蔣日月，鄧 傾，周 青

武漢大學人民醫(yī)院超聲影像科，湖北 武漢 430060

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是一種嚴重的心血管疾病，雖然通過介入治療、藥物溶栓或冠脈搭橋等治療手段重建血運可以挽救瀕死心肌，但《柳葉刀》發(fā)布的《1990—2017年中國及其各省的死亡率、發(fā)病率和危險因素》報告顯示缺血性心臟病為中國人目前的第二大死亡原因，90%由冠狀動脈狹窄和梗塞誘發(fā)［1］。AMI 發(fā)病2 h 內(nèi)是黃金救治時間；發(fā)病后6 h 內(nèi)進行血管開通最佳；發(fā)病后12 h為再灌注治療時間窗。而對于超過治療時間窗的患者，目前臨床治療效果欠佳。

1 間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）治療MI

1.1 MSC治療MI的主要機制

MSC治療MI的機制復雜，研究認為干細胞可通過分化為心肌細胞發(fā)揮修復作用［2］，然而梗死區(qū)域微環(huán)境惡劣，移植干細胞難以存活，與明顯改善的心功能不相匹配，目前研究認為修復梗死心肌主要是通過旁分泌實現(xiàn)的。MSC 以細胞外囊泡的方式分泌生長因子、細胞因子、趨化因子及外泌體等并作用于鄰近的細胞，通過促血管生成、抗凋亡、抑制炎癥反應(yīng)、改善微環(huán)境，促進損傷修復［3］。

1.2 MSC治療MI的療效

Mazo等［4］通過心內(nèi)膜注射移植脂肪間充質(zhì)干細胞（adipose-derived stem cell，ADSC）來治療MI 豬心肌缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，I/R），發(fā)現(xiàn)3 個月后其心肌內(nèi)血管密度增加，心室重構(gòu)減輕。Gautam 等［5］研究發(fā)現(xiàn)，通過向梗死心肌組織內(nèi)注射ADSC 治療大鼠MI，可有效改善其心肌收縮功能，并減少繼發(fā)性室性心律失常的發(fā)生率。目前已有大量臨床研究證實干細胞移植能促進受損心肌修復。干細胞移植治療MI 的第1 個重要的臨床隨機試驗BOOST 研究共入組60 例ST 段抬高型MI 患者，這些患者在經(jīng)皮冠狀動脈介入后，隨機分為治療后最優(yōu)藥物治療組（對照組）和最優(yōu)藥物治療加術(shù)后平均4.8 d冠狀動脈內(nèi)移植自體骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow stromal cell，BMSC）（BMSC組）［6］。6 個月后隨訪BMSC 組左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）提高6.7%，而對照組僅提高0.7%。BMSC移植也未增加支架內(nèi)再狹窄發(fā)生率和心律失常發(fā)生率。REPAIR試驗是1項隨機、對照、雙盲、多中心研究，發(fā)現(xiàn)移植BMSC 后LVEF 平均升高5.5%，LVEF可達54%，且心臟擴大程度更小，提示心臟重構(gòu)減輕［7］。該研究還發(fā)現(xiàn)BMSC 移植明顯提高MI區(qū)動脈的血流儲備，提示可能通過生成新生血管來修復損傷區(qū)心肌。亞組分析發(fā)現(xiàn)大面積MI患者在MI后4個月就可以發(fā)現(xiàn)明顯獲益。1項Meta分析研究表明，經(jīng)過移植BMSC治療，基礎(chǔ)LVEF低于42%的MI患者，其LVEF在2年后增加了5.09%，說明MSC治療能改善MI患者的遠期左室收縮功能［8］。

1.3 干細胞治療MI在臨床應(yīng)用中受限

近年來，干細胞移植給MI的治療帶來了新的希望。然而Assis 等［9］發(fā)現(xiàn)經(jīng)靜脈注射的干細胞約70%分布在肺部，其余主要分布在腎臟、脾臟和膀胱，只有很少量干細胞能到達梗死區(qū)域，過量注射干細胞可能發(fā)生靜脈栓塞。經(jīng)冠脈注射干細胞若操作不當也可能引起微循環(huán)堵塞而加重MI 癥狀。此外干細胞療法還存在法律和倫理問題，諸多因素使其在臨床中的應(yīng)用受到很大限制［10］。

