魏煒 王天雨 孟鑫 張超 李娜 楊志新 任立群

(承德醫(yī)學(xué)院河北省神經(jīng)損傷與修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 承德 067000)

阿爾茨海默病(AD)是發(fā)生在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病〔1〕。雖然對(duì)AD的研究已取得了較大進(jìn)展，但對(duì)其在認(rèn)知功能和行為能力方面造成進(jìn)行性損害的病因尚不明確，且無(wú)特效治愈藥物，目前的治療僅可進(jìn)行對(duì)癥治療和延緩AD進(jìn)展。關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制，目前存在多種假說(shuō)〔2〕，主要為：①膽堿能功能缺陷假說(shuō)；②淀粉樣假說(shuō)，β-淀粉樣蛋白(Aβ)的異常沉積；③Tau蛋白過(guò)度磷酸化并聚集成神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)而引起的Tau蛋白病;④氧化應(yīng)激和鈣調(diào)節(jié)失衡等。自1932年電子顯微鏡發(fā)明以來(lái)，對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的研究進(jìn)一步深入。AD患者及大鼠的神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變主要為：海馬CA1區(qū)神經(jīng)元萎縮，形態(tài)不規(guī)則；細(xì)胞外Aβ聚集形成中心結(jié)構(gòu)均一，外圍呈星狀的淀粉樣蛋白核心，被營(yíng)養(yǎng)障礙性突起所包圍；神經(jīng)元線粒體腫脹、數(shù)目減少，分布不均，嵴排列不規(guī)則或斷裂變短，基質(zhì)變淺，線粒體膜模糊、空泡化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激產(chǎn)生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔增大、腫脹；含脂滴的次級(jí)溶酶體數(shù)量增加，脂褐素沉積增多;星形膠質(zhì)細(xì)胞腫大增生呈活化狀態(tài)。本文擬從AD的超微結(jié)構(gòu)研究方向進(jìn)行綜述。

1 Tau蛋白形成與NFT

Tau 蛋白是一種主要的微管相關(guān)蛋白，通過(guò)與微管蛋白的結(jié)合對(duì)微管的穩(wěn)定和軸漿流動(dòng)的維持起著重要作用，而過(guò)度磷酸化的Tau蛋白可以分解微管，導(dǎo)致微管堵塞，進(jìn)而導(dǎo)致了NFT的形成，阻礙軸漿流動(dòng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元變性〔3〕。在已知的17號(hào)染色體相關(guān)的額顳葉癡呆合并帕金森綜合征(FTDP-17)家族中，如外顯子10(P301L,P301S,N279K)、外顯子 9 (G257T,G272V)、外顯子12 (V337M)、外顯子 13 (R406W)〔4〕,其表達(dá)與Tau蛋白的過(guò)度磷酸化有關(guān)。增強(qiáng)了P301S表達(dá)的轉(zhuǎn)基因大鼠，在早期就出現(xiàn)了Tau蛋白過(guò)度磷酸化表達(dá)，超微結(jié)構(gòu)提示了大鼠軸突纖維喪失和脫髓鞘改變，證實(shí)了軸突末端過(guò)度磷酸化的Tau蛋白積累與軸突變性、脫髓鞘改變、神經(jīng)肌肉接處的神經(jīng)缺失、肌肉萎縮有關(guān)〔5〕。關(guān)于Tau蛋白的超微結(jié)構(gòu)一直沒(méi)有得到證實(shí)，實(shí)驗(yàn)中多采用免疫組織化學(xué)染色的方法對(duì)其過(guò)度磷酸化進(jìn)行檢測(cè)，目前研究已經(jīng)可以通過(guò)分辨率3.4～3.5 ?的低溫冷凍電鏡技術(shù)得到展示，其結(jié)構(gòu)為神經(jīng)原纖維病變中成對(duì)的螺旋和直絲(PHF和SF)組成的特征結(jié)構(gòu)和相應(yīng)的原子模型。該細(xì)絲核心由兩個(gè)相同的原絲組成，包括Tau蛋白的306～378殘基，它們采用了β-交叉/β-螺旋結(jié)構(gòu)的結(jié)合，形成了Tau聚集的種子模型。而成對(duì)的PHF和SF在原絲間排列方式的不同，表明了其超微結(jié)構(gòu)的多態(tài)性〔6〕。

