江波楊蓉

（樂山市夾江縣動物疫病預防控制中心，四川樂山 614100）

非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染豬群引起的一種急性、重癥、出血性傳染病[1]。ASF的臨床解剖變化與急性經典豬瘟(Classical swine fever,CSF)相似，臨床診斷時常被誤診為CSF。由于國際貿易的流動性，ASFV很容易在豬群之間傳播。該病原于1921年在東非的肯尼亞首次被報道，隨后在歐洲地區(qū)、拉美地區(qū)被相繼發(fā)現。2007年，該病毒首次進入格魯吉亞共和國，隨后蔓延至俄羅斯等地區(qū)[1]。我國于2018年8月在沈陽市首次發(fā)現了ASF病例，疫情發(fā)展迅速并對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的損失。ASF的潛伏期通常為4～19 d，發(fā)病率為40%～85%，發(fā)病的嚴重程度取決于毒株是否引起豬的急性或亞急性發(fā)病、毒株毒力、感染途徑及是否存在出血。由于ASFV可以通過多種傳播方式進行傳播，且沒有疫苗和特效藥物治療[2]，因此，生物安全防控是現階段的主要防控方法。

ASFV是一種線性雙鏈DNA病毒，具有二十面體的多層結構，整個病毒基因組長約170～193 kb。同時，該病毒編碼約50多種結構蛋白[3]。其中，MGF家族基因組由中間的125 kb保守區(qū)和左側約35 kb和右端約15 kb的可變區(qū)組成。這兩個區(qū)域包含5個多基因家族(MGF)組，這些基因組與調節(jié)免疫反應和宿主特異性有關，根據其平均氨基酸長度命名的包括MGF360、MGF110、MGF505/530、MGF300和MGF100，可能是由基因復制和多樣化衍生而來的，并且在不同的ASFV毒株中具有不同的互補性，也是ASFV中最豐富的基因區(qū)[4]。其中，MGF360基因是ASFV的主要毒力基因的一部分，其本身含有約20個成員，缺失MGF360后ASFV致病性會大幅度降低，因此，該基因家族是ASFV基因缺失疫苗優(yōu)先被敲除的基因之一[5,6]。

目前，針對該病沒有安全有效的疫苗和藥物進行控制，使得ASF疫情在全球快速傳播并難以控制，有效的防控措施還是早期的病毒檢測和嚴格的消毒。此外，我國分離的ASFVSY18株，缺失MGF后可顯著降低病毒毒力。同時，中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所針對ASFV構建CD2V與MGF雙基因缺失株作為ASF疫苗候選株。因此，ASFV的早期診斷和檢測就顯得尤為重要，本文將根據ASFV的MGF360家族基因檢測方法的研究進展進行綜述。

1 非洲豬瘟的病原學檢測技術

1.1 非洲豬瘟病原鑒定

血細胞吸附試驗(Haemadsorption test,HAD)的檢測原理是豬紅細胞會吸附在感染ASFV的單核細胞或巨噬細胞表面，該試驗陽性結果可作為ASF診斷的最終標準，但由于該技術對試驗技術要求過高，且診斷周期較長，需要專門的設備及相關的培訓。因此，該技術常作為ASFV檢測的參考。

1.2 普通PCR檢測方法

聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)是檢測ASF的常用方法，可以在合適的溫度循環(huán)下使用PCR擴增子完成目的片段的擴增。該方法具有簡單快速、靈敏度高、特異性強等特點，且生物安全性高，能夠實現非洲豬瘟的早期診斷，是目前實驗室對病原檢測的常用方法之一。Aguero等[7]基于對7種不同ASFV代表性毒株的VP73基因(VP72基因的一部分)核苷酸序列的比較，建立了一種新的ASFVPCR檢測方法，該檢測方法被世界動物衛(wèi)生組織陸生動物診斷試驗和疫苗手冊推薦。

多重PCR的原理與常規(guī)PCR幾乎相同，該技術不僅保持了普通PCR的特點，且一次可以擴增多個病原的目的片段，能夠用于多種病原感染的快速診斷，對檢測多種病毒感染具有重要的指導意義。Liu等[8]基于非洲豬瘟病毒、豬瘟病毒和基因組高度保守的區(qū)域設計了3對特異性引物，在不同反應條件下建立了ASFV、CSFV(經典豬瘟病毒)和APPV(典型豬瘟病毒)的多重逆轉錄聚合酶鏈式反應(mRT-PCR)檢測方法。mRT-PCR測定包括2個步驟，即逆轉錄(RT)和mPCR，該檢測對ASFV、CSFV和APPV具有高度特異性、敏感性和可重復性，不與其他病原發(fā)生交叉反應，最低檢測限度為6.34×102copies/μL(ASFV) 和 6.34×101copies/μL(CSFV和APPV)。