2 外泌體治療MI

2.1 外泌體的特征

外泌體是由真核細胞分泌至細胞外的直徑30～150 nm具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)的微小囊泡，表面具有特異性標志，可攜帶母體細胞的小分子蛋白質(zhì)、DNA、mRNA、microRNA 和非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）等，發(fā)揮細胞間信號傳導的生物學作用［11-13］。外泌體的雙層膜結(jié)構(gòu)不但能阻止其內(nèi)含物被酶消化或化學分解，與其他常見的基因載體如質(zhì)粒、病毒和脂質(zhì)體等相比，還具有高攜載率、低免疫原性、無細胞毒性及能夠穿透生物屏障等優(yōu)點［14］。大量研究表明外泌體在心血管疾病的旁分泌信號傳導中發(fā)揮重要作用，其可參與介導血管平滑肌細胞之間［15］、血管平滑肌和內(nèi)皮細胞之間［16］、心肌細胞和心肌成纖維細胞之間［17］的信號交流，正是由于該特性，越來越多的研究將其作為天然的納米載體來治療疾病。

2.2 外泌體治療MI的機制

近年來已有大量研究報道了用干細胞來源的外泌體治療MI 和I/R。2010 年Lai 等［18］首次報道了人類胚胎干細胞分化成的MSC來源的外泌體（MSCderived exosome，MSC-exo）可以有效減輕MI 小鼠的心肌I/R；后續(xù)報道進一步證實，MSC-exo 能減少45%心梗面積，且在治療后28 d 仍可有效抑制心室負性重構(gòu)，推測該作用與外泌體減少組織氧化應(yīng)激有關(guān)［19］。該團隊的研究表明外泌體不僅在急性期有治療作用，還能改善MI后的長期預后。研究顯示［20］，將人類誘導的多能干細胞分化而來的心肌細胞、平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞接種于纖維蛋白基質(zhì)形成心肌補片，再將心肌補片移植至MI 豬的心臟，4 周后評價療效，發(fā)現(xiàn)由“補片”釋放的外泌體能減小梗死面積，降低心臟壁壓力，減輕心肌肥大，提高左室收縮功能，促進心肌細胞存活。研究表明，間充質(zhì)干細胞來源外泌體可以通過多種途徑促進受損心肌修復。

2.2.1 抑制心肌細胞凋亡

研究表明MSC 釋放富含miR-22 和miR-221 的外泌體，被缺血心肌細胞內(nèi)吞后，可分別抑制心肌細胞內(nèi)的甲基化CpG結(jié)合蛋白2及p53，上調(diào)凋亡調(diào)控因子，減輕缺血心肌損傷及凋亡［21-22］。過表達GATA4 的MSC-exo 通過上調(diào)miRNA-199a 激活Akt及Erk信號通路起到心肌細胞保護作用［19］。ADSC來源外泌體（ADSC-derived exosome，ADSC-exo）攜帶的miR-320d可以通過靶向STAT3來減少細胞凋亡并提高細胞活力來保護心肌細胞［23］。人臍帶間充質(zhì)干細胞來源外泌體（human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosome，hucMSC-exo）能通過miR-19a下調(diào)PTEN和BIM表達，激活AKT和ERK信號通路，同時通過靶向SRY-box轉(zhuǎn)錄因子-6（SRY-box transcription factor 6，SOX-6）抑制JNK/caspase-3 激活，抑制MI大鼠受損心肌細胞凋亡［24］。BMSC來源外泌體（BMSCderived exosome，BMSC-exo）攜帶的miR-486-5p、miR-21、miR-144 通過抑制PTEN 表達，激活PI3K/AKT 信號通路，進而抑制受損心肌細胞的凋亡［25-27］。MSC-exo可以通過AMPK/mTOR和Akt/mTOR通路誘導心肌細胞自噬來減少缺氧心肌細胞凋亡，I/R模型大鼠體內(nèi)注射MSC-exo可上調(diào)心肌LC3B 表達，明顯減少細胞凋亡和心肌梗死面積，改善心臟功能［28］。人間充質(zhì)干細胞（human mesenchymal stem cell，hMSC）分泌的外泌體中，lncRNA KLF3-AS1 可通過抑制Sirt1 來抑制MI 大鼠受損心肌凋亡并減緩MI 進展［29］。MSC-exo攜帶的miR-25-3p可通過下調(diào)FASL、PTEN、EZH2 和H3K27me3，上 調(diào) 心臟保護基 因eNOS 和抗炎基因SOCS3，減少小鼠MI 受損心肌凋亡［30］。MI大鼠心肌內(nèi)注射過表達miR-210的MSC-exo可以通過下調(diào)凋亡誘導因子3（apoptosis inducing factor 3，AIFM3），減少受損心肌細胞凋亡［31］。心肌細胞H9C2 與過表達miR-338 的外泌體共培養(yǎng)，能明顯下調(diào)Bax、caspase3 和凋亡率，上調(diào)Bcl-2，心肌內(nèi)注射過表達miR-338 的外泌體可以通過靶向MAP3K2 調(diào)節(jié)JNK，減少MI 大鼠受損細胞凋亡［32］。