2 Aβ沉積

Aβ是由淀粉樣前體蛋白 (APP) 經(jīng)一系列α-/β-/θ-分泌酶切割水解產(chǎn)生的，其中產(chǎn)生的Aβ1～40和 Aβ1～42蛋白更具有神經(jīng)毒性〔7〕，沉積在大腦皮層和海馬區(qū)域的細(xì)胞外形成老年斑(SP)，能導(dǎo)致神經(jīng)元的過(guò)氧化損傷、Tau 蛋白過(guò)度磷酸化、炎癥反應(yīng)損傷、營(yíng)養(yǎng)障礙性突起、突觸損傷甚至神經(jīng)元凋亡〔8〕，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生?，F(xiàn)在常用的APP/早老素(PS)1轉(zhuǎn)基因小鼠，其原理為轉(zhuǎn)入的人APP基因過(guò)表達(dá)，產(chǎn)生大量的APP，而PS1的共表達(dá)促進(jìn)了Aβ1-42的產(chǎn)生。Aβ的超微結(jié)構(gòu)為細(xì)胞外密集堆積的原纖維和細(xì)絲〔9〕，聚集形成中心結(jié)構(gòu)均一，外圍呈星狀的淀粉樣蛋白核心，被營(yíng)養(yǎng)障礙性突起所包圍的典型神經(jīng)炎性斑塊，周?chē)梢?jiàn)退變或即將消失的突觸結(jié)構(gòu)和板層解離的髓鞘。Aβ也可沉積于轉(zhuǎn)基因鼠的海馬微血管旁及微血管壁，其位置可能在基膜層及基膜層外的神經(jīng)氈結(jié)構(gòu)中〔10〕。在利用斑馬魚(yú)自身啟動(dòng)子appb調(diào)控人源APPsw建立的AD轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型中也得到證實(shí)，6月齡的APPsw 轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)血管上出現(xiàn)Aβ沉積導(dǎo)致血管超微結(jié)構(gòu)變化，而神經(jīng)元的變化出現(xiàn)在9月齡的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)上。Aβ對(duì)腦微血管的影響早于對(duì)神經(jīng)元的影響，其對(duì)AD的作用是相互作用、相互促進(jìn)的〔11〕。Aβ的產(chǎn)生與其清除之間的不平等是最重要的因素：其清除途徑有：(1)自噬體的產(chǎn)生，在AD小鼠模型腦組織中發(fā)現(xiàn)，自噬體的產(chǎn)生早于Aβ在小鼠神經(jīng)元周?chē)木奂?2〕。體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)Aβ無(wú)論是由轉(zhuǎn)基因細(xì)胞HEK293產(chǎn)生還是外源性加入，均可誘導(dǎo)自噬體的產(chǎn)生和自噬標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白(LC)3過(guò)表達(dá)，在電鏡下可觀察到具有雙層膜的早期自噬體和囊泡狀的晚期自噬體。Aβ42相比Aβ40伴隨自噬表現(xiàn)出的細(xì)胞毒性更強(qiáng)〔13〕。(2)最主要的是通過(guò)膠質(zhì)細(xì)胞的膠質(zhì)蛋白清除，包括：①星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生低密度脂蛋白受體與Aβ結(jié)合使其降解〔14〕；②小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ蛋白，但小膠質(zhì)細(xì)胞激活后產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)也會(huì)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞造成損傷〔15〕。(3)血腦屏障(BBB)轉(zhuǎn)運(yùn)出腦。腦內(nèi)及外周Aβ由BBB上的晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE)將外周的Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)至大腦，BBB上的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)-1介導(dǎo)的大腦內(nèi)Aβ轉(zhuǎn)運(yùn)通過(guò)BBB進(jìn)入血液〔16〕。

