謝文驍,來(lái)超超,黃斌,潘學(xué)軍

（昆明理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，昆明 650500）

類固醇雌激素（Steroid estrogens, SEs）對(duì)生態(tài)環(huán)境與人體健康的危害廣受關(guān)注。17β-雌二醇（E2）是一種典型的SEs，僅在1 ng/L環(huán)境濃度時(shí)即可使水生生物產(chǎn)生慢性毒性，使其產(chǎn)生畸變或致癌[1]。課題組前期對(duì)昆明市8家城市污水處理廠研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，污水處理廠中E2的去除率僅為30%～40%，日環(huán)境負(fù)荷量高達(dá)7.8 g/d，城市生活污水已成為水環(huán)境中E2的重要來(lái)源之一[2]。而E2的環(huán)境累積對(duì)人類的危害日漸顯現(xiàn)，最近有研究報(bào)道[1]，在飲用水及蔬菜水果中均檢出了E2，且最大檢出濃度分別達(dá)到1.7、2.2 μg/L。因此，急需尋求高效去除污水處理廠中E2的方法，而提高生化法對(duì)E2的處理效率受到了廣泛關(guān)注[3]。

大多傳統(tǒng)的生物法與物理化學(xué)法污水處理技術(shù)可去除一部分SEs[4-5]，其中，光催化等高級(jí)氧化法處理水中的SEs已有研究[6]。然而，這些方法都存在高能耗和高成本的缺陷，因而，研究人員正探尋更有效且經(jīng)濟(jì)的方法來(lái)控制污水中的SEs。SEs在水環(huán)境中的半衰期從幾周到幾年不等[7]。相關(guān)研究表明，在自然環(huán)境中，微生物和光化學(xué)作用均能有效削減SEs濃度[8-9]，但吸附在水中沉積物上的SEs難以接收光照，表明生物降解在SEs的自然削減中產(chǎn)生了關(guān)鍵作用。同時(shí)，微生物去除污染物也是一種廉價(jià)且環(huán)境友好的技術(shù)[10]。因此，研究分析微生物降解SEs的過程及關(guān)鍵影響因素，對(duì)污水中SEs的去除尤為重要。

微生物去除污染物有兩種方法，即生物吸附和生物降解[11]。生物吸附是一種利用微生物細(xì)胞在水生環(huán)境中的一系列物理化學(xué)作用吸收污染物的過程[12]。而生物降解是指水中污染物被微生物轉(zhuǎn)化成中間代謝產(chǎn)物，并最終被礦化的過程。然而，盡管之前一些文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道了SEs的生物轉(zhuǎn)化，但生物吸附及生物降解過程對(duì)SEs去除的貢獻(xiàn)尚不清楚，復(fù)雜的環(huán)境因素對(duì)去除SEs的影響也尚不明確，包括碳源、pH值、腐殖質(zhì)（HS）、重金屬和溶解氧等。為了提高SEs的微生物去除效率，筆者選擇類固醇雌激素化合物E2作為目標(biāo)污染物，并從洱海底泥中提取富集E2降解微生物進(jìn)行生物吸附和生物降解實(shí)驗(yàn)，以探究自然過程中微生物對(duì)E2的生物吸附和生物降解過程及不同環(huán)境因素對(duì)該過程的影響，并分析微生物高效降解E2的最佳環(huán)境條件。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

E2和標(biāo)準(zhǔn)品腐殖酸（HA）購(gòu)買自Sigma-Aldrich公司。沉積物來(lái)自中國(guó)云南省大理市洱海，干燥后使用4.0 mm篩子篩分，用去離子水沖洗。采用國(guó)際腐殖酸物質(zhì)學(xué)會(huì)的堿溶酸析法提取湖泊沉積物腐殖酸（LHA）和富里酸（LFA）[13]。最后，將制備的LHA和LFA儲(chǔ)備溶液儲(chǔ)存在聚乙烯容器中，在黑暗中以4 ℃保存，并在3周內(nèi)使用。如未另外說明，所有其他試劑均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 E2降解微生物Y2的分離與鑒定 稱取100 g洱海底泥樣品與150 mL無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（MSM）混合置于500 mL錐形瓶中，充分振蕩20 min后取上清液。其中，MSM成分為600 mg/L K2HPO4·12H2O、800 mg/L KH2PO4、1 000 mg/L NaCl、800 mg/L NH4NO3、200 mg/L MgSO4、50 mg/L CaCl2·2H2O和10 mg/L酵 母 提 取 物[14]。取5 mL上清液到擴(kuò)大培養(yǎng)基中（含有10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl），在30 ℃的旋轉(zhuǎn)振蕩器上以160 r/min的速度培養(yǎng)24 h，以獲得微生物懸浮液。將1.0 mL微生物懸浮液移至含1.00 mg/L E2的250.0 mL MSM中，培 養(yǎng) 至E2濃 度 穩(wěn)定、不被降解為止。E2濃度用高效液相色譜儀（HPLC）檢測(cè)。將上述過程循環(huán)7次，以獲得E2降解菌。此后，將1.0 mL微生物懸浮液涂抹至瓊脂平板，并在30 ℃下培養(yǎng)12 h。用新瓊脂將發(fā)育良好的菌落劃線3次后，對(duì)培養(yǎng)的菌株進(jìn)行微生物種類鑒別。

