敖清瑩

（六盤水職業(yè)技術學院，貴州六盤水 553000）

非洲豬瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)引起家豬和不同種類野豬的一種病毒性、急性出血熱。自1921年肯尼亞首次報道非洲豬瘟后，迅速擴散至全球許多地區(qū)，如俄羅斯、高加索、東歐、加勒比和南美等地區(qū)。2018年我國遼寧沈陽首次發(fā)現該病，在之后的1年時間里，我國報告了160余起ASF疫情，共撲殺生豬119.3萬頭，養(yǎng)豬業(yè)經濟損失超過3億美元，對養(yǎng)殖業(yè)和食品安全行業(yè)造成了極大的威脅[1]。

1 非洲豬瘟的流行病學

1910年，Montgomery等[2]在肯尼亞發(fā)現1起野豬(主要是疣豬)不明原因死亡的疫情，經過對病死豬的檢測分析，于1921年報道此疫情是由ASFV引起，幾年后，在南非進行的研究證實了這一發(fā)現，并證明了疣豬是非洲豬瘟病毒的宿主。此外，有人提出，軟蜱作為一個長期的宿主可以終身攜帶病毒，無需反復接觸病毒攜帶者。這不僅解釋了病毒從野豬向家豬傳播的機制，而且也解釋了該病為何突然在此前被宣布無病的地區(qū)出現。此后ASF疫情持續(xù)在非洲大陸傳播，主要集中在撒哈拉以南的非洲國家。

1957年，在西歐和拉美國家發(fā)現ASFV，且ASF第1次在非洲大陸以外的地區(qū)發(fā)生，經過流行病學調查發(fā)現此次疫情傳播是由于養(yǎng)殖人員使用從安哥拉飛往里斯本航班產生的泔水飼喂豬群。經過對疫區(qū)豬群的撲殺，疫情得到控制和根除。1960年，葡萄牙出現ASF疫情。美洲在20世紀60年代也報道過非洲豬瘟疫情，但在20世紀80年代被根除。2017年，在俄羅斯毗鄰中俄邊境地區(qū)發(fā)生非洲豬瘟疫情，2018年8月，非洲豬瘟疫情蔓延至我國。

目前，已確定了至少22種不同的ASFV基因型，每一種基因型在地理上都不是均勻分布的，對基因型分析的結果表明，1957年和1960年從非洲傳到葡萄牙的基因型屬于Ⅰ型病毒。2007年4月，在高加索地區(qū)靠近黑海港口波蒂的地區(qū)報道的非洲豬瘟疫情中的病毒屬于基因Ⅱ型。我國沈陽發(fā)生非洲豬瘟疫情后，研究人員對非洲豬瘟病毒的p72片段序列進行基因型系統進化分析，用CD2v片段序列進行血清群的系統進化分析，利用MEGA 5.0軟件(https://www.megasoftware.net/)構建了系統發(fā)育樹，結果發(fā)現此次分離的毒株(China 2018/1)屬于基因Ⅱ型、血清8群，與格魯吉亞毒株(Georgia 2007/1)高度同源[3]。

2 非洲豬瘟病毒的病原學

2.1 非洲豬瘟病毒的分類

非洲豬瘟病毒最初被認為是一種黏液病毒，隨后根據其衣殼的二十面體結構，被歸入虹彩病毒科。然而，進一步研究發(fā)現，在基因組結構等幾個重要方面，ASFV與痘病毒更為相似。系統發(fā)育分析表明，ASFV是位于痘病毒科和虹彩病毒科之間的一個獨立分支。2001年，該病毒第二次被重新歸類為非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，是該科中已知的唯一成員[4]。目前，ASFV是唯一已知的真正的DNA蟲媒病毒。

