潘靜，張俊超，陳有軍，周青平*

（1.西南民族大學(xué)青藏高原研究院，四川 成都 610041；2.四川省抗逆牧草種質(zhì)創(chuàng)新及生態(tài)修復(fù)工程實驗室，四川 成都 610041；3.四川若爾蓋高寒濕地生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站，四川成都 610041）

DNA標(biāo)記作為近年來迅速發(fā)展的一種技術(shù)手段，廣泛地應(yīng)用于植物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域［1］。在功能基因組學(xué)的研究中，基于目的基因開發(fā)的功能性分子標(biāo)記是今后分子標(biāo)記發(fā)展的必然方向［2］。目的起始密碼子多態(tài)性標(biāo)記（start codon targeted polymorphism，SCoT）是在水稻（Oryza sativa）上開發(fā)的一種類似隨機引物多態(tài)性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）的基因型分子標(biāo)記，它利用較高的退火溫度（50℃）能夠有效地減少假陽性擴增的可能性［3］。與其他標(biāo)記相比，SCoT標(biāo)記結(jié)合了內(nèi)部簡單重復(fù)序列標(biāo)記（inter-simple sequence report，ISSR）和RAPD標(biāo)記的優(yōu)點，具有更好的穩(wěn)定性、重復(fù)性等優(yōu)點，同時有效的產(chǎn)生多態(tài)性，更好地反映物種遺傳多樣性及親緣關(guān)系［4-5］。SCoT技術(shù)是一種新型分子標(biāo)記技術(shù)，在遺傳多樣性和遺傳育種等研究中具有重要的意義。自2009年被開發(fā)以來，該分子標(biāo)記已大量應(yīng)用于經(jīng)濟作物的相關(guān)研究中，如楊桃（Averrhoa carambola）［6］、葡萄（Vitis vinifera）［7］、芒果（Mangifera indica）［8］和蓖麻（Ricinus communis）［9］等。但在牧草領(lǐng)域中的相關(guān)研究較少，目 前 在 紫 花 苜 蓿（Medicago sativa）［2］、燕麥（Avena sativa）［10］、高 粱（Sorghum bicolor）［11］、老芒麥（Elymus sibiricus）［12］和鴨茅（Dactylis glomerata）［13］等有少量報道。

披堿草屬（Elymus）是小麥族中最大的屬，廣泛分布于美洲、歐洲、亞洲和非洲。受生態(tài)環(huán)境差異的影響，種質(zhì)間存在較大的形態(tài)差異。作為禾本科小麥族披堿草屬多年生疏叢型植物，披堿草（Elymus dahuricus）、老芒麥和垂穗披堿草（Elymus nutans）是青藏高原高寒地區(qū)廣泛分布的野生種質(zhì)資源，具有抗寒性強、適應(yīng)性強和易栽培等優(yōu)良性狀，是高寒地區(qū)優(yōu)質(zhì)的飼用牧草資源［14-15］。野生老芒麥、披堿草和垂穗披堿草在青藏高原地區(qū)分布廣泛，對野生披堿草屬種質(zhì)進行收集和鑒定，是挖掘牧草優(yōu)異性狀和種質(zhì)資源遺傳改良工作的重要基礎(chǔ)。

老芒麥、披堿草和垂穗披堿草均為花序下垂類披堿草屬物種，根據(jù)其形態(tài)學(xué)特征可以將這3個物種區(qū)分開來。但因其生長條件的差異，會對基于形態(tài)學(xué)特征的物種鑒別產(chǎn)生影響［16］。陳麗麗等［17］利用形態(tài)學(xué)觀測和聚類分析等方法對不同地區(qū)的54份披堿草屬種質(zhì)進行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)老芒麥和垂穗披堿草在形態(tài)學(xué)上性狀交叉較多。李淑娟［18］對披堿草、垂穗披堿草、肥披堿草（Elymus excelsus）、黑紫披堿草（Elymus atratus）和老芒麥等28份披堿草屬種質(zhì)進行農(nóng)藝性狀觀測和ISSR分析，結(jié)果表明，在收集野外種質(zhì)資源時，存在著物種混淆的現(xiàn)象。所以，僅通過形態(tài)學(xué)性狀對野外披堿草屬種質(zhì)資源進行鑒別有一定的難度。本研究利用SCoT分子標(biāo)記對46份野生披堿草屬種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，并構(gòu)建其DNA指紋圖譜，以期為青藏高原地區(qū)野生披堿草屬種質(zhì)鑒定、優(yōu)質(zhì)性狀挖掘、育種實踐提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究的供試材料均來自西南民族大學(xué)紅原基地種質(zhì)資源圃，包含46份披堿草屬種質(zhì)資源樣品（表1），其中19份為披堿草種質(zhì)（ED）、13份為垂穗披堿草種質(zhì)（EN）、14份為老芒麥種質(zhì)（ES）。2021年6月將供試材料播種于花盆，置于植物生長培育溫室中。采集46份披堿草屬種質(zhì)的幼嫩葉片樣品，液氮速凍后保存于-80℃冰箱待用。