1.2.2 生物吸附實(shí)驗(yàn) 為闡明E2降解微生物對(duì)E2的吸附過程，進(jìn)行了吸附平衡實(shí)驗(yàn)。生物量為1.00 g/L，E2濃度為1.00 mg/L，吸附時(shí)間為5 h。生物吸附在30.0 mL MSM中進(jìn)行，并在30 ℃的旋轉(zhuǎn)搖床上以160 r/min培養(yǎng)。在溶液中加入濃度為650 mg/L的疊氮化鈉以抑制微生物活性。此后，取1.0 mL樣品于離心管中，以12 000 r/min的速度離心10.0 min。離心后取樣品上清液，使用高效液相色譜儀對(duì)E2進(jìn)行分析。如無(wú)額外說明，所有吸附實(shí)驗(yàn)均在此條件下進(jìn)行。

等溫吸附實(shí)驗(yàn)使用1.00 g/L的生物量吸附不同 濃 度 的E2溶 液（0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、1.75、2.00 mg/L）。E2吸附在微生物上，吸附量G（mg/g） 可用式（1）計(jì)算。

式中：C0為E2的初始濃度，mg/L；Ce為E2的平衡濃度，mg/L；Cb為微生物濃度，g/L。

為評(píng)估pH值、生物量對(duì)E2生物吸附的影響。分別對(duì)初始pH值范圍為4.0～10.0和初始生物量為0.08～1.20 g/L的樣品進(jìn)行吸附實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 生物降解實(shí)驗(yàn) 為了評(píng)估碳源、H2O2、腐殖質(zhì)及重金屬對(duì)E2生物降解的影響，將1.00 mg/L E2和1.00 g/L微生物加入30 mL MSM的燒瓶中后，在避光條件下以160 r/min的轉(zhuǎn)速在30 ℃的旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)。如無(wú)額外說明，所有生物降解實(shí)驗(yàn)均在此條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中，所加碳源為葡萄糖與甲酸鈉，濃度為0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0 mg/L。H2O2的濃度為0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、8.0、10.0、15.0、20.0 mmol/L，HA濃 度 梯 度 設(shè) 為 從0.0到50.0 mg/L不等。

為確定重金屬（Zn2+、Cu2+、Pb2+和Cd2+）存在條件對(duì)微生物去除E2的影響，選擇初始濃度分別為0.5、1.5、3.0、5.0、8.0、10.0、12.0、15.0 mg/L的重金屬與1.00 mg/L E2 培養(yǎng)72 h，以闡明重金屬對(duì)E2生物降解的影響。

所有實(shí)驗(yàn)在相同條件下進(jìn)行，試劑及容器均在高壓滅菌鍋中以121 ℃滅菌30 min后使用。所有操作重復(fù)3次。

1.2.4 分析方法 采用配備 Waters symmetry-C18 反相柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）和熒光檢測(cè)器的高效液相色譜儀（Agilent Technologies1260）對(duì)E2進(jìn)行定量分析。E2以1.00 mL/min的速度用流動(dòng)相洗脫，在283 nm/345 nm的激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)。流動(dòng)相由含有0.1%三氟乙酸的乙腈和超純水以60:40的比例混合而成。E2的檢測(cè)限值為0.01 mg/L，所有樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5%以內(nèi)。吸附數(shù)據(jù)使用SigmaPlot 12.5進(jìn)行擬合。

2 結(jié)果討論

2.1 E2降解微生物Y2的鑒定

在對(duì)底泥樣本中E2降解微生物Y2進(jìn)行富集篩選后，對(duì)培養(yǎng)的菌株進(jìn)行微生物種類鑒別，鑒別結(jié)果如圖1所示，Y2為大腸桿菌。因此，以下實(shí)驗(yàn)均以從底泥樣本中富集的大腸桿菌為降解菌種。