3 線粒體改變

線粒體為突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放提供所需的能量〔17〕。研究表明，與非突觸線粒體相比，突觸線粒體具有不同的形態(tài)和蛋白質(zhì)組學(xué)特征，這可能使突觸特別容易變性〔18〕。由于突觸是高能量需求的場(chǎng)所，因此必須將線粒體運(yùn)送到該位置。而Tau蛋白在線粒體順行轉(zhuǎn)運(yùn)所需微管的結(jié)合和穩(wěn)定中起著至關(guān)重要的作用〔19〕。有研究表明，病理性的Tau蛋白可以干擾此轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程〔20〕。而線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激已被發(fā)現(xiàn)是AD患者和AD動(dòng)物模型的早期和顯著特征〔21〕。在AD的患者和動(dòng)物模型中，均可見(jiàn)到線粒體的分裂增加、融合減少，超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為線粒體腫脹變大變圓且數(shù)目減少，分布不均，嵴排列不規(guī)則或斷裂變短，基質(zhì)變淺，線粒體膜模糊、空泡化〔22〕。在分析了人類兩個(gè)大腦區(qū)域前/后橫顳葉皮質(zhì)(BA41/42)和背外側(cè)前額葉皮質(zhì)(BA46)的不對(duì)稱突觸的超微結(jié)構(gòu)后，觀察到線粒體在突觸前末梢中是突觸后末梢的兩倍至三倍多。超微結(jié)構(gòu)顯示了異常的線粒體形態(tài)，突觸中多囊泡體的存在及AD中斑塊附近突觸長(zhǎng)度的減少。證實(shí)了在AD中突觸線粒體的區(qū)域特定變化，并支持了AD中線粒體向突觸前末端的轉(zhuǎn)運(yùn)或突觸線粒體動(dòng)力學(xué)改變的觀點(diǎn)〔23〕。在調(diào)控融合蛋白線融素(Mfn)2表達(dá)消融的大鼠中，電子顯微鏡顯示海馬神經(jīng)元和許多皮層神經(jīng)元出現(xiàn)線粒體腫脹和嵴結(jié)構(gòu)異常，線粒體的長(zhǎng)寬比均接近1，包含許多小的囊性嵴，其外膜呈彌漫性結(jié)構(gòu)，缺乏雙膜結(jié)構(gòu)及線粒體膜的破裂甚至外膜幾乎不可見(jiàn)。表明成年神經(jīng)元中的Mfn2消融會(huì)引起線粒體破碎和功能障礙，從而通過(guò)涉及AD受損的大腦區(qū)域中神經(jīng)炎癥的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致神經(jīng)變性〔24〕。

針灸作為國(guó)粹，其對(duì)AD治療也得到認(rèn)可。通過(guò)針刺AD轉(zhuǎn)基因大鼠的“百會(huì)”“涌泉”“大椎”“腎俞”“太溪”等穴位，可明顯改善AD轉(zhuǎn)基因大鼠的認(rèn)知能力，超微結(jié)構(gòu)的觀察中可見(jiàn)到線粒體的結(jié)構(gòu)恢復(fù)、功能改善〔25〕。針刺6月齡SAMP8小鼠的“百會(huì)”“血?！薄澳I俞”“膈俞”穴，可使其大腦海馬神經(jīng)元線粒體分裂蛋白(Fis)1的表達(dá)減少、線粒體融合蛋白(OPA)1的表達(dá)增加，有效提高SAMP8小鼠學(xué)習(xí)記憶能力，減少線粒體動(dòng)力學(xué)異常，超微結(jié)構(gòu)與模型組相比，線粒體形態(tài)基本正常，少數(shù)嵴腔擴(kuò)張、嵴溶解〔26〕。

