子的表型指標(biāo)與其發(fā)芽情況對應(yīng)，通過隨機(jī)選取一定數(shù)量的紫蘇種子進(jìn)行試驗，可以得到大量的表型數(shù)據(jù)和對應(yīng)的發(fā)芽結(jié)果，從而對活力快檢指標(biāo)進(jìn)行初步篩選。相關(guān)性分析表明，20個指標(biāo)與發(fā)芽率存在顯著或極顯著關(guān)系，種子的多個尺寸指標(biāo)包含在其中，但相關(guān)系數(shù)并不高，多數(shù)低于顏色指標(biāo)。

考慮紫蘇種子快檢指標(biāo)的篩選精簡性和實用性，為此選擇了相關(guān)系數(shù)較高的a、b、H、S 值作為初步的篩選指標(biāo)，后續(xù)對15 份不同批次的種子進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，驗證以上4個指標(biāo)作為快檢指標(biāo)的可靠性。

3.2 群體試驗發(fā)現(xiàn)紫蘇種子活力與a、b、H、S指標(biāo)相關(guān)性強(qiáng)對15 份種子分別進(jìn)行機(jī)器視覺掃描、葉綠素含量測定以及發(fā)芽率測定，并將每份種子的表型指標(biāo)平均值與發(fā)芽率進(jìn)行相關(guān)性分析，最終選取得到10個與發(fā)芽率顯著或極顯著相關(guān)指標(biāo)。相較于單粒試驗結(jié)果，群體試驗并未篩選到與活力顯著相關(guān)的尺寸指標(biāo)，這表明在同一批次內(nèi)，紫蘇種子活力與尺寸指標(biāo)相關(guān)聯(lián)，但在不同批次之間，種子的尺寸差異更多是遺傳因素所導(dǎo)致，與活力的關(guān)系并不顯著。相比之下，顏色指標(biāo)與活力的相關(guān)性較為穩(wěn)定，其中從紅色至綠色的范圍（a）、從藍(lán)色至黃色的范圍（b）、色相（H）、飽和度（S）指標(biāo)相關(guān)系數(shù)絕對值均穩(wěn)定高于0.549（參考葉綠素相關(guān)系數(shù)）。

3.3 快檢指標(biāo)篩選除機(jī)器視覺技術(shù)外，近年來基于光學(xué)特性的種子活力快速無損檢測技術(shù)也在逐漸興起，包括X 射線技術(shù)、近紅外光譜技術(shù)、高光譜成像技術(shù)等。但這些技術(shù)尚處于實驗室研究階段，目前市面上缺少商用的種子活力檢測設(shè)備，原因在于光學(xué)檢測技術(shù)成本普遍較高，并且對于不同品種或批次的種子，往往需要通過光譜數(shù)據(jù)和發(fā)芽試驗建立相應(yīng)的模型，實際應(yīng)用較為復(fù)雜[18]。本研究首次采用機(jī)器視覺技術(shù)對紫蘇種子進(jìn)行快檢指標(biāo)篩選，在一定程度上，對檢測加工工序是否有效、種子處理是否有效等提供了數(shù)據(jù)指導(dǎo)，大大降低了檢測成本，實際操作也更為簡便。本研究以各種比重篩選、液體比重選及色選分選的種子作為驗證材料，對從紅色至綠色的范圍、從藍(lán)色至黃色的范圍、色相、飽和度作為快檢指標(biāo)的穩(wěn)定性和區(qū)分度進(jìn)行比較，擴(kuò)充了樣本數(shù)據(jù)池，增加了數(shù)據(jù)可信性。

通過分析比較不同加工環(huán)節(jié)的種子進(jìn)行快檢指標(biāo)的確定，最終以相關(guān)性穩(wěn)定的從紅色至綠色的范圍（a）、從藍(lán)色至黃色的范圍（b）、飽和度（S）作為快檢指標(biāo)。在紫蘇種子生產(chǎn)、加工、銷售等各個環(huán)節(jié)，可通過機(jī)器視覺技術(shù)快速提供種子的a、b、S 值，用于種子質(zhì)量的快速判定，比較加工工序是否有效，種子處理是否有效等。