圖1 E2降解菌Y2鑒定層次聚類樹Fig. 1 The phylogenetic tree of E2 degrading bacteria Y2 identification

2.2 生物吸附和生物降解過程的鑒別

為明確生物吸附和生物降解過程對(duì)水溶液中E2去除率的貢獻(xiàn)，首先，在30 ℃下進(jìn)行了1.00 g/L大腸桿菌對(duì)1.00 mg/L E2的生物吸附實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2所示。在最初15 min內(nèi)，大腸桿菌吸附E2的速率較快，已達(dá)到吸附平衡總量的75%，隨后吸附速率變緩，并在60 min時(shí)達(dá)到吸附平衡，在接下來(lái)的4 h內(nèi)，E2的濃度幾乎沒有變化。大腸桿菌對(duì)E2最高吸附量為0.20 mg/g。因此，生物吸附是污水中E2去除的重要過程之一，對(duì)該過程的研究具有重要的工程指導(dǎo)意義。

圖2 大腸桿菌對(duì)E2的吸附平衡曲線Fig. 2 E. coli adsorption equilibrium curve for E2

為了更好理解大腸桿菌對(duì)E2的生物吸附作用，在30 ℃下進(jìn)行等溫吸附實(shí)驗(yàn)。并根據(jù)E2兩種不同的吸附模型，分別使用Freundlich和Langmuir等溫線吸附模型進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖3，具體參數(shù)見表1。這兩種吸附等溫線模型都較好地?cái)M合了生物吸附E2過程。因此，研究中的生物吸附過程主要是細(xì)胞表面與E2之間的單層吸附過程[15-16]。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，使用Langmuir等溫方程計(jì)算不同時(shí)間細(xì)胞上的吸附量。

表1 兩種不同的吸附模型擬合結(jié)果Table 1 Fitting results of two different adsorption models

圖3 兩種不同的吸附模型擬合曲線Fig. 3 The fitting curves of two different adsorption models

在72 h的1.00 g/L大腸桿菌對(duì)1.00 mg/L E2生物去除實(shí)驗(yàn)中，生物降解率為生物去除率減去生物吸附率，結(jié)果如圖4所示，表明在初期8 h內(nèi)E2的去除主要?dú)w因于生物吸附作用。這可能是由于初期大腸桿菌處于適應(yīng)期，生物降解速率較慢。隨后生物降速率變快，E2濃度持續(xù)下降。72 h后生物降解率為63.74%，E2的剩余濃度約為0.30 mg/L。因此，生物對(duì)E2的去除是初期的快速生物吸附和生物降解的共同作用過程[17]。

圖4 E2的總?cè)コ?、生物吸附率及生物降解率Fig. 4 Total removal efficiency, biosorption efficiency and biodegradation efficiency of E2

2.3 pH值與生物量對(duì)E2生物吸附的影響

不同pH值和生物量對(duì)1.00 mg/L E2的生物吸附率如圖5所示。圖5（a）中，在酸性條件下，1.00 g/L大腸桿菌的生物吸附量隨著pH值的增大逐漸從0.05 mg升高至0.12 mg。當(dāng)pH值為8時(shí)，吸附效率突增至0.28 mg，pH值繼續(xù)升高，吸附效率又急劇下降至0.06 mg。這是由于在酸性條件下高濃度的質(zhì)子會(huì)與E2形成競(jìng)爭(zhēng)吸附，且質(zhì)子會(huì)與細(xì)胞表面的官能團(tuán)結(jié)合成鍵，從而降低生物吸附率[18]。而pH值過高時(shí)，溶液中陰離子可能會(huì)與E2絡(luò)合，導(dǎo)致生物吸附效率下降。因此，將pH值調(diào)整為8更有利于微生物對(duì)E2的吸附，進(jìn)而促進(jìn)微生物降解。在圖5（b）中，生物量與E2的生物吸附效率呈明顯正相關(guān)。生物量在0.08～1.20 g/L時(shí)，1 h內(nèi)E2吸附效率從0.08 mg增加至0.21 mg。因此，增加生物量可以有效提高E2的生物吸附率。