4 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)改變

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是最大的細(xì)胞器，具有網(wǎng)狀的膜結(jié)構(gòu)，由粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)組成，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與核糖體相關(guān)，控制蛋白翻譯；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包括核膜、細(xì)胞質(zhì)池和小管〔27〕?；鎯?nèi)質(zhì)網(wǎng)多沿軸突分布，介導(dǎo)細(xì)胞微管骨架和線粒體的正常組織結(jié)構(gòu)〔28〕。管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一部分，有證據(jù)表明它可能介導(dǎo)囊泡運(yùn)輸和(或)細(xì)胞器接觸，控制細(xì)胞通信，調(diào)節(jié)線粒體融合和分裂〔29〕。網(wǎng)狀蛋白(RTN)是形成管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)所必需的〔30〕。在RTN3免疫反應(yīng)性營(yíng)養(yǎng)不良神經(jīng)軸突(RIDNs)的超微結(jié)構(gòu)中，在軸突末端逐漸積累了管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并且管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)異常分布和走向軸突末端出現(xiàn)年齡相關(guān)性。在來(lái)自AD腦的活檢樣本中的淀粉樣斑塊周?chē)l(fā)現(xiàn)了這種異常的管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包涵體。在功能上，異常聚集的管狀內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在營(yíng)養(yǎng)不良性軸突(DNs)形成的早期階段誘導(dǎo)線粒體裂變?cè)鰪?qiáng)，并在后期階段最終導(dǎo)致線粒體變性〔31〕。Aβ沉積引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激被認(rèn)為是AD神經(jīng)元凋亡的重要機(jī)制〔32〕。在透射電鏡下 APP/PS1小鼠的大腦皮層神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔增大和腫脹，提示APP/PS1小鼠存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)的應(yīng)用對(duì)APP/PS1小鼠皮層異常有明顯的抑制作用，EGCG還顯著降低了APP/PS1小鼠大腦皮層內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78、應(yīng)激相關(guān)的凋亡蛋白CHOP 和Caspase12表達(dá)水平〔33〕。

5 突觸萎縮

突觸由3個(gè)要素組成：突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜，突觸連接不僅是神經(jīng)元之間的連接，而且是將動(dòng)作電位從一個(gè)神經(jīng)元傳遞到另一個(gè)神經(jīng)元的通道〔34〕。突觸前膜中突觸小泡儲(chǔ)存神經(jīng)遞質(zhì)，線粒體為神經(jīng)遞質(zhì)的釋放提供能量〔35〕。突觸損傷與丟失是AD的一個(gè)重要特征。突觸超微結(jié)構(gòu)變化主要為突觸間隙模糊，突觸前后膜界限不清，突觸后膜致密層減少甚至消失〔36〕，海馬區(qū)線粒體異常，包括嵴膨大、斷裂合并突觸數(shù)量的減少〔37〕。APP/PS1轉(zhuǎn)基因大鼠的海馬GrayⅠ型突觸活性長(zhǎng)度較野生型大鼠明顯縮短，但突觸間隙面積、突觸界面曲率、突觸后致密物厚度無(wú)差異〔36〕。該變化也會(huì)出現(xiàn)在小腦的浦肯野細(xì)胞層。超微結(jié)構(gòu)提示老化的突觸前末梢的突觸小泡和線粒體數(shù)量減少，突觸前和突觸后膜的特殊區(qū)域變薄〔38〕。小腦顆粒細(xì)胞的平行纖維與浦肯野細(xì)胞的棘突形成興奮性突觸聯(lián)系(PF-PC)，其突觸后致密區(qū)(PSD)厚度變薄，突觸間隙變寬，突觸活性帶長(zhǎng)度變短及突觸界面曲率變小，最終導(dǎo)致突觸的傳遞效能減弱〔39〕。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)調(diào)控突觸活動(dòng)和突觸可塑性〔40〕。突觸素是突觸小泡特異性標(biāo)記蛋白，與突觸的生長(zhǎng)、修復(fù)、再生和突觸重塑密切相關(guān)〔41〕。其在AD模型小鼠的表達(dá)均減少〔39〕。而不論基因型或飲食，均未觀察到大腦皮層神經(jīng)元突觸數(shù)量的差異和線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)量的變化〔37〕。