表1 試驗材料及來源Table 1 Materials used in the study and source

1.2 DNA提取

對每份種質(zhì)資源采集15株的鮮嫩無病害葉片進行收集、混合并凍干。通過植物基因組DNA試劑盒（北京天根生化）提取DNA。使用NanoDrop-Lite超微量分光光度計（Thermo Science，美國）測定DNA的質(zhì)量和濃度。最后將合格的樣品統(tǒng)一稀釋到10 ng·μL-1，保存至-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選

所用80個SCoT引物參 考了Collard等［3］（SCoT 1～SCoT 36）及Luo等［4］（SCoT37～SCoT80）的 報道，引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，PCR所用2×Es Taq MasterMix混合液（含有10×PCR buffer、Mg2+、dNTPs）購自康為世紀(jì)生化公司。選取4份植物形態(tài)差異較大的種質(zhì)材料，預(yù)先篩選出22個擴增條帶清晰、重復(fù)性較好的SCoT引物，確定它們適宜的退火溫度（表2），用于供試46份披堿草屬野生材料的進一步PCR擴增。

表2 篩選出的引物和退火溫度Table 2 Screened primers and annealing temperatures

1.4 SCoT-PCR擴增

披堿草屬SCoT-PCR擴增體系參照李進等［10］

的方法進行。用于PCR擴增試驗的反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL模 板DNA（10 ng·μL-1），9 μL 2×Es Taq MasterMix預(yù)混液（康為世紀(jì)，北京），2 μL引物（10 μmol·μL-1）和7 μL ddH2O。PCR擴 增 反 應(yīng) 在Eppendorf Master cycler nexus X2 PCR儀 上 進 行，擴增程序為：首先進行95℃預(yù)變性5 min；其次是94℃變性1 min；退火（50～62℃）1 min；72℃延伸2 min，反應(yīng)34個循環(huán)；然后在72℃延伸10 min；最后4℃保存。擴增反應(yīng)結(jié)束后在1倍的Tirs-硼酸-EDTA緩沖液（Tris-Borte-EDTA buffer，TBE）中電泳，擴增產(chǎn)物從含有0.12 ng·mL-1GeneRed（天根生化，北京）的1.3%瓊脂糖凝膠中分離，使用BIO-RAD凝膠成像分析系統(tǒng)（美國）進行凝膠攝影。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

SCoT為顯性標(biāo)記，選取條帶清晰且具有重復(fù)性的DNA條帶進行統(tǒng)計，將擴增條帶的有或無分別賦值為1和0進行統(tǒng)計，構(gòu)建0，1矩陣。參考劉新龍等［19］的方法估算出PCR產(chǎn)物的分子量，用于構(gòu)建46份披堿草屬種質(zhì)的DNA指 紋 圖譜。使 用Excel 2010和POPGENE 32［20］（V 1.32）計 算 多 態(tài) 性 條帶數(shù) 量（number of polymorphic bands，NPB）、多態(tài)性條帶百分比（percentage of polymorphic bands，PPB）、Shannon多樣性信息指數(shù)（I）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、觀察等位基因數(shù)（Na）和有效等位基因數(shù)（Ne）。分子方差分析（analysis of molecular variance，AMOVA）可以將SCoT總變異劃分為群體內(nèi)和群體間［21］。使用MEGA 7（V 7.0.18）的非加權(quán)成對算術(shù)平均法（unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA）來分析不同種質(zhì)間的關(guān)系并構(gòu)建聚類樹狀圖。基于Jaccard’s遺傳相似系數(shù)，使用NTSYS（V 2.10）繪制主成分分析（principal component analysis，PCA）圖。使用Structure（V 2.3.4）軟件分析披堿草屬種質(zhì)的居群結(jié)構(gòu)，最大似然數(shù)（maximum likelihood estimation，MLE）和△K值來確定最佳分群數(shù)K［22-23］，最終構(gòu)建46份披堿草屬種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)圖。族群遺傳變異（population genetic analysis，POPGENE）和AMOVA的輸入文件是在張富民等［24］編寫的DCFA（V 1.1）程序上進行的。同時，參考楊祥燕等［25］的方法構(gòu)建46份披堿草屬種質(zhì)的DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCoT引物擴增結(jié)果分析