圖5 pH值與生物量對(duì)生物吸附的影響Fig. 5 Effect of pH value and biomass on the biosorption

2.4 E2的生物降解

2.4.1 碳源對(duì)E2生物降解的影響 持久性有機(jī)污染物流入水生環(huán)境，可抑制微生物的生長(zhǎng)[19]。微生物需要一定時(shí)間去適應(yīng)被污染的環(huán)境。然而，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和SEs會(huì)形成共代謝機(jī)制來(lái)影響水環(huán)境中SEs的生物降解[20-21]。為加速E2的生物降解，研究了不同類型及濃度的碳源對(duì)E2生物降解的影響。由于培養(yǎng)72 h后殘留E2濃度太低，無(wú)法區(qū)分有機(jī)碳源對(duì)生物降解的影響，因而選擇48 h作為培養(yǎng)周期，結(jié)果見圖6。在碳源的濃度范圍為0.0～50.0 mg/L時(shí)，生物降解率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)。其中，當(dāng)達(dá)到10.0 mg/L甲酸鈉和40.0 mg/L葡萄糖時(shí)，對(duì)E2的微生物降解促進(jìn)效果最明顯，分別提升26.31%和57.47%。主要是由于低濃度外界碳源的增加使微生物活性增加，加速了對(duì)E2的代謝過程。但是，降解率并不會(huì)隨著碳源的增加而繼續(xù)增大?？赡艿脑蛑皇钱?dāng)存在高濃度的外源有機(jī)碳時(shí)，微生物將主要代謝有機(jī)碳源，而減少了對(duì)污染物的代謝降解活動(dòng)。因此，目標(biāo)污染物的降解變得難以進(jìn)行[22]。與甲酸鈉相比，葡萄糖作為碳源更有利于微生物降解E2，降解率最高達(dá)到90.50%，這是因?yàn)榇竽c桿菌可以直接利用葡萄糖，而大腸桿菌需要適應(yīng)甲酸鈉后才能依靠其生長(zhǎng)[23]。

圖6 碳源對(duì)生物降解率的影響Fig. 6 Effect of carbon sources on the biodegradation efficiency

2.4.2 H2O2對(duì)E2生物降解的影響 已有研究表明[24]，溶解氧對(duì)水生環(huán)境中SEs的微生物代謝過程非常重要。但精確定量溶解氧相對(duì)困難，為了控制溶解氧濃度梯度，選用H2O2作為補(bǔ)充氧源進(jìn)行48 h實(shí)驗(yàn)[25]，評(píng)估H2O2對(duì)E2降解可能造成的影響，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明，0.0～20.0 mmol/L H2O2僅可氧化 約0.50%～6.60% E2，而0.0～3.0 mmol/L H2O2與大腸桿菌存在協(xié)同作用，當(dāng)達(dá)到3.0 mmol/L H2O2時(shí)，大腸桿菌和H2O2對(duì)E2的協(xié)同去除率達(dá)到最大值49.44%。當(dāng)更高濃度的H2O2和大腸桿菌同時(shí)存在時(shí)會(huì)對(duì)生物降解產(chǎn)生明顯抑制作用。當(dāng)H2O2濃度增加到15.0 mmol/L時(shí)，E2的降解率僅為1.97%。添加低濃度H2O2后，由于溶解氧的增加提高了微生物的活性，從而獲得更好的生物性能與更高的E2去除率。但H2O2濃度過高時(shí)，對(duì)細(xì)菌的強(qiáng)氧化作用破壞了細(xì)胞內(nèi)的酶，從而抑制了生物活性，導(dǎo)致E2的生物降解率降低[26-27]。