1.3 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time,qPCR)是病原體檢測的首選，也是ASFV檢測的金標準。qPCR是一種利用非特異性SYBR Green Ⅰ熒光染料和特異性水解熒光探針TaqMan完成目的核酸定量的檢測技術，已有學者建立了針對ASFVp72基因的qPCR檢測方法，涉及的引物—探針序列在該方法中已被世界動物衛(wèi)生組織用作推薦序列。但這些方法對配套的反應儀器有嚴格的要求，需要專門的試驗設備和相關試驗技術，從而阻礙了該技術在基層和偏遠地區(qū)的應用。王濤等[9]建立了一種以MGF360-13L基因為靶標的qPCR檢測方法，檢測限最低為1.56×104copies/μL。韓勇軍[10]等根據ASFV的MGF360-14L基因、CD2v基因建立鑒別非洲豬瘟病毒野生株和基因缺失株的多重熒光定量PCR，結果顯示，最低檢測限為100 copies/μL。林彥星[11]等根據ASFV的646L、MGF360-14L和CD2v基因設計了鑒別ASFV野毒株和基因缺失疫苗株的三重熒光PCR，其靈敏度比世界動物衛(wèi)生組織推薦的熒光PCR高10倍，該方法的建立對后期非洲豬瘟病毒基因缺失苗的研發(fā)與推廣及ASF防控具有重要的指導意義。Guo等[12]基于非洲豬瘟病毒的B646L基因和MGF505-2R基因建立了用于檢測和區(qū)分廣泛型和基因缺失型的ASFV TaqMan PCR檢測方法，該方法特異性高，不與其他病原發(fā)生交叉反應。對B646L和MGF505-2R基因的標準質粒的檢測限分別為 5.8 copies/μL和 3.0 copies/μL。

1.4 等溫擴增法

環(huán)介導等溫擴增(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)由日本學者Notomi開發(fā)，使用2～3套引物和1種具有復制活性的聚合酶，可在15～60 min，65℃的恒溫下完成目標片段的擴增。目前，該方法已用于檢測ASFV。James[13]開發(fā)了用于檢測ASFV的一步環(huán)介導擴增(LAMP)檢測方法。將該檢測方法與用于ASF診斷的其他實驗室檢測方法進行比較。環(huán)介導等溫擴增法為檢測ASFV提供了一種基于PCR檢測的替代方法，可能更適合在非專業(yè)實驗室或移動實驗室中使用。沈永義等[14]公開發(fā)明了一種區(qū)分ASF野毒株和MGF360/505R基因缺失株LAMP檢測引物及試劑盒，可用于現場檢測。

1.5 重組酶聚合酶擴增技術 （RPA）

該技術是2006年由TwistDx Inc公司開發(fā)的一種新型等溫擴增檢測技術，即重組酶聚合酶擴增技術(Recombination polymerase amplification,RPA)。該技術主要依賴于結合單鏈核酸(即寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)、鏈置換DNA聚合酶等3種酶。RPA反應溫度在37～42℃之間，整個反應在20～30 min內即可完成模板的擴增，得到新的雙鏈DNA。該技術反應中的酶主要以凍干形式存在，有利于保存和運輸。該技術還能與熒光定量技術和側向流動免疫技術相結合，建立便于觀察結果的檢測方法。吳映彤[15]以MGF360-12/13設計合成PRA引物，優(yōu)化并建立RPA快速核酸檢測方法，最低檢測限分別為1 000個拷貝數，且特異性及重復性較高。

1.6 微滴數字PCR檢測技術

微滴數字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)是一種對核酸分子絕對定量及擴增的新技術，其原理是通過微流體芯片技術或微滴技術將樣本分散成數萬個單獨反應室，每個DNA分子可作為單獨的反應體系，分別進行PCR擴增，與傳統(tǒng)的PCR相比，該技術克服了熒光定量PCR繁雜的標準曲線的建立，實現了對單分子DNA的絕對定量檢測。鄔旭龍[16]通過ASFV的K205R基因設計了1對特異性引物和TaqMan探針，建立實時熒光定量PCR(qPCR)和微滴數字PCR(ddPCR)檢測方法，ddPCR的最低檢測限度可達到0.36 copies/μL，檢測靈敏度是qPCR的10倍。