利用篩選出的22條引物對46份披堿草屬材料進行SCoT-PCR擴增，擴增條帶分子量為150～2300 bp。擴增結(jié)果表明（表3），22條SCoT引物共獲得清晰且重復(fù)性較好的條帶290條，其中多態(tài)性條帶254條，多態(tài)性條帶比率（PPB）占87.59%，每條SCoT引物擴增條帶變化范圍在9～18條，平均為13.18條，多態(tài)性條帶變化范圍在7～15條，平均為11.55條，每個SCoT引物擴增多態(tài)性比率變幅為66.7%～100.0%，結(jié)果表明供試材料間具有較高的多態(tài)性水平，所篩選的SCoT引物具有較高的多態(tài)性檢測效率，可用于對供試的披堿草屬材料進行遺傳多樣性分析。

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 披堿草屬3個物種間的遺傳多樣性 多態(tài)性條帶數(shù)（NPB）從208（EN）到226（ED），平均值為218。多態(tài)性條帶百分比值（PPB）范圍從89.05%（ES）到92.33%（EN），平均值為90.80%（表4）。Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）范圍為0.3755至0.4085，平均值為0.3934。Shannon多樣性信息指數(shù)（I）的范圍為0.4488至0.5785，平均值為0.5035。觀察等位基因數(shù)（Na）的范圍為1.9499至1.9888，平均值為1.9663。有效等位基因數(shù)（Ne）的范圍為1.6669至1.7427，平均值為1.7042。披堿草屬3個物種中，垂穗披堿草類群具有較高的遺傳多樣性（NPB=208；PPB=92.33%；Na=1.9888；I=0.5785；H=0.3963；Ne=1.7030）。不同物種類群的遺傳多樣性從高到低排序為：垂穗披堿草＞披堿草＞老芒麥，表明披堿草屬種質(zhì)資源遺傳多樣性較為豐富。

表4 通過SCoT標(biāo)記檢測到的披堿草屬3個種群內(nèi)的遺傳變異Table 4 Genetic variation in three populations of Elymus detected by SCoT markers

2.2.2 披堿草屬3個物種內(nèi)的遺傳多樣性 AMOVA分析顯示，27.09%的變異在種群間分配，72.91%的變異在種群內(nèi)分配（表5）。

表5 3個屬的分子方差分析Table 5 Analysis of molecular variance（AMOVA）of three genera regions

2.3 居群聚類與結(jié)構(gòu)分析

利用NTSYS-pc軟件對46份披堿草屬材料進行聚類分析。22個引物可將46份種質(zhì)完全區(qū)分開，結(jié)果表明（圖1），46份種質(zhì)聚為兩大類群（相似性指數(shù)為0.50）。第I類群包括披堿草種質(zhì)和垂穗披堿草種質(zhì)；第II類群包括老芒麥種質(zhì)；第I類群在遺傳相似系數(shù)為0.56處可分為兩個亞類，第i亞類包括19份披堿草種質(zhì)，第ii亞類包括13份垂穗披堿草種質(zhì)。根據(jù)SCoT標(biāo)記所得結(jié)果，利用NTSYS-pc軟件進行主成分分析（圖2），不同種質(zhì)在坐標(biāo)圖的位置分布可清晰地顯示出它們之間的親緣關(guān)系和遺傳差異。位置越近，表明它們之間遺傳差異較小，親緣關(guān)系越近；位置越遠(yuǎn)則表明它們之間遺傳差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。主坐標(biāo)分析將位置相近的種質(zhì)劃分到一起，明顯可分為3個類群，19份披堿草種質(zhì)組成第I類群，13份垂穗披堿草種質(zhì)組成第II類群，14份老芒麥種質(zhì)組成第III類群。以上分析表明，聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果基本一致。

圖1 SCoT標(biāo)記對46份披堿草屬材料親緣關(guān)系聚類分析Fig.1 UPGMA dendrogram for 46 resources of Elymus based on SCoT markers

圖2 披堿草屬各種質(zhì)的SCoT標(biāo)記三維柱坐標(biāo)分析散點圖Fig.2 The scatter plot of principal coordinates analysis of Elymus genotypes from SCoT markers