2.2.2 調(diào)節(jié)免疫細胞和炎癥水平

MSC-exo 通過miR-182，抑制其下游靶點Toll樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4），可促進I/R 受損組織中的M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉(zhuǎn)化，促進巨噬細胞由促炎型向抑炎型轉(zhuǎn)化，降低I/R 心臟炎癥水平，減少心肌細胞損傷［33］。ADSC-exo 通過miR-126，抑制NF-κB 和轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1表達，促進梗死心肌組織的M1型巨噬細胞向M2 型巨噬細胞轉(zhuǎn)化，降低炎癥細胞因子的表達和心臟纖維化［34-35］。BMSC-exo 可通過miR-25-3p 抑制炎癥細胞因子白細胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6 和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α及促凋亡蛋白如FASL 和PTEN，減輕MI 心肌損傷［30］。脂多糖預處理的BMSC 分泌的外泌體能抑制脂多糖依賴性NF-κB 信號通路并部分激活AKT1/AKT2 信號通路，增加M2 型巨噬細胞極化并降低M1 型巨噬細胞極化，減輕小鼠MI 后梗死區(qū)域炎癥和心肌細胞凋亡［36］。ADSC-exo 通過激活S1P/SK1/S1PR1信號轉(zhuǎn)導，促進巨噬細胞向M2型極化，抑制NF-κB和TGF-β1表達，抑制炎癥反應(yīng)并減輕心肌纖維化來改善MI 后的心臟損傷［35］。低溫預處理的ADSC-exo 可進一步下調(diào)MI 大鼠炎癥因子IL-1β/TNF-α/NF-κB/MMP-9，上調(diào)抑炎因子IL-10，減輕梗死后炎癥反應(yīng)；激活PI3K/Akt/GSK3β 和pm-TOR，抑制氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白（NOX-1/NOX-2/NOX-4/氧化蛋白）、凋亡/線粒體損傷相關(guān)蛋白（線粒體-Bax/caspase 3/PARP/p53/cytosolic-cytochrome-C），減輕氧化應(yīng)激損傷［37］。

2.2.3 促進內(nèi)皮細胞增殖、遷移及血管新生

MI后心肌細胞發(fā)生凋亡，心臟組織處于修復狀態(tài)，梗死區(qū)的新生血管形成尤為重要。血小板分泌的生長因子能夠誘導ADSC分泌富含促血管生成的外泌體，促進血管再生［38］。Bian等［39］發(fā)現(xiàn)在急性MI小鼠模型心肌中注射MSC-exo 可顯著促進血管新生。阿托伐他汀預處理的MSC-exo可以通過lncRNA H19上調(diào)促血管內(nèi)皮生長因子和細胞間黏附分子-1，促進血管新生［40］。ADSC-exo通過miRNA-31上調(diào)缺氧誘導因子-1α，促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞遷移及管腔形成［41］。心臟祖/干細胞源外泌體可促進內(nèi)皮細胞遷移，并且通過上調(diào)miRNA-132 及miRNA-146a促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞管腔形成［42］。miRNA-132 與TGF-β協(xié)同作用抑制p120Ras GAP表達，活化Ras通路，導致內(nèi)皮細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換［43］；另外miRNA-146a還能通過抑制CARD10進而激活NF-κB信號通路［44］。除了miRNA-132及miRNA-146a參與內(nèi)皮細胞遷移及血管形成進程外，miRNA-320、miRNA-143等亦參與其中［45］。

