竇明理 夏玉吉 黃 萍 王 明 陶 滔 王 毅*

1.四川省食品檢驗研究院 四川成都 611731 2.國家市場監(jiān)管重點實驗室(白酒監(jiān)管技術(shù)) 四川成都 611731

鱸魚以其鮮美的肉質(zhì)、豐富的營養(yǎng)價值作為重要的經(jīng)濟魚類，近些年來得到廣泛養(yǎng)殖。在養(yǎng)殖過程中由于養(yǎng)殖密度大、投餌量大、排泄物較多、死亡魚體未及時清除以及其他諸多原因會導(dǎo)致養(yǎng)殖群體患病，增加死亡率[1]?；前奉愃幬锸侵妇哂袑Π被交酋０方Y(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，具有穩(wěn)定、抗菌譜廣、價廉等優(yōu)點而廣泛使用，其能夠抑制大多數(shù)革蘭氏陽性菌和部分革蘭氏陰性菌[2，3]。已有多種磺胺類衍生物作為抗菌藥物應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖和集約化畜牧業(yè)[4，5]。其對水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細菌性豎鱗病、爛鰓病、鞭毛蟲病等有良好的防治效果[6]。然而磺胺類藥物的大劑量使用和不遵守休藥期的規(guī)定會導(dǎo)致可食動物組織中殘留的磺胺超標[7]。磺胺類藥物不易代謝，很容易在動物體內(nèi)蓄積，進而對人體健康造成危害[8]。其會對人體有泌尿系統(tǒng)及肝損害、胃腸道及消化系統(tǒng)不良癥、過敏癥狀、溶血性貧血、再生障礙性貧血等嚴重反應(yīng)[9，10]。GB 31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥殘留最大限量》中明確指出了磺胺二甲嘧啶和磺胺類總量的殘留限量[11]。

測量不確定度是表征賦予被測量值分散性的非負參數(shù)，能夠表明對測量結(jié)果有效性信心的增加[12，13]。食品檢驗工作是食品安全監(jiān)管，維護舌尖安全的有力保障，測量不確定度在食品檢驗工作中的運用十分廣泛。

本研究以磺胺類藥物中磺胺二甲嘧啶為代表，氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶為內(nèi)標，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對鱸魚樣品進行檢測，根據(jù)JJF 1059.1-2012《測量不確定度評定與表示指南》，建立數(shù)學(xué)模型，對不確定度來源進行評定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

磺胺二甲嘧啶標準品，阿爾塔科技有限公司；

氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶標準品，阿爾塔科技有限公司；

甲醇，F(xiàn)isher chemical公司；

乙腈，F(xiàn)isher chemical公司；

甲酸，Sigma-Aldrich公司；

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平，美國梅特勒-托利多儀器有限公司；

高速離心機，美國Thermo Scientific公司。

1.2 試驗方法

準確稱取鱸魚樣品5g，置于50mL聚丙烯離心管中，加入600ng氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶內(nèi)標，渦旋混合1min，避光放置10min，加入20mL含1%甲酸的乙腈，渦旋混勻，再加入10g無水硫酸鈉，超聲振蕩提取20min，8 000r/min離心5min，將上清液收集至50mL刻度離心管中，殘渣加入20mL含1%甲酸的乙腈；重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，加入10mL乙腈飽和正己烷，渦旋1min，靜置分層，棄去上層正己烷，乙腈層再用10mL乙腈飽和正己烷重復(fù)提取一次，棄去正己烷，乙腈層于40℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至近干，殘渣用乙腈轉(zhuǎn)移至20mL容量瓶定容搖勻，過0.22μm有機濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析測定。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

1.3.1 液相色譜條件

液相色譜條件：色譜柱，Agilent ZORBAX Ecilipse Plus C18Rapid Resolution HD 3.0×150mm 1.8μm；流動相:(A)0.2%甲酸水溶液，(B)0.2%甲酸乙腈；流速0.5mL/min；進樣量2μL；柱溫40℃；洗脫梯度見表1。

表1 洗脫條件

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧(ESI+)；監(jiān)測模式，多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)；毛細管電壓3 500V，干燥氣溫度350℃，干燥氣流速10L/min，鞘氣溫度320℃，鞘氣流速10L/min。定性離子對、定量離子對等質(zhì)譜參數(shù)見表2所示。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.4 不確定度來源分析

建立鱸魚樣品中磺胺二甲嘧啶含量的數(shù)學(xué)模型，如公式(1)。

(1)

式中：X為試樣中磺胺二甲嘧啶的含量，單位為μg/kg；

C為試樣提取液中磺胺二甲嘧啶的濃度，單位為ng/mL；

V為試樣定容體積，單位為mL；

m為稱樣量，單位為g；

R為稀釋倍數(shù)。

根據(jù)數(shù)學(xué)模型(1)可知，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測鱸魚樣品中磺胺二甲嘧啶的測量不確定度引入途徑包括重復(fù)測量引入、回收率引入、校正曲線擬合引入、校正溶液配制引入、樣品稱量定容前處理操作引入、檢測儀器引入等。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量計算

2.1.1 測量重復(fù)性引入的不確定度分量

稱取6份鱸魚試樣，進行處理后測定分析，得到檢測結(jié)果分別為170.2、173.5、164.2、164.8、162.8、162.6μg/kg，平均含量為166μg/kg。

據(jù)根貝塞爾公式，測量重復(fù)性引起的標準不確定度按公式(2)計算。

(2)

相對標準不確定度按公式(3)計算。

(3)

2.1.2 回收率引入的不確定度分量

稱取6份鱸魚空白試樣，進行處理后測定分析，得到回收率分別為99.40%、101.13%、102.00%、94.70%、101.34%、90.79%，平均回收率為98.2%。