圖7 H2O2對(duì)生物降解率的影響Fig. 7 Effect of H2O2 on the biodegradation efficiency

2.4.3 腐殖質(zhì)對(duì)E2生物降解的影響 E2具有穩(wěn)定的芳香結(jié)構(gòu)，表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性和極低的水溶性，很難被生物體利用，從而限制了生物降解技術(shù)的應(yīng)用[28]。而腐殖質(zhì)可能作為一種天然表面活性劑促進(jìn)E2的生物降解[29-30]。因此，研究了72 h內(nèi)不同濃度腐殖質(zhì)對(duì)E2生物降解率的影響，見圖8。結(jié)果表明，當(dāng)LFA濃度在0.0～10.0 mg/L時(shí)，生物去除率最高提升了7.53%，總?cè)コ蕿?7.95%。而相同濃度下LHA對(duì)E2生物去除的促進(jìn)效果更明顯，最高提升21.91%，總?cè)コ蔬_(dá)到92.33%。標(biāo)準(zhǔn)品HA效果與其相似。主要存在以下原因：1）腐殖質(zhì)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞表面的疏水性，增強(qiáng)E2降解菌株的親和力，使生物吸附和代謝得到改善；2）由于腐殖質(zhì)中具有的親水性和親油性基團(tuán)能在水溶液中形成聚合物膠團(tuán)，使E2溶解在其中，增加其在水相中的溶解度，從而提高多環(huán)芳烴的生物可利用性[29]。不同腐殖質(zhì)在0.0～10.0 mg/L濃度范圍內(nèi)對(duì)E2生物降解的促進(jìn)作用排序如下： LHA＞HA＞LFA。這是由于它們各自的芳香結(jié)構(gòu)不同，在其他多環(huán)芳烴降解研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[31]。而當(dāng)腐殖質(zhì)濃度的繼續(xù)增加時(shí)，E2的生物降解率迅速下降，這主要由兩方面導(dǎo)致：一方面，當(dāng)更高濃度的腐殖質(zhì)與MSM共存時(shí)，它們將與E2吸附結(jié)合形成包裹態(tài)物質(zhì)，以抑制細(xì)胞和E2之間的直接接觸；另一方面，高濃度的腐殖質(zhì)會(huì)破壞各種生物酶，從而導(dǎo)致E2的生物降解率降低[25]。因此，與低濃度的腐殖質(zhì)相比，高濃度的腐殖質(zhì)對(duì)E2的去除具有抑制作用。

圖8 腐殖質(zhì)對(duì)生物降解率的影響Fig. 8 Effect of humic on the biodegradation efficiency

2.4.4 重金屬對(duì)E2生物降解的影響 微量元素是維持微生物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的，可刺激微生物活動(dòng)。但當(dāng)單一微量元素過量時(shí)，對(duì)微生物具有很高毒性。研究了72 h內(nèi)不同重金屬對(duì)生物降解率的影響，見圖9。由于污水中重金屬含量相對(duì)自然水體較高，因此，實(shí)驗(yàn)濃度采用了高于自然水體的濃度水平。結(jié)果表明，較低濃度的Zn2+和Cu2+對(duì)E2降解有促進(jìn)作用。因?yàn)閆n2+和Cu2+是許多生物學(xué)過程和酶活性過程的重要輔因子，對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)活性和穩(wěn)定性至關(guān)重要[32]。但是，高濃度的Zn2+能顯著抑制E2的微生物降解。這是由于高濃度的Zn2+能抑制微生物的代謝過程，并形成與E2的競(jìng)爭(zhēng)性生物吸附，從而導(dǎo)致E2的生物吸附率及降解率下降[33]。而且高濃度的Zn2+比Cu2+有更明顯的抑制作用，這與之前的研究有相似的趨勢(shì)[34]。相比之下，即使Pb2+和Cd2+的濃度很低也會(huì)強(qiáng)烈抑制E2的微生物降解。這是因?yàn)樗鼈儗?duì)水生動(dòng)物、植物及微生物有較大的毒性，會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)和酶的活性，從而降低E2的生物降解率[35-36]。不僅如此，除了抑制代謝外，Pb2+和Cd2+的同步生物吸附同樣會(huì)與E2形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，使得E2的生物去除率降低[33]。

圖9 重金屬對(duì)生物降解率的影響Fig. 9 Effect of heavy mental on biodegradation efficiency

3 結(jié)論

1）大腸桿菌是洱海底泥中的E2降解優(yōu)勢(shì)菌種，E2的生物去除過程由生物吸附及生物降解兩部分組成。

2）生物吸附過程主要受pH值、生物量和E2濃度限制。其中吸附過程對(duì)pH值具有明顯的依賴性，與生物量和E2濃度則呈明顯正相關(guān)。弱堿性下（pH=8）吸附效率最為顯著，約是酸性和強(qiáng)堿性的2～5倍，可達(dá)0.28 mg/g。

3）當(dāng) 葡 萄 糖、甲 酸 鈉、H2O2、腐 殖 質(zhì)、Zn2+和Cu2+濃 度 分 別 為40.0 mg/L、10.0 mg/L、3.0 mmol/L、2.0～15.0 mg/L、0.5 mg/L及0.5 mg/L時(shí)，E2的生物降解率提高近12.41%～57.47%。而當(dāng)濃度過高時(shí)即產(chǎn)生明顯抑制作用。另外，Pb2+或Cd2+在低濃度就會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈抑制效果。