王慕華，麻杰，曹睿，彭曉光

（山西省生物研究院有限公司醫(yī)藥生物技術(shù)山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030006）

0 引言

人體腸道內(nèi)存在著數(shù)量龐大、種類繁多、功能復(fù)雜的微生物[1]，其細(xì)胞數(shù)量為人體細(xì)胞的10倍以上，大約有2 kg[2]。在門水平上主要以擬桿菌門、厚壁菌門和變形菌門為主，在屬水平上主要以擬桿菌屬、普氏菌屬、棲糞桿菌屬、羅氏菌屬、毛螺菌屬、薩特菌屬等為主[3-5]，參與著人體的多種代謝、免疫、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)等生理活動，從消化、營養(yǎng)吸收、能量供應(yīng)、脂肪代謝、抗病等多方面影響著宿主的生理功能[6]。在正常狀態(tài)下，腸道菌群之間相互制約、相互協(xié)調(diào)，共同維持著復(fù)雜而穩(wěn)定的腸道微生物生態(tài)平衡；一旦這種平衡被打破，腸道菌群失調(diào)，益生菌數(shù)量減少，致病菌數(shù)量增加，各種與腸道菌群相關(guān)的疾病也便隨之而來[7-9]。腹瀉作為一種常見的腸道疾病，主要臨床表現(xiàn)為排便量的增加，癥狀起因有許多種，多伴有腸道菌群的改變。一方面，腸道菌群的失調(diào)導(dǎo)致致病菌數(shù)量增加，致病菌通過侵襲力及毒素破壞正常的腸黏膜屏障，使得腸黏膜通透性增加[10]；另一方面，腸道菌群失調(diào)會使得炎癥因子的表達(dá)及釋放增加，腸道正常免疫平衡被打破，異常免疫反應(yīng)被激活，從而導(dǎo)致腸道黏膜、組織損傷[11-12]。益生菌作為一種活菌微生態(tài)制劑，在維護(hù)腸道微生態(tài)平衡方面，起著不可忽視的作用[13]，一方面，益生菌通過黏附于小腸黏膜上皮細(xì)胞形成菌膜，同時促進(jìn)腸上皮細(xì)胞分泌β防御素，構(gòu)成一道腸道屏障，增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞的自我保護(hù)及對受損的腸道屏障進(jìn)行修復(fù)；另一方面，益生菌在腸道微環(huán)境中進(jìn)行代謝活動，合成有益代謝物以及促進(jìn)一些細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而抑制有害病原菌的生長繁殖[14-16]。本研究以腹瀉人群為研究對象，在特定益生菌制劑的干預(yù)下，通過對腹瀉患者糞便DNA提取，16S rDNA高通量測序，以及對腹瀉患者的問卷調(diào)查，研究腹瀉患者腸道菌群的變化和益生菌對腹瀉癥狀的改善作用，為闡述腹瀉與腸道菌群的關(guān)系提供科學(xué)數(shù)據(jù)，也為通過益生菌制劑以腸道菌群為靶點(diǎn)來調(diào)整、治療腹瀉提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 研究對象

健康人群為200例在體檢中心進(jìn)行一般體檢的志愿者，其中男性105人，女性95人。所有志愿者要求身體健康，BMI指數(shù)為18.5～23.9，年齡在20～60周歲，通過問卷調(diào)查及體檢信息確認(rèn)無任何精神類疾病和肢體缺陷，并排除所有腹瀉、腸炎、克羅恩病等腸道疾病，嚴(yán)重的傳染病，免疫缺陷疾病以及心、肝、腎等主要臟器疾病，且近1個月內(nèi)沒有藥物、抗生素、益生菌使用史，近1年內(nèi)沒有參與減肥項(xiàng)目、服用減肥藥或做過減肥手術(shù)。