2.2 非洲豬瘟病毒的基因分析

非洲豬瘟病毒是一種超大型線性的雙鏈DNA病毒，病毒粒子結構為二十面體，直徑大約為200 nm。根據病毒分離株的不同，基因組大小約為170～190 kbp，編碼 151～167個開放閱讀框 (Open reading frame,ORF)，目前，這些基因的功能大多數還是未知?；蚪M的末端包含反向互補的發(fā)夾環(huán)，與串聯反向重復序列(Tandem inverted repeats,TIR)相鄰，這與痘病毒DNA結構極度相似；在基因組中間有著一段長約125 kbp的ASFV基因組保守區(qū)，其兩側為數個多基因家族(Multigene families,MGF)組成的可變區(qū)。ASFV分離株基因組長度的不同可能是由于TIRs數量的差異，而變異主要是由于幾個多基因家族(MGF100、110、300、360和505/530)的ORF減少或增加造成[5]。此外，一些不屬于MGFs的基因，如DP96R和E66L，表現出不同的分離特異性存在，這2個基因在Ba71V毒株中存在，但在Malawi Lil20/1毒株中不存在。

2.3 非洲豬瘟病毒的蛋白結構

非洲豬瘟病毒粒子包括至少68個蛋白，排列成4個同心結構域，依次為內核、核心、內包膜和衣殼。在蛋白衣殼下面是內部脂質膜，最初人們認為這是一種雙膜結構。Farlow等[6]使用新型電子顯微鏡檢測方法，發(fā)現ASFV的內質網池塌陷形成了單一脂質雙分子層。由E183L基因編碼的p54結構蛋白存在于內膜中，被認為是內質網膜塌陷機制的重要因素。B646L基因產物p72蛋白占病毒粒子質量的1/3，被認為是主要的衣殼蛋白。2個多聚蛋白pp220和pp62的蛋白產物形成一個大約30 nm大小的蛋白層被稱為核衣殼，這些蛋白產物占病毒粒子質量的32%。多聚蛋白的裂解是由病毒蛋白酶pS273R完成的，該蛋白酶也位于核衣殼中。內核是一個直徑約80 nm的密集區(qū)域，包含病毒基因組、核蛋白、RNA聚合酶和早期轉錄因子。此外，每個病毒粒子在通過質膜出芽時獲得外部包膜[7]。研究人員利用質譜分析[8]，鑒定出23個迄今未檢測到的病毒蛋白，它們功能未知，但占病毒顆粒中存在蛋白的34%。此外，一些新發(fā)現的結構蛋白在ASFV病毒粒子中大量存在。如pM1249L、pCP123L、pC129R、pC717R、pI177L，每個蛋白占病毒蛋白的含量超過1%。此外，科學家還發(fā)現了許多與病毒粒子相關的宿主蛋白，大多數是典型的質膜蛋白或與皮質肌動蛋白細胞骨架相關的蛋白。

3 非洲豬瘟病毒的感染機制

3.1 非洲豬瘟病毒感染途徑假說

非洲豬瘟病毒在機體內和機體外均表現出對單核巨噬細胞系細胞的嗜性，為了感染豬體，病毒需要與靶細胞表面的受體結合，越過質膜進入相關的細胞內開始復制。因而，受體介導的內吞作用被認為是非洲豬瘟病毒進入豬體的主要途徑，然而具體的細胞內受體尚未明確。一些研究將非洲豬瘟病毒入侵與靶細胞表面受體聯系起來，包括CD203a+、豬CD163、CD45和MHC-Ⅱ[8]。雖然這些分子可能扮演受體的角色，但仍然不清楚它們是否對感染至關重要。隨著時間的推移，對非洲豬瘟病毒入侵的多項研究均揭示了其感染過程中對發(fā)動蛋白和網格蛋白的依賴性，并認為網格蛋白介導的內吞作用是最有可能的進入機制[9]。非洲豬瘟病毒進入的速度很快，病毒顆粒感染后1～15 min即可在豬的細胞核內檢測到。此外，非洲豬瘟病毒進入豬體細胞還依賴膽固醇，藥物誘導去除或打亂質膜上的膽固醇能夠抑制非洲豬瘟病毒的感染。