2.4 種群結(jié)構(gòu)分析

利用Structure（V 2.3.4）軟件的Hardy-Weinberg模塊平衡分析46份種質(zhì)的種群結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明（圖3）：當(dāng)K=3時獲得△K最大值，因此確定值為3。并將46份披堿草屬種質(zhì)劃分為3個種群（圖4），分別記為Q1、Q2、Q3。其中，披堿草的19份種質(zhì)被分配到了第1組（Q1）；垂穗披堿草的13份種質(zhì)被分配到了第2組（Q2）；老芒麥的14份種質(zhì)被分配到了第3組（Q3）。結(jié)果表明，種群結(jié)構(gòu)劃分結(jié)果與聚類分析結(jié)果基本一致。

圖3 基于Structure軟件分析的K值曲線Fig.3 Curve diagram of K value based on Structure analysis

圖4 46份披堿草屬種質(zhì)群體結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Population genetic structure of 46 Elymus genotypes

2.5 基于SCoT標(biāo)記構(gòu)建DNA指紋圖譜

通過篩選的22個引物對46份種質(zhì)的擴增結(jié)果分析，結(jié)合特異性引物的條帶分辨率及重復(fù)性高低，選取其中的SCoT 49、SCoT 54、SCoT 57和SCoT 59共4個引物擴增的16個多態(tài)性位點構(gòu)建了46份種質(zhì)的DNA指紋圖譜（圖5）。該指紋圖譜反映了供試的每份種質(zhì)都有唯一的擴增譜帶，通過該圖譜可準(zhǔn)確、快速地將46份種質(zhì)區(qū)分并準(zhǔn)確鑒定出來。

圖5 供試披堿草屬材料指紋圖譜Fig.5 Fingerprinting of 46 Elymus genotypes

3 討論

3.1 披堿草屬種質(zhì)資源SCoT標(biāo)記的多態(tài)性分析

DNA分子標(biāo)記作為有效地檢測出種質(zhì)資源遺傳多樣性的一種工具，它能有效地結(jié)合表型和基因型進行鑒定，從而顯著提高育種效率［26］。目前使用較為廣泛的分子標(biāo)記有簡單重復(fù)序列（simple sequence report，SSR）、ISSR標(biāo)記、單核苷酸多態(tài)性標(biāo)記（single nucleotide polymorphism，SNP）、RAPD標(biāo)記、相關(guān)序列擴增多態(tài)性標(biāo)記（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）和SCoT標(biāo)記等。SCoT分子標(biāo)記是由基因內(nèi)的多態(tài)性衍生的標(biāo)記（gene-targeted markers，GTMs）［27］，與其他類型的DNA分子標(biāo)記相較，SCoT標(biāo)記具有設(shè)計簡單、操作便捷、成本低廉等特點，并能對目的性狀進行有效的跟蹤，有助于更好地揭示不同種質(zhì)資源的遺傳背景及種質(zhì)間的親緣關(guān)系［28］。

本研究中，SCoT分子標(biāo)記分析了46份披堿草屬種質(zhì)資源，結(jié)果表明，22個引物共擴增出290個條帶，其中多態(tài)性條帶254條，多態(tài)性條帶比率（PPB）值為87.59%，高于前人利用其他分子標(biāo)記對披堿草屬相關(guān)種質(zhì)進行遺傳多樣性評價的結(jié)果。例如，彭語洛等［29］、鄭經(jīng)紅等［30］、苗佳敏等［31］分別利用SSR、ISSR和SRAP分子標(biāo)記對垂穗披堿草種質(zhì)進行分析，得到的PPB值分別為79.75%、70.80%和85.86%。前人利用RAPD［32］、ISSR［33］和SRAP［34］標(biāo)記對老芒麥種質(zhì)進行分析，得到的PPB值分別為78.65%、77.20%和60.24%。Ma等［35］利用RAPD分子標(biāo)記93份披堿草屬種質(zhì)得到的PPB值為78.65%。這些結(jié)果都說明SCoT分子標(biāo)記在披堿草屬種質(zhì)上具有豐富的多態(tài)性，與其他分子標(biāo)記相比，SCoT分子標(biāo)記能夠在披堿草屬種質(zhì)檢測出較豐富的多態(tài)性位點，為披堿草屬種質(zhì)的初步鑒定、遺傳多樣性分析、DNA指紋圖譜構(gòu)建及基因克隆等研究奠定基礎(chǔ)。此外，隨著第三代分子標(biāo)記-SNP技術(shù)的快速發(fā)展，因其具有豐富的多態(tài)性，遺傳穩(wěn)定性較高、基因組中數(shù)目眾多等優(yōu)點，不僅廣泛應(yīng)用于重要作物中［例如水稻［36］、玉米（Zea mays）［37］及小 麥（Triticum aestivum）［38］等］，且 老 芒 麥［39］、四 倍 體 雜 交 冰 草（Agropyronspp.）［40］、鴨茅［41］等牧草也利用SNP標(biāo)記進行了遺傳學(xué)分析。隨著基因組學(xué)研究的發(fā)展，后續(xù)研究中可進一步基于披堿草屬種質(zhì)遺傳多樣性的基礎(chǔ)，將SNP分子標(biāo)記技術(shù)與其他生物技術(shù)相融合，從而加快傳統(tǒng)牧草育種技術(shù)的革新。

