包春生 高玉峰

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

缺血性腦卒中發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，目前缺血性腦卒中的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，已知神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)損傷與缺血性腦卒中的發(fā)生密切相關(guān)，其中NSCs存在于神經(jīng)系統(tǒng)中并可定向分化為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等，因而促進(jìn)NSCs增殖及分化成為治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵措施，既往研究顯示部分植物提取物具有抗炎、抗氧化等作用，并可減輕神經(jīng)元細(xì)胞損傷，但關(guān)于其具體作用機(jī)制尚未闡明〔1～4〕。黑蘇嘎-25主要成分為麝香、木香等，其主要是從天然產(chǎn)物中提取，并可減輕腦缺血損傷〔5〕。但黑蘇嘎-25對(duì)NSCs細(xì)胞損傷的作用機(jī)制尚未闡明?？p隙連接蛋白(Cx)43主要存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞中，抑制Cx43表達(dá)可縮小腦梗死面積〔6〕。但黑蘇嘎-25對(duì)NSCs細(xì)胞損傷及Cx43表達(dá)的影響尚未闡明。因此，本研究采用缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型，探討黑蘇嘎-25對(duì)缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響，探究其對(duì)Cx43的表達(dá)及其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 小鼠神經(jīng)干細(xì)胞C17.2購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司；黑蘇嘎-25購(gòu)自內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)(0.2 g/粒)；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑購(gòu)自上海信帆生物科技有限公司；凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自蘇州宇恒生物科技有限公司；白細(xì)胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳市科潤(rùn)達(dá)生物工程有限公司；兔抗鼠細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；兔抗鼠Cx43抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，將其置于缺氧裝置(37℃、1%O2、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱)內(nèi)分別培養(yǎng)6、12、24 h〔7〕，分別記為6、12、24 h缺氧組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組。神經(jīng)干細(xì)胞(1.5×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)，分別加入含不同濃度(0.03、0.10、0.30、0.90、1.80、3.60 mg/ml)黑蘇嘎-25的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h〔8〕，然后置于缺氧裝置(37℃、1%O2、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱)內(nèi)培養(yǎng)12 h，分別記為0.03 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組、0.10 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組、0.30 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組、0.90 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組、1.80 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組、3.60 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組。

1.2.2MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 取神經(jīng)干細(xì)胞(1.5×105個(gè)/ml)接種于96孔板(100 μl/孔)后按照“1.2.1”分組處理，分別加入MTT溶液(20 μl/孔)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后棄上清，加入二甲基亞砜(DMSO，150 μl/孔)，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)吸光度值(A值)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 取各組神經(jīng)干細(xì)胞加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清，按照凋亡試劑盒說明書操作并檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)IL-6、TNF-α的水平 取各組神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液，采用ELISA檢測(cè)IL-6、TNF-α的水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5Western印跡檢測(cè)CyclinD1、Bcl-2、Bax、Cx43蛋白表達(dá) 各組神經(jīng)干細(xì)胞加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應(yīng)，分離的蛋白凝膠被轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉被用于封閉2 h，加入一抗稀釋液(1∶1 000)后放入4℃冰箱內(nèi)孵育24 h，采用TBST洗滌后加入二抗稀釋液(1∶2 000)，將其放入室溫條件下孵育1 h后使用TBST洗滌，滴加ECL后置于暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1缺氧處理不同時(shí)間NSCs細(xì)胞活性的變化情況 與NC組(0.963±0.09)比較，6 h缺氧組(0.824±0.08)、12 h缺氧組(0.546±0.05)、24 h缺氧組(0.497±0.04)A值明顯降低(P<0.05)，其中缺氧處理12 h后細(xì)胞活力趨于50%，因而選用缺氧處理12 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2缺氧處理不同時(shí)間NSCs細(xì)胞中CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá) 與NC組比較，6、12、24 h缺氧組CyclinD1、Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白水平明顯升高(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)檢測(cè)CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量

表1 缺氧處理不同時(shí)間NSCs細(xì)胞中CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