腹瀉患者為長期慢性腹瀉，有腹痛和消化不良的癥狀，大便不成形、有時會有黏液便或水樣便。采樣時有腹瀉癥狀，近一個月沒有服用任何藥物治療的人群。納入研究的共20人，其中男性10人、女性10人，年齡40～60周歲，沒有任何精神類疾病和肢體缺陷，并排除所有嚴(yán)重的傳染病，免疫缺陷疾病以及心、肝、腎等主要臟器疾病。

1.2 實(shí)驗(yàn)益生菌

復(fù)合益生菌（固體飲料 活菌型），含乳雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌、副干酪乳桿菌，活菌量為5×1012CFU/2 g，山西維爾生物乳制品有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

納入研究對象的人群自行采集無污染的新鮮糞便于糞便DNA樣本保存管內(nèi)，搖勻后可常溫保存7 d，之后保存于-80℃冰箱，樣本采集完成后一并提取樣本DNA。

1.3.2 腸道菌群分析

腸道菌群分析采用16S rRNA基因高通量測序。具體方法為：提取樣本DNA后，對合格的糞便DNA樣本16S rRNA基因V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增、文庫制備、文庫質(zhì)檢、定量，使用設(shè)定的TAG序列進(jìn)行樣本區(qū)分。采用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺對檢測合格的文庫進(jìn)行測序。數(shù)據(jù)分析基于優(yōu)化序列在97%的相似性下，利用QIIME[2]軟件包中的Uclust方法進(jìn)行OTU聚類分析，基于Silva參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類學(xué)（Taxonomy）注釋。

1.3.3 益生菌干預(yù)

腹瀉患者于每日晚飯后半小時服用復(fù)合益生菌加強(qiáng)A類I型，每日1次，每次2 g，連續(xù)服用30 d。取樣時間為服用益生菌前1日和益生菌服用完成后的第2日。

1.3.4 腹瀉的判斷

每日排便3次或以上，且糞便性狀異常，如稀便、水樣便。大便性狀判斷采用布里斯托大便分類法（Bristol Stool Scale）：1型：一顆顆硬球，很難通過（評分1分）；2型：香腸狀，但表面凹凸（評分2分）；3型：香腸狀，但表面有裂痕（評分3分）；4型：像香腸或蛇一樣，且表面很光滑（評分4分）；5型：斷邊光滑的柔軟塊狀，容易通過（評分5分）；6型：粗邊蓬松塊，糊狀大便（評分6分）；7型：水狀，無固體塊，完全液體（評分7分）。第1型和第2型表示有便秘；第3型和第4型是理想的便形，尤其第4型是最容易排便的形狀；第5至第7型則代表可能有腹瀉。

2 結(jié)果與討論

2.1 腹瀉患者腸道菌群分類

經(jīng)過16S DNA V3～V4區(qū)測序、物種注釋，20位腹瀉患者的腸道菌群在門水平上大致可分為三類，第一類腹瀉患者人群的腸道菌群多樣性嚴(yán)重降低，變形桿菌占到腸道微生物總量的97%以上，為細(xì)菌感染性腹瀉，分組命名為腹瀉1，入組人數(shù)為10人；第二類腹瀉患者人群的腸道菌群多樣性變化不大，和健康人相比，厚壁菌豐度降低，梭桿菌豐度升高，分組命名為腹瀉2，入組人數(shù)為6人；第三類腹瀉患者人群的腸道菌群沒有明顯特征，互相都不類似，入組人數(shù)為4人，不作為研究對象。具體腸道菌群分布見圖1，后續(xù)以腹瀉1患者人群為研究對象進(jìn)行益生菌干預(yù)研究。

圖1 不同人群腸道菌群在門水平上的相對豐度

2.2 腹瀉1患者人群的腸道菌群特點(diǎn)及益生菌的調(diào)節(jié)作用

2.2.1 腹瀉1患者人群的腸道微生物多樣性

在OUT水平上，健康人群的平均OUT數(shù)為393，腹瀉1患者人群的平均OUT數(shù)為146，益生菌調(diào)節(jié)后腹瀉1患者人群的平均OUT數(shù)為380，說明腹瀉1患者人群的腸道微生物多樣性明顯低于健康人群，服用益生菌后腸道微生物多樣性得到了改善。