6 膠質(zhì)細(xì)胞作用

6.1小膠質(zhì)細(xì)胞 小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦的固有免疫細(xì)胞，使用模式識(shí)別受體復(fù)合物識(shí)別并響應(yīng)sAβ和fAβ〔42〕。下游信號(hào)傳導(dǎo)誘導(dǎo)腫瘤壞死因子(TNF)α和白細(xì)胞介素(IL)-1β分泌，它們通過(guò)趨化作用募集附近的小膠質(zhì)細(xì)胞，并可能引發(fā)失控的炎癥反應(yīng)，損傷神經(jīng)元并引發(fā)突觸損失小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Aβ清除的作用可以防止Aβ沉淀到纖維斑中，并降低引起神經(jīng)退行性的有害sAβ的腦內(nèi)濃度〔43〕。小膠質(zhì)細(xì)胞在超微結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)為特征性豆?fàn)詈?，含有密集的異染色質(zhì)，細(xì)胞體中含有大量的線粒體，這些線粒體通常與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的典型長(zhǎng)片段緊密相連，偶爾伴有高爾基體和吞噬囊泡。APP/PS1小鼠的海馬CA1區(qū)的小膠質(zhì)細(xì)胞在與fAβ斑塊相互作用時(shí)結(jié)構(gòu)明顯改變，包括突觸結(jié)構(gòu)、吞噬體系統(tǒng)的明顯變化、顯示出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的增加跡象、脂質(zhì)包裹體的數(shù)量顯著增加。在AD人腦的小膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)中，也發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞接觸營(yíng)養(yǎng)不良的神經(jīng)突和樹(shù)突棘，形成了多個(gè)接觸，幾乎完全包圍了營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)突的多個(gè)側(cè)面，其中含有一個(gè)或多個(gè)吞噬包涵體〔44〕。

6.2星形膠質(zhì)細(xì)胞 星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化通常被認(rèn)為是AD中的神經(jīng)炎癥毒性反應(yīng)。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞可通過(guò)吞噬和降解Aβ來(lái)限制淀粉樣病變〔45〕。而星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)性可以通過(guò)中間絲蛋白(GFAP)的表達(dá)增加及形態(tài)上通過(guò)其突起的肥大部分在淀粉樣蛋白斑塊附近被明確識(shí)別〔46〕。APP/PS1小鼠海馬中Aβ斑塊周?chē)姆磻?yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛均勻地遍及年輕APP/PS1小鼠海馬所有區(qū)域，不管該區(qū)域有沒(méi)有細(xì)胞外淀粉樣蛋白沉積。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞在APP/PS1小鼠海馬的斑塊內(nèi)和斑塊周?chē)憩F(xiàn)出具有肥大形態(tài)的反應(yīng)性表型和擴(kuò)展過(guò)程，GFAP表達(dá)增強(qiáng)，包裹并吞噬了營(yíng)養(yǎng)不良性軸突和突觸前部分，其星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性隨年齡及淀粉樣蛋白病理改變平行發(fā)展。同時(shí)還在AD患者的海馬中檢測(cè)到了這些吞噬性星形膠質(zhì)細(xì)胞〔47〕。APP/PS1 轉(zhuǎn)基因小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)線粒體固縮，含脂滴的次級(jí)溶酶體數(shù)量增加;星形膠質(zhì)細(xì)胞腫大增生呈活化狀態(tài)，并吞噬營(yíng)養(yǎng)障礙性突觸〔48〕。

綜上，關(guān)于AD的研究已持續(xù)百年，隨著研究技術(shù)的進(jìn)步，從疾病表現(xiàn)、診斷、治療的臨床層面到發(fā)病機(jī)制、模型復(fù)制、分子生物學(xué)、基因?qū)W的研究，醫(yī)務(wù)工作者、科研工作者對(duì)其研究到達(dá)了全新的高度。電子顯微鏡技術(shù)在分子生物學(xué)的協(xié)作下對(duì)超微結(jié)構(gòu)的研究更加細(xì)化，因?yàn)閭惱淼年P(guān)系，對(duì)AD的超微結(jié)構(gòu)研究停留在復(fù)制的動(dòng)物模型和患者死后的尸體解剖上，動(dòng)物模型畢竟不完全等同于人類，死后的代謝改變對(duì)研究也有一定干擾，電子顯微鏡所需組織僅需1 mm3，如能在AD患者的腦組織中進(jìn)行活檢取材，發(fā)現(xiàn)新的突觸變化或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-線粒體連接改變及膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮的雙向作用，會(huì)有更大研究突破。