2.2.4 減輕心臟重構(gòu)

研究發(fā)現(xiàn)小鼠缺血再灌注模型中，MSCs-exo 能激活PI3K/Akt 通路，減少心肌細胞凋亡，減弱氧化應(yīng)激，增加ATP 以及NADH 修復心肌能量，繼而促進心肌細胞存活，抑制心肌重構(gòu)［19］。心肌內(nèi)注射hucMSC-exo 能明顯減少MI 大鼠心肌纖維化，改善心臟收縮功能［46］。ADSC-exo攜帶的miR-146通過下調(diào)早期生長反應(yīng)因子-1抑制MI后的心肌纖維化［47］。外泌體攜帶的miR-29b和miR-455可下調(diào)MMP-9的表達，從而降低心肌纖維化程度［48］。BMSC-exo攜帶的miR-19a/19b能明顯抑制心肌細胞的凋亡，且Exo/miR-19a/19b和MSC移植的組合增強了MI 模型中心臟功能的恢復并減少了心臟纖維化［49］。BMSC-exo攜帶的miR-185 可通過抑制SOCS2 減少MI 小鼠的心室重塑，改善心臟功能［50］。MSC-Exo 能促進心肌細胞H9C2增殖，抑制H2O2誘導的細胞凋亡，并抑制TGF-β 誘導的成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，減輕心臟纖維化［51］。

3 新型外泌體及外泌體載體

外泌體靜脈注射進入體內(nèi)后會迅速聚積在肝臟、脾臟、腎臟等器官中并迅速被膽管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)排除體外或被網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞吞噬，在心臟組織中含量極低［52］，因此延長外泌體在心肌組織的滯留時間、增加其靶向特異性是提高其療效的必然要求［53］。目前的研究主要集中在構(gòu)建工程化外泌體和研發(fā)新型外泌體載體。

3.1 靶向心臟的工程外泌體

3.1.1 用肽/蛋白質(zhì)對外泌體膜進行化學修飾

科學家們通過噬菌體展示技術(shù)以及體內(nèi)淘選技術(shù)研發(fā)出可以特異性結(jié)合到心血管系統(tǒng)的歸巢肽。Kanki 等［54］通過該技術(shù)發(fā)現(xiàn)多肽序列CSTSMLKAC可以靶向缺血心肌組織。Vandergriff 等［55］通過DOPE-NHS 與CHP 反應(yīng)，使DOPE-CHP 的親脂性尾部插入外泌體膜中，從而使外泌體膜攜帶CSTSMLKAC 肽。體外研究表明，使用CHP 肽外泌體可以增加外泌體攝取，提高細胞活力，減少細胞凋亡。通過I/R 大鼠模型，證實該技術(shù)可以有效改善心臟功能，減少梗死面積，促進細胞增殖和血管生成。研究表明，給MI小鼠靜脈注射攜帶缺血心肌靶向肽的缺氧條件下衍生的BMSC-exo，能靶向心臟缺血病變部位，通過抑制心肌細胞凋亡促進受損心肌修復［56］。

3.1.2 通過基因或化學修飾使外泌體分泌細胞表達肽/蛋白質(zhì)

Wang 等［57］采用分子克隆技術(shù)，將CSTSMLKAC肽插入到外泌體表面普遍富集的跨膜蛋白Lamp2b基因序列上，通過慢病毒包裝技術(shù)，使BMSC高表達CSTSMLKAC 肽和Lamp2b。體外實驗結(jié)果表明，該技術(shù)可以使缺氧損傷的H9C2細胞外泌體攝取明顯增加。在小鼠MI 模型中，與空白外泌體相比，缺血區(qū)CSTSMLKAC 肽外泌體明顯增多。同時，該外泌體治療可減輕缺血心肌的炎癥和細胞凋亡，減少纖維化，促進血管生成，改善心功能。