3.2 披堿草屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

遺傳多樣性包含了物種所攜帶的所有遺傳信息，是生物多樣性最重要的指標(biāo)之一［42］。遺傳多樣性的研究對于物種資源合理利用、遺傳改良、種質(zhì)創(chuàng)新及雜交育種親本選育均有重要的意義［28］。SCoT分子標(biāo)記作為一種能對目的性狀進行跟蹤的顯性標(biāo)記，對其的應(yīng)用可更好地揭示種質(zhì)資源的遺傳背景，更直觀地反映出不同種質(zhì)資源的親緣關(guān)系，為種質(zhì)資源的合理開發(fā)提供理論依據(jù)。

植物種質(zhì)遺傳多樣性與基因型［43］、地理環(huán)境［44］、取樣策略［45］均有一定的相關(guān)性。早期研究表明，多倍體物種的遺傳模式與二倍體物種相比較為復(fù)雜，所以多倍體物種的分子遺傳基礎(chǔ)研究進程較為緩慢［46］。披堿草屬種質(zhì)遺傳改良過程相對緩慢，這與披堿草屬種質(zhì)是異源多倍體、繁殖方式和基因隨機變異相關(guān)［47-48］。披堿草屬是禾本科小麥組重要的多年生屬，基因型包括異源六倍體和異源四倍體。Zhang等［49］比較了披堿草屬種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)差異性，表明披堿草屬植物種群內(nèi)具有較高的遺傳變異水平（大于80%）。本研究披堿草屬種質(zhì)分子遺傳多樣性結(jié)果顯示，披堿草屬內(nèi)不同物種（披堿草、垂穗披堿草和老芒麥）存在高度的遺傳多樣性，多態(tài)性達(dá)90.80%，這與國內(nèi)其他學(xué)者的研究結(jié)果基本一致［18］。本試驗的分析表明，披堿草屬3個種群內(nèi)遺傳多樣性（72.91%）大于種群間遺傳多樣性（27.09%），表明披堿草屬種群內(nèi)的遺傳變異占據(jù)優(yōu)勢。披堿草屬種質(zhì)因其自身的遺傳特性，同屬不同物種之間遺傳變異較大，從遺傳多樣性的角度看，已具有遺傳分化特性的種質(zhì)是進行種質(zhì)遺傳多樣性和種質(zhì)資源保護的關(guān)鍵，同時也是披堿草屬種質(zhì)資源利用和優(yōu)良性狀改良的依據(jù)，具有重要的利用價值。

有報道認(rèn)為不同的生態(tài)環(huán)境會導(dǎo)致披堿草屬種質(zhì)在長期的演化過程中逐步演化出不同的種群、變異種和生活型［50］。本研究的種質(zhì)資源采集于生態(tài)環(huán)境復(fù)雜的青海地區(qū)，錯綜復(fù)雜的地貌和多樣化天氣可能促使披堿草屬種質(zhì)具有更高的遺傳多樣性。因此，為了拓寬遺傳基礎(chǔ)的范圍，從復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境中收集和鑒定披堿草屬種質(zhì)是必要的。披堿草、垂穗披堿草和老芒麥作為異源多倍體物種，其基因組背景較為復(fù)雜，且各種質(zhì)的單株間遺傳豐富度較高［51］。取樣策略也是影響種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要因素之一。例如，柴旭田［52］發(fā)現(xiàn)每份箭筈豌豆（Vicia sativa）種質(zhì)取樣5個單株就可包含各種質(zhì)80%以上的遺傳變異；車永和等［53］發(fā)現(xiàn)當(dāng)取樣量在12個單株及以上時能夠反映冰草屬（Agropyron）整體的遺傳變異情況。在后續(xù)的研究中可設(shè)置不同的取樣梯度來獲取披堿草屬種質(zhì)的最適取樣策略，以期深入了解不同種質(zhì)材料的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。