2.2.2 腹瀉1患者人群腸道菌群在門水平的主要變化

對腹瀉1患者人群的腸道菌群與健康人群進(jìn)行了比較，并研究了益生菌對腹瀉1患者人群腸道菌群的調(diào)節(jié)作用，各不同人群以及腹瀉1患者人群益生菌干預(yù)后的主要腸道菌在門水平上的相對豐度情況見表1、圖2。

圖2 不同樣本腸道菌群在門水平上的分布

表1 不同樣本主要腸道菌群在門水平上的相對豐度%

從表1及圖2可見，健康人群腸道菌群在門水平上主要為厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門，所占豐度分別為47.16%、37.81%和10.02%，而腹瀉1患者人群的腸道菌群在門水平上幾乎全部變?yōu)樽冃尉T，占到腸道微生物總量的97.84%，擬桿菌門和厚壁菌門分別為1.47%和0.50%；其它在健康人群腸道菌群中豐度較高的放線菌門、疣微菌門在腹瀉1患者人群中豐度降低，藍(lán)藻菌門、梭桿菌門、黏膠球形菌門、Saccharibacteria、柔膜菌門在腹瀉1患者人群的腸道菌群中沒有出現(xiàn)。腹瀉1患者人群的腸道菌群在益生菌干預(yù)后，變形菌門大幅降低，變?yōu)?2.01%；厚壁菌門與健康人群基本相同，達(dá)到47.71%，擬桿菌門增加到12.89%；放線菌門與健康人群基本相同，疣微菌門超過健康人群，目前認(rèn)為疣微菌門中的AKK菌是腸道中的一種有益菌。

2.2.3 腹瀉1患者人群腸道菌群在屬水平的主要變化

腹瀉1患者人群的腸道菌群在屬水平上與健康人群的比較以及益生菌對腹瀉1患者人群腸道菌群的調(diào)節(jié)作用見表2、圖3。

表2 不同樣本主要腸道菌群在屬水平上的相對豐度%

圖3 不同樣本腸道菌群在門水平上的分布

從表2及圖3所示，健康人群腸道核心菌群中占主要地位的擬桿菌屬、普氏菌屬、糞桿菌屬、毛螺菌屬，在腹瀉1患者人群腸道中大幅降低；健康人群腸道菌群中的小桿菌屬、薩特氏菌屬、副薩特氏菌屬、巨單胞菌、Rikenellaceae-Alistipes在腹瀉1患者人群腸道中消失，腹瀉1患者人群的微生物多樣性降低；致病菌志賀氏桿菌和克雷伯氏桿菌屬占到了腹瀉1患者人群腸道微生物總菌數(shù)的86.63%，這兩種菌是引起腹瀉的主要原因。益生菌干預(yù)后腹瀉1患者人群的腸道菌群中擬桿菌屬、普氏菌屬、糞桿菌屬、毛螺菌屬的相對豐度都有回升，糞桿菌屬、毛螺菌屬基本達(dá)到健康人群標(biāo)準(zhǔn)；一些益生菌干預(yù)前消失的微生物都有不同程度的回升，微生物多樣性增加；致病菌志賀氏桿菌降低，達(dá)到了健康人群的水平，克雷伯氏桿菌屬有降低，但仍大大高于健康人水平；通過益生菌干預(yù)，對人體有益的羅斯氏菌屬、Verrucomicrobiaceae-Akkermansia相對分度大于健康人平均水平。

2.2.4 主要變化菌群分析

分析腹瀉1患者人群的腸道菌群與健康人群的差異，并比較益生菌干預(yù)前后腹瀉1患者腸道菌群的變化，以及恢復(fù)后是否達(dá)到了健康人群腸道菌群核心菌的豐度和微生物多樣性，具體差異情況見圖4。