Wang 等［58］將靶向心肌肌鈣蛋白I 的STSMLKA肽融合到Lamp2b 的N 端并通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使其在BMSC中高表達，收集高表達STSMLKA肽的外泌體，再通過電穿孔技術(shù)將下調(diào)細胞增殖抑制基因表達的hsa-miR-590-3p 加載到修飾后的外泌體，通過靜脈注射的方式，該工程化外泌體能聚集在MI大鼠梗死區(qū)域，增強了梗死周圍區(qū)域的心肌細胞增殖并改善心臟功能。

3.2 外泌體載體

外泌體的理想載體材料應(yīng)具有以下特點：①在目標部位有效保留外泌體并保持其結(jié)構(gòu)完整性；②將外泌體釋放到基質(zhì)中，發(fā)揮其生物學功能；③與目標部位緊密貼合，促進外泌體被周圍細胞吞噬。構(gòu)建外泌體載體的常用方法如下。

3.2.1 磁性納米顆粒

有研究團隊共同構(gòu)建納米顆粒，該顆粒由Fe3O4核和二氧化硅外殼組成，外殼上修飾聚乙二醇，通過腙鍵與抗CD63 和抗肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）結(jié)合，雙抗體通過與外泌體表面的CD63抗原結(jié)合捕獲外泌體，再與受損心肌細胞上的MLC表面標志物結(jié)合，在受損心肌組織酸性pH環(huán)境中，腙鍵發(fā)生斷裂導致捕獲的外泌體局部釋放［59］。在兔和大鼠MI 模型中，磁引導下捕捉到的表達CD63的外泌體積聚在梗死組織中，使梗死面積減小，LVEF 和血管生成得到改善。該研究首次提出通過操縱內(nèi)源性外泌體生物學分布，建立了外泌體治療MI的新方法。

3.2.2 功能性多肽水凝膠

有研究利用肽兩親物PA 和NapFF 自組裝肽水凝膠，將心臟保護肽（GHRPS）和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2 可降解序列Gly-Thr-Ala-Gly-Leu-Ile-Gly-Gln（GTAGLIGQ）加入水凝膠中制備出PGN水凝膠，再用PGN水凝膠包封外泌體［60］。其中GHRPS屬于生長激素釋放肽的成員，可以激活促存活途徑并抑制炎癥和纖維化，而MMP-2可降解序列能夠使水凝膠降解，確保包封的外泌體和GHRPS 肽釋放到周圍組織中。研究結(jié)果證實外泌體-PGN 水凝膠能夠有效包封外泌體并確保外泌體的穩(wěn)定性和持續(xù)釋放，將外泌體-PGN水凝膠注入大鼠心臟的梗死邊界區(qū)，治療后21 d仍能在缺血心臟組織中檢測到PKH-26標記的外泌體。

有研究團隊采用微創(chuàng)的方式，通過經(jīng)皮心包膜內(nèi)導管在MI 小鼠心包腔內(nèi)噴涂含MSC-exo 的血小板纖維蛋白凝膠，明顯改善了心臟功能并減少了纖維化，并促進了內(nèi)源性血管生成［61-62］。該團隊還在豬MI 模型中比較了外泌體凝膠開胸遞送方法與胸腔鏡引導的微創(chuàng)外泌體凝膠注射方法，血常規(guī)報告顯示開胸手術(shù)組的中性粒細胞和白細胞計數(shù)高于微創(chuàng)組，炎癥反應(yīng)較重。該微創(chuàng)凝膠注射技術(shù)減少了創(chuàng)傷性手術(shù)的不利影響，更有利于臨床轉(zhuǎn)化［62］。

4 小結(jié)與展望

綜上所述，MSC 主要通過旁分泌作用抑制細胞凋亡、抑制心肌纖維化、促進血管生成、抑制免疫反應(yīng)來修復心肌損傷。外泌體是低免疫原性、無毒、高度穩(wěn)定的天然納米載體，目前已有多種靶向心臟的工程外泌體及新型外泌體載體在動物MI模型中取得很好療效。然而外泌體進入MI臨床研究仍存在諸多困難，如目前通過超速離心法提取外泌體耗時長效率低，諸多研究中外泌體仍通過有創(chuàng)方式進入體內(nèi)且在心臟停留時間較短。MSC-exo用于治療MI，機遇與挑戰(zhàn)并存，困難與希望同在，亟待進一步研究改進。