3.3 披堿草屬種質(zhì)資源的遺傳差異性分析

種質(zhì)資源是牧草遺傳育種的物種基礎(chǔ)，其遺傳多樣性反映了該物種基因的豐富程度，只有了解其種質(zhì)間的遺傳差異，才能為選擇育種提供理論依據(jù)［54］。本研究的聚類結(jié)果顯示，46份披堿草屬種質(zhì)可分為2大類和4個亞類，兩個種質(zhì)資源間的遺傳相似系數(shù)在0.50～0.80，該結(jié)論與披堿草屬種質(zhì)遺傳多樣性的RAPD［35］、ISSR［55］、SRAP［56］分析結(jié)果大概一致，都表明披堿草屬種質(zhì)資源間遺傳多樣性較為豐富。因此，在進行披堿草屬新品種選育過程時，應(yīng)該挖掘和利用披堿草屬優(yōu)異種質(zhì)，拓寬披堿草屬種質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)，從而為披堿草屬優(yōu)良種質(zhì)的篩選提供理論依據(jù)。本研究結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)（gentic similarity，GS）為0.50處可將46份披堿草屬種質(zhì)分為兩大類。披堿草和垂穗披堿草聚為一類，老芒麥單獨聚為一類，因此，從整體上看，本研究聚類結(jié)果說明SCoT分子標(biāo)記可用于披堿草屬的遺傳多樣性分析。同時，聚類結(jié)果還顯示，披堿草和垂穗披堿草首先聚類，老芒麥雖然單獨聚為一類，但也表現(xiàn)了很近的遺傳關(guān)系。兩個披堿草屬種質(zhì)（編號：18和44）各自單獨聚為一組，其原因可能是SCoT標(biāo)記擴增產(chǎn)生偏向候選功能基因區(qū)的標(biāo)記，也可能是披堿草和老芒麥兩者遺傳背景的復(fù)雜性所致。部分披堿草屬種質(zhì)（編號：18和44）與其他種質(zhì)資源遺傳差異較大，在今后的工作中，可進一步對其形態(tài)特征、抗逆性及光合生理特性等方面進行深入的探究，以期將其用于與其他種質(zhì)進行遠(yuǎn)緣雜交。在今后開展披堿草屬優(yōu)質(zhì)牧草選育過程中，應(yīng)該充分挖掘和利用遺傳背景較寬的優(yōu)良種質(zhì)，提高披堿草屬種質(zhì)資源利用率及加快優(yōu)異性狀品種選育的步伐。

3.4 披堿草屬種質(zhì)資源指紋圖譜構(gòu)建

DNA指紋圖譜是一種新型的種質(zhì)鑒別技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比，它具有簡單快速、簡便、精確和不受時空條件限制等優(yōu)點，現(xiàn)今在許多種質(zhì)資源的研究中已經(jīng)相繼構(gòu)建了DNA指紋圖譜［57］。當(dāng)前構(gòu)建植物DNA指紋圖譜的主要方法有引物組合法、單引物法和特征譜帶法［13］。由于披堿草屬野生種質(zhì)資源遺傳背景較為復(fù)雜，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定難以準(zhǔn)確區(qū)分不同種質(zhì)之間的遺傳差異。本試驗利用4個遺傳多態(tài)性較高的SCoT引物組合構(gòu)建了46份披堿草屬種質(zhì)的DNA指紋圖譜，每份種質(zhì)都有其唯一的DNA指紋圖譜。當(dāng)前我國披堿草屬野生種質(zhì)的指紋圖譜構(gòu)建工作尚處于起步階段，為進一步加強披堿草屬的資源利用和創(chuàng)新，亟須盡快建立出披堿草屬種質(zhì)的DNA指紋圖譜，為披堿草屬種質(zhì)間的鑒別提供理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

46份披堿草屬種質(zhì)的遺傳多樣性水平較高，聚類分析與主成分分析結(jié)果基本一致，構(gòu)建的DNA指紋圖譜可準(zhǔn)確鑒別46份披堿草屬種質(zhì)，每份種質(zhì)均有唯一的DNA指紋圖譜。SCoT分子標(biāo)記適用于披堿草屬野生種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建，可在分子水平上對披堿草屬野生種質(zhì)資源評價、鑒定和新品種選育奠定基礎(chǔ)。