3.2 非洲豬瘟病毒在機體細胞內的復制

盡管關于非洲豬瘟病毒入侵存在多種理論，但乃有通過內吞途徑的病毒才能產生感染。在內吞途徑中，腔內酸化是病毒脫殼的必要條件，內吞途徑完整性的喪失，抑制非洲豬瘟病毒的早期核內體成熟為晚期核內體，導致感染率下降。衣殼脫殼后，病毒內膜與核內體膜融合，并將病毒核心粒子送入細胞質，病毒到達細胞質后會轉移到細胞核周區(qū)的微管組織中心(Microtubule organizing center,MTOC)附近進行病毒的復制，這一過程依賴于結構蛋白p54和動力蛋白之間的相互作用，以促進沿微管網絡的運輸。待非洲豬瘟病毒完成復制、轉錄、翻譯后，結構蛋白、病毒膜、不成熟和成熟病毒粒子以及包藏在波形蛋白中的病毒DNA在病毒工廠組裝形成子病毒；成熟的病毒顆粒通過pE120R衣殼蛋白和肌動蛋白從病毒工廠運輸到細胞膜，隨后病毒粒子通過質膜出芽的方式從細胞中釋放出來[10]。

3.3 非洲豬瘟病毒在機體細胞內的轉錄

非洲豬瘟病毒基因的表達在病毒復制周期中，因感染時間的不同被分為最早期、早期、中期和晚期等4個階段。瞬時的早期轉錄產物是在環(huán)己酰亞胺存在下合成的，不需要蛋白參與。早期轉錄對DNA合成抑制劑不敏感，而中期和晚期轉錄恰恰相反。非洲豬瘟病毒轉錄與DNA復制開始時觀察到的病毒感染早期基因表達下降密切相關。非洲豬瘟病毒粒子包含足夠的轉錄機制，至少有20個基因，可以合成成熟的轉錄產物，轉錄開始于每個基因上游富含AT的啟動子序列[11]。相比之下，非洲豬瘟病毒與大多數病毒一樣，完全依賴宿主翻譯機制來生產病毒蛋白，感染導致宿主翻譯復合物eIF4F組裝增加。

4 非洲豬瘟的臨床癥狀和病理變化

了解疾病的病程變化對早期的診斷和防控有重要作用。研究表明，非洲豬瘟的感染潛伏期、臨床癥狀和病理變化因感染毒株、感染途徑、感染劑量及宿主體況等的不同而不同，主要病理變化為脾臟敗血性出血和淋巴結出血性炎癥，組織學病變見大量淋巴細胞凋亡。豬感染非洲豬瘟病毒后的臨床癥狀具體分為最急性、急性、亞急性和慢性4種。

4.1 最急性癥狀

一般來說，強毒株會導致最急性的非洲豬瘟癥狀，其特征是非常迅速的臨床病程，高燒(高達42℃)、厭食、嗜睡，有時無疾病跡象猝死。此外，由于高熱會引起呼吸道損壞，但通常在剖檢時沒有發(fā)現明顯的損傷[12]。

4.2 急性癥狀

高等或中等毒力的非洲豬瘟病毒毒株會導致急性癥狀，發(fā)病豬的臨床特點是高燒、體溫40～42℃，嗜睡、厭食和不活動。感染豬往往聚集在一起，并且耳部、尾部、腹部和肛周出現向心性發(fā)紺。在高致病性毒株感染中，通常可見發(fā)病豬呼吸困難，伴有嚴重的肺水腫；皮膚存在點狀出血或瘀斑；其他臨床癥狀還有流鼻涕且有時帶血(鼻出血)、嘔吐和腹瀉，嘔吐物和糞便也可帶血(黑變)。懷孕母豬一般在發(fā)病7 d內會發(fā)生流產，感染豬場的豬死亡率可能高達100%。剖檢可見急性非洲豬瘟最典型的病變是出血性脾臟腫大，此外，還有多灶性出血性淋巴結炎，淋巴結發(fā)生廣泛出血，形成大理石樣外觀。受影響最嚴重的淋巴結為肝胃淋巴結、腎淋巴結及腹部淋巴結(如回腸淋巴結和腸系膜淋巴結)。下頜骨淋巴結、咽后淋巴結或腹股溝淋巴結等也可觀察到較少的出血。腎臟表面和切面常可見點狀出血。也可觀察到其他病變，多見黏膜或其他臟器漿膜出血，如大腸、小腸、心外膜、膀胱等黏膜出血[13]。