2 血清學診斷技術

血清學診斷因其檢測簡單、成本相對較低、對專業(yè)設備要求不高，是最常用的非洲豬瘟病毒的檢測方法。目前沒有ASFV疫苗的上市，如果檢測的豬群中非洲豬瘟病毒抗體呈陽性，則表明豬群中可能存在該病原。因此，抗體檢測對于ASF的診斷尤為重要。目前，ASFV的血清學檢測包括抗原檢測和抗體檢測，但抗原檢測的條件更為嚴格。由于ASFV不能完全中和抗體，抗體檢測逐漸成為主流的血清學診斷方法。世界動物衛(wèi)生組織推薦的基于ASFV抗體的檢測是用于抗體篩查的ELISA，并輔以其他確認性檢測，如膠體金試紙條等。

2.1 ELISA檢測方法

酶聯免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一種方便快捷的直接檢測抗體的方法，具有操作方便、特異性較好、靈敏度高等特點，非常適合大批量樣品的檢測。如果要通過ELISA檢測獲得更準確的診斷結果，則必須進行更可靠的固相載體和純化抗原。蔣智勇等[17]建立了基于CHO-K1細胞穩(wěn)定表達ASFV的CD2v蛋白的間接ELISA抗體檢測方法，該方法檢測ASFV陽性血清的敏感性可達1∶1 600，且批內與批間變異系數均小于10%。

ELISA具有檢測快速、操作簡單、成本相對較低等優(yōu)點，是目前應用最廣泛的ASFV檢測方法。ELISA適用于急性病例，慢性病例檢出率不高。因此，對于ELISA顯示為陽性的樣本，建議通過核酸、免疫印跡或間接熒光抗體檢測等方法進行確認。

2.2 紙條檢測方法

膠體金免疫層析技術(Immune colloidal gold technique,GICT)是一種簡便快速、特異、敏感的檢測技術，被廣泛用于疫病快速檢測。此外，此技術已廣泛用于檢測細菌、病毒、寄生蟲、激素和抗體。還可以縮短檢測時間、提高檢測效率，且在臨床檢測時不需要專業(yè)設備和實驗室人員，可在10 min內完成，生成的結果可以用肉眼直接讀取。Wan等[18]已經開發(fā)了一種基于重組p30和截短的p72蛋白的膠體金雙免疫層析技術。試紙條的靈敏度為1∶256，相當于市售的ELISA試劑盒。Geng等[19]開發(fā)了一種用于ASFV抗體檢測的帶有p72三聚體的膠體金免疫層析條，該試紙條比用于臨床血清樣本檢測的商業(yè)ELISA試劑盒更敏感。

量子點(Quantum dot,QDs)屬于納米材料并具有半導體的屬性，組成元素一般在Ⅱ～Ⅵ族，直徑大約在1～100 nm左右。在生命科學研究領域中，常作為一種新型的材料(帶熒光)。量子點免疫層析試紙條(Fluoro-immunechromatographic assay,FICA)是在量子點技術上開發(fā)出來的，與傳統(tǒng)的試紙條相比，該技術可實現病原定量檢測，也可提高QDs標記和偶聯量。馮志新等[20]運用該技術發(fā)明了一種檢測ASFV的CD2v與MGF360基因的黏膜抗體試紙條，在反應后采用365 nm紫外發(fā)射器就可完成檢測結果判定，對口拭子的最大檢測限為1∶64。

3 討論

目前，ASFV基因型較多，主要包括pp220、pp62、p72、p54、p30、CD2v、p10、p12、p14.5 和 p17，其免疫逃逸機制復雜多樣，給疫苗研究帶來諸多困難。由于沒有市售的非洲豬瘟疫苗，分子診斷方法和血清學檢測技術仍被認為是識別感染動物和控制ASF的主要手段。疫苗被認為是預防和控制非洲豬瘟的重要措施之一，已確認的MGF505/360基因缺失株或CD2v基因缺失株是最有可能成為非洲豬瘟疫苗的候選基因位點。此外，隨著該毒株的流行與變異，市場也迫切需要能夠區(qū)分ASFV基因缺失株的檢測技術。