據(jù)根貝塞爾公式，回收率引起的標準不確定度按公式(4)計算。

(4)

回收率引起的相對標準不確定度按公式(5)計算。

(5)

2.1.3 校正曲線擬合引入的測量不確定度分量

校正曲線以磺胺二甲嘧啶與氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶的響應(yīng)比值為縱坐標，磺胺二甲嘧啶與氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶的濃度比值為橫坐標，校正溶液濃度及峰響應(yīng)見表3，擬合得線性回歸方程為：A=0.043552+0.028415C，r2=0.9985。

表3 校正溶液峰響應(yīng)

由校正曲線引起的標準不確定度分量按公式(6)、公式(7)計算。

(6)

(7)

公式(6)和(7)中：

a=0.043552；

b=0.028415；

P為試液測量次數(shù)，為6;

n為校正溶液測量次數(shù)，為7;

C0為樣品濃度平均值，為41.7654ng/mL。

代入數(shù)據(jù)，校正曲線的標準差SR=0.08703，校正曲線標準引入不確定度為：u(3)=1.7164，則相對標準不確定度按公式(8)計算。

(8)

2.1.4 校正溶液配制引入的測量不確定度分量

根據(jù)磺胺二甲嘧啶標準物質(zhì)證書，可知濃度為100.2μg/mL，擴展不確定度±5%(k=2)，則標準物質(zhì)引入的分量按公式(9)計算。

(9)

準確吸取含磺胺二甲嘧啶100.2μg/mL和含氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶100μg/mL的標準溶液100μL，分別用乙腈定容至10mL容量瓶中，得到濃度為1.002μg/mL的外標儲備液和1μg/mL的內(nèi)標儲備液。分別吸取上述外標儲備液2、4、10、20、40、100、200μL，各加入上述內(nèi)標儲備液30μL，氮氣吹干后精密加入1mL空白基質(zhì)溶液(空白基質(zhì)溶液按照樣品相同處理獲得)復(fù)溶，混勻即得到基質(zhì)標準曲線，濃度為2.004、4.008、10.02、20.04、40.08、100.2、200.4ng/mL。

標準溶液配制過程中，內(nèi)標僅在最后加入30μL時會產(chǎn)生不確定度，儲備液配制過程的不確定度不需要考慮。操作時室溫控制為20±5℃，乙腈體積膨脹系數(shù)為1.37×10-3，檢測過程中移液器使用、容量瓶定容時乙腈體積均會受到溫度影響，會導(dǎo)致體積變化，假定為均勻分布。而移液槍頭、玻璃器皿的膨脹系數(shù)很小，可忽略不計。

溫度變化引入的相對不確定按公式(10)計算。

(10)

移液器使用引入的相對不確定度見表4。

表4 標準溶液配制移液器引入的不確定度

采用10mL容量瓶的容量允差為0.020mL，按均勻分布處理，則容量瓶引入相對不確定度按公式(11)計算。

(11)

標準溶液引入的相對不確定度按公式(12)計算。

(12)

2.1.5 樣品前處理引入的相對不確定度

樣品稱取過程用的電子天平檢定證書給出不確定度為1.0mg，k=2；稱樣量為5g，則其相對不確定度按公式(13)計算。

(13)

樣品加入600μL的1μg/mL內(nèi)標后，進行前處理，根據(jù)檢定證書，采用移液器不確定度為0.504μL，k=2，則移液器添加內(nèi)標引入相對不確定度按公式(14)計算。

(14)

殘渣用乙腈復(fù)溶后定容至20mL容量瓶，20mL容量瓶容量允差為0.03mL，按均勻分布處理，則其引入不確定度按公式(15)計算。

(15)

樣品前處理引入的相對不確定度按公式(16)計算。

(16)

2.1.6 檢測儀器引入的相對不確定度

檢測儀器為液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，檢定證書給出的不確定度為U=5%，k=2，則其相對不確定度按公式(17)計算。

(17)

2.2 合成標準不確定度

根據(jù)上述得到的標準不確定度分量，合成相對標準不確定度為按公式(18)計算。

urel=

(18)

u=urel×166=10.4 μg/kg

(19)

2.3 擴展不確定度U

取置信概率p=95%，包含因子k=2，擴展不確定度按公式(20)計算。

U=u×k=21 μg/kg

(20)

評定結(jié)果可表示為X=(166±21)μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

本研究建立了以氘代磺胺鄰二甲氧嘧啶為內(nèi)標，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對鱸魚樣品中磺胺二甲嘧啶進行檢測，并建立數(shù)學(xué)模型，對其不確定度進行評定，可以為其他磺胺類藥物的檢測與不確定度評定提供科學(xué)依據(jù)。

當鱸魚樣品中磺胺二甲嘧啶含量為166μg/kg時，擴展不確定度為21μg/kg，k=2。在測定磺胺二甲嘧啶時，不確定度來源主要有重復(fù)測量引入、回收率引入、校正曲線擬合引入、校正溶液的配制過程引入、前處理操作引入以及檢測儀器引入等。研究結(jié)果表明，校正曲線擬合、校正溶液配制和檢測儀器對不確定度的貢獻最大，測量重復(fù)性、回收率和前處理過程對不確定度影響也不可忽視。因此，實驗室為保證結(jié)果的可靠性，在實驗過程中應(yīng)嚴格把控校正曲線擬合過程和標準溶液配制過程，并及時對所使用的檢測儀器進行檢定校準，必要時可以增加平行測定次數(shù)，采用規(guī)范的前處理操作過程都可以有效保證結(jié)果的可靠性。