圖4 腸道菌群差異分析

從圖4可以更清晰的看到，健康人群以擬桿菌屬、糞桿菌屬、普氏菌屬、毛螺菌屬、Lachnoclostridium、雙歧桿菌屬、副薩特氏菌屬等作為主要腸道核心菌屬，腹瀉1患者人群腸道菌群被破壞，主要以志賀氏桿菌、克雷伯氏桿菌屬為主，益生菌干預(yù)后腹瀉1患者人群腸道微生物多樣性增加，基本達(dá)到健康人群水平。

2.3 益生菌對腹瀉1患者腹瀉癥狀的改善作用

2.3.1 每日大便頻次

對所有腹瀉1患者在益生菌干預(yù)的過程中，每周進(jìn)行日大便次數(shù)的統(tǒng)計(jì)，取每周的日平均大便次數(shù)作圖，益生菌干預(yù)的4周內(nèi)，腹瀉1患者人群的大便頻次情況見圖5。

圖5 益生菌干預(yù)過程中患者大便頻次的變化

從圖5所示，腹瀉1患者的平均日大便次數(shù)在益生菌干預(yù)前可達(dá)4.8次/日，益生菌干預(yù)1周后為2.6次/日，益生菌干預(yù)2周后為1.4次/日，益生菌干預(yù)3周后為0.9次/日，益生菌干預(yù)4周后為1次/日。益生菌干預(yù)后，所有腹瀉1患者的大便次數(shù)基本恢復(fù)到正常水平。

2.3.2 糞便性狀評分

對所有腹瀉1患者在益生菌干預(yù)的過程中，每周進(jìn)行大便性狀評分的統(tǒng)計(jì)，取每周的日平均糞便性狀評分作圖，益生菌干預(yù)的4周內(nèi)，腹瀉1患者人群的糞便性狀評分情況見圖6。

圖6 益生菌干預(yù)過程中患者糞便性狀的變化

從圖6所示，腹瀉1患者的平均糞便性狀評分在益生菌干預(yù)前可達(dá)6.3，具有明顯腹瀉癥狀；服用益生菌1周后，平均糞便性狀評分為5.2，仍有腹瀉癥狀，但癥狀減輕；服用2周后，平均糞便性狀評分為4.5，基本達(dá)到正常水平；服用3周后平均糞便性狀評分為3.9，服用4周后平均糞便性狀評分為4.0，達(dá)到理想的便形。

2.3.3 自我療效評判

對服用益生菌后腸道菌群和腹瀉癥狀都明顯改善的10名腹瀉1患者進(jìn)行自我療效感覺、腹痛、精神狀態(tài)方面的隨訪，患者自我感覺情況見表3。

表3 腹瀉1患者服用益生菌后的自我療效評判

從表3中可見，服用益生菌對所有腹瀉1型患者都有明顯的療效，由腹瀉引起的腹痛減輕和消除，精神狀態(tài)變好。

3 結(jié)論

腹瀉的原因較多，腸道菌群的改變也不相同，對變形菌增加的這類細(xì)菌感染引起的腹瀉患者來講，腸道菌群變化是引起腹瀉的主要原因；益生菌對這類患者的腸道菌群有很好的調(diào)節(jié)作用，可以幫助患者增加腸道微生物多樣性，降低致病菌豐度，從而改善、消除腹瀉癥狀；服用益生菌并不是提高腸道中所服用的菌株的豐度，而是通過調(diào)節(jié)腸道菌群，使患者恢復(fù)正常的腸道微生態(tài)結(jié)構(gòu)，從而恢復(fù)正常的生理機(jī)能；要想系統(tǒng)地闡明腹瀉與腸道菌群的關(guān)系以及益生菌的干預(yù)作用，應(yīng)該加大樣本量，分類干預(yù)，使研究結(jié)果更具有代表性，但對細(xì)菌感染引起的腹瀉，本研究能夠說明一定的問題，對腸道菌群與腹瀉關(guān)系的研究有一定的借鑒作用，也可為細(xì)菌感染的腹瀉患者減少抗生素的使用，通過益生菌調(diào)節(jié)腸道菌群，恢復(fù)健康提供依據(jù)。