4.3 亞急性癥狀

被中毒力非洲豬瘟病毒毒株感染的豬通常會出現亞急性臨床癥狀，其臨床癥狀與急性非洲豬瘟的癥狀相似。受感染豬乃表現為中、高熱，死亡率為30%～70%，感染后能夠存活7～20 d。亞急性期病豬的血管變化主要是出血和水腫，可能比急性期更嚴重。受感染豬的死亡發(fā)生在2個不同的階段，一是在最初的血小板減少和白細胞減少期間，另一個是“恢復”階段，在感染仔豬中能觀察到血管舒張引起的紅細胞膨出。在病例剖檢中，病豬表現為心包積液、腹水和多灶性水腫。一些病豬可能出現出血性脾臟腫大，還有病豬出現部分脾臟腫大，脾臟斑塊受影響，其他部位不受影響。非洲豬瘟亞急性癥狀還包括多灶性出血性淋巴結炎，即可觀察到病豬全身多個淋巴結出血和“大理石”花紋；腎臟可見點狀出血；肺臟多灶性肺炎，肺呈斑片狀實變，顏色較深。這種病變也可歸因于非洲豬瘟病毒誘導的免疫抑制引起的繼發(fā)性感染。

4.4 慢性癥狀

慢性非洲豬瘟是低等毒力毒株引起的，主要表現為患病豬關節(jié)炎、呼吸困難和皮膚壞死。據推測，這種低等毒力毒株和相關的慢性病毒，是20世紀60年代伊比利亞半島疫苗試驗使用的非洲豬瘟病毒分離株進化而來的。在非洲豬瘟病毒已存在很長時間的其他地區(qū)，高等毒力和中等毒力分離株的進化并沒有導致慢性癥狀。在慢性非洲豬瘟病豬中未觀察到血管改變，能觀察到的病變與細菌繼發(fā)感染、誘導纖維性多漿膜炎、壞死或慢性肺炎、皮膚、舌頭和扁桃體壞死有關[14]。

5 非洲豬瘟疫苗

研究人員對非洲豬瘟疫苗的研究經歷了從滅活疫苗、重組蛋白/多肽疫苗、DNA疫苗到基因缺失疫苗的發(fā)展歷程。但目前仍沒有有效、安全的非洲豬瘟疫苗上市，非洲豬瘟病毒基因組和蛋白的復雜性是影響疫苗研發(fā)的主要因素。亞單位疫苗需要先確定潛在的保護性抗原，研究發(fā)現非洲豬瘟病毒的p30/CP204L、p54/E183L和CD2v/EP402R等基因的重組蛋白對病毒抗原具有部分保護作用。Salguero[15]從HEK-293T細胞中成功純化出5種非洲豬瘟病毒抗原，并將其構建到重組經修飾痘苗病毒安卡拉(MVA)病毒載體中，通過對豬的安全性和免疫原性試驗，首次證明了從哺乳動物細胞中純化的非洲豬瘟病毒亞單位抗原以及在MVA載體中表達的非洲豬瘟病毒亞單位抗原是安全的，并且可以在豬的初始增強免疫方案中誘導非洲豬瘟病毒特異性抗體和T細胞反應。

隨著對非洲豬瘟病毒編碼基因功能的深入研究，通過靶向基因缺失來生產理想的弱毒非洲豬瘟疫苗成為可能。研究表明，缺失I型干擾素抑制基因的非洲豬瘟弱毒疫苗可以誘導豬體細胞產生免疫保護[16]，這些基因的缺失并不會影響病毒在細胞中的復制，所以能夠在不斷培養(yǎng)中獲得相應基因缺失的弱毒株，但其免疫豬乃后均出現不同程度的副作用，免疫豬主要表現為關節(jié)炎、跛行。此外，研究還表明，同時缺失9GL和MGF360/505基因可使得非洲豬瘟病毒格魯吉亞毒株(Georgia 2007/1)毒力大幅度降低，但是用其接種豬并不能對親代病毒的攻擊提供保護[17]。因此，尋找其他的靶基因來生產有效和安全的非洲豬瘟疫苗，仍需要對病毒調節(jié)宿主免疫應答的分子機制進行詳細且深入研究。