2.3不同濃度黑蘇嘎-25對(duì)缺氧處理的NSCs細(xì)胞增殖活性的影響 與NC組(0.972±0.09)比較，12 h缺氧組(0.539±0.05)A值明顯降低(P<0.05)；與12 h缺氧組比較，0.10 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組(0.573±0.05)、0.30 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組(0.643±0.07)、0.90 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組(0.782±0.07)、1.80 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組(0.902±0.09)、3.60 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組(0.883±0.08)A值明顯升高(P<0.05)，而黑蘇嘎-25濃度為0.03 mg/ml時(shí)細(xì)胞A值(0.544±0.004)變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。黑蘇嘎-25濃度為1.8 mg/ml與3.60 mg/ml時(shí)細(xì)胞A值變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4不同濃度黑蘇嘎-25對(duì)缺氧處理的NSCs細(xì)胞凋亡的影響 與NC組〔(6.81±0.62)%〕比較，12 h缺氧組〔(23.57±2.11)%〕凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與12 h缺氧組比較，0.10 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組〔(19.63±1.86)%〕、0.30 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組〔(13.52±1.24)%〕、0.90 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組〔(9.63±0.91)%〕、1.80 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組凋亡率〔(7.98±0.73)%〕降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.5不同濃度黑蘇嘎-25對(duì)缺氧處理的NSCs細(xì)胞CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)情況 與NC組比較，12 h缺氧組CyclinD1、Bcl-2蛋白水平降低，Bax蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與12 h缺氧組比較，0.10、0.30、0.90、1.80 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組CyclinD1、Bcl-2蛋白水平升高，Bax蛋白水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、圖3。

1～6:NC組，12 h缺氧組，0.10 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組，0.30 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組，0.90 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組，1.80 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組；圖4同圖3 Western印跡檢測(cè)CyclinD1、Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)

2.6黑蘇嘎-25對(duì)缺氧處理的NSCs細(xì)胞炎癥因子水平的影響 與NC組比較，12 h缺氧組IL-6、TNF-α的水平明顯升高(P<0.05)；與12 h缺氧組比較，0.10、0.30、0.90、1.80 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組IL-6、TNF-α的水平明顯降低(P<0.05)，見表2。

2.7黑蘇嘎-25對(duì)缺氧處理?xiàng)l件下Cx43蛋白表達(dá)的影響 與NC組比較，12 h缺氧組Cx43蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與12 h缺氧組比較，0.10、0.30、0.90、1.80 mg/ml黑蘇嘎-25+12 h缺氧組Cx43蛋白水平明顯降低(P<0.05)，見表2、圖4。

圖4 Western印跡檢測(cè)Cx43蛋白的表達(dá)

3 討 論

植物提取物可通過促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和神經(jīng)元分化而減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，還可促進(jìn)髓鞘再生改善缺氧缺血性腦損傷〔9～11〕。黑蘇嘎-25主治偏癱、半身不遂等，具有抗腦缺血作用，還具有副作用小、作用多途徑、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，可減輕腦缺血再灌注損傷，其作用機(jī)制可能與降低炎癥因子的水平有關(guān)〔12〕。本研究結(jié)果顯示，缺氧處理后可明顯降低神經(jīng)干細(xì)胞活力，并可降低CyclinD1、Bcl-2蛋白水平及提高Bax蛋白水平，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似〔13，14〕。提示成功建立神經(jīng)干細(xì)胞損傷模型。本研究結(jié)果提示，黑蘇嘎-25可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖，可抑制缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞凋亡。本研究進(jìn)一步證實(shí)黑蘇嘎-25可明顯提高缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2的表達(dá)水平，還可降低Bax的表達(dá)水平，證實(shí)黑蘇嘎-25可促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡從而減輕細(xì)胞損傷。IL-6、TNF-α水平升高可加重神經(jīng)干細(xì)胞損傷〔15〕。本研究結(jié)果提示，黑蘇嘎-25可抑制缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而減輕細(xì)胞損傷。

Cx43在LPS誘導(dǎo)的多巴胺神經(jīng)元退變中可發(fā)揮重要調(diào)控作用，并可能作為帕金森病的治療靶點(diǎn)〔16〕。抑制Cx43可通過Janus酪氨酸激酶(JAK)2/信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3途徑減輕腦缺血/再灌注損傷〔17〕。Cx43在心肌缺血/再灌注損傷中可發(fā)揮重要調(diào)控作用〔18〕。本研究結(jié)果提示黑蘇嘎-25可能通過下調(diào)Cx43表達(dá)從而減輕缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞損傷。

綜上，黑蘇嘎-25可能通過下調(diào)Cx43表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)從而減輕缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞損傷，Cx43可能作為黑蘇嘎-25治療缺血性腦卒中的作用靶點(diǎn)，但關(guān)于其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。