戴婧婷，林麗玲，范銘豐，張華峰，劉希華

（1.福建省資源環(huán)境監(jiān)測(cè)與可持續(xù)經(jīng)營(yíng)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建三明 365004；2.三明學(xué)院海峽理工學(xué)院，福建三明 365004；3.三明市土肥站，福建三明 365000；4.廈門(mén)市森林病蟲(chóng)害防治技術(shù)站，福建廈門(mén) 361004；5.三明學(xué)院資源與化工學(xué)院，福建三明 365004）

根據(jù)聯(lián)合國(guó)教科文組織和糧農(nóng)組織的不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)的鹽堿地面積為9 913萬(wàn)hm2，鹽堿地占中國(guó)總耕地面積的10%[1]。為了緩解鹽堿脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的負(fù)面影響，人們已經(jīng)采用多種方法來(lái)培育耐鹽的農(nóng)作物。傳統(tǒng)雜交育種周期長(zhǎng)，見(jiàn)效慢，基因工程育種存在著不可預(yù)見(jiàn)的缺點(diǎn)[2]，而內(nèi)生細(xì)菌與植物的互作提高了作物的自身耐鹽能力，并克服了上述2種方法的缺點(diǎn)[3]，因而分離出能與植物互作且能提高作物自身耐鹽能力的內(nèi)生菌在耐鹽農(nóng)作物的培育中有著重要的作用。紅樹(shù)林區(qū)土壤及其植株體內(nèi)外含有大量微生物[4]，但研究多集中在植物病原菌抗菌方面[5-7]，而紅樹(shù)林內(nèi)生細(xì)菌在促生抗逆等方面的研究鮮有報(bào)道。木欖（Bruguiera gymnorhiza）是紅樹(shù)林的主要組成種類(lèi)，該研究從木欖根莖葉中分離篩選鑒定耐鹽堿菌株，為培育耐鹽農(nóng)作物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料。木欖采自福建省廈門(mén)市南湖公園（24°26′N(xiāo)，118°04′E），采樣時(shí)整株植物連根拔起，低溫保存運(yùn)輸，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，馬上分離內(nèi)生細(xì)菌。

1.1.2 試驗(yàn)試劑。基本培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，NaCl濃度設(shè)置為10（對(duì)照）、50、100、150、200 g/L。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離和純化。木欖內(nèi)生細(xì)菌的分離方法參照小飛蓬耐鉛內(nèi)生細(xì)菌的分離方法[8]。

1.2.2 生理生化分析。對(duì)分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色、接觸酶反應(yīng)、檸檬酸鹽反應(yīng)、吲哚試驗(yàn)和甲基紅試驗(yàn)檢驗(yàn)[8]。

1.2.3 分子鑒定。菌株基因組DNA用3S柱離心式環(huán)境樣品DNA回收試劑盒（天根）進(jìn)行提取，以通用引物8f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492r（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）（上海華大基因）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。退火溫度為52℃。選用HinfⅠ、HaeⅢ、MspⅠ和TaqⅠ4種限制性?xún)?nèi)切酶消化16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分析酶切結(jié)果。選取酶切不同類(lèi)型的代表菌株送往杭州有康生物科技有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序[8]。

測(cè)序后的序列在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，用Clustal X 1.83對(duì)同源性超過(guò)95%序列進(jìn)行分析，用軟件MEGA（7.0）利用Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌分離

從表1可以看出，只有在木欖的葉部分離到耐鹽的內(nèi)生細(xì)菌，而且隨著鹽濃度的增加，所分離到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量也隨之減少。

表1 木欖分離菌株情況

2.2 生理生化分析

對(duì)所分離的24株（50 g/L和100 g/L濃度中分離的）內(nèi)生細(xì)菌生理生化分析結(jié)果表明，所有的菌革蘭氏染色后是紫色的，為陽(yáng)性菌；過(guò)氧化氫試驗(yàn)均產(chǎn)生氣泡，為陽(yáng)性菌；吲哚試驗(yàn)全部為玫紅色，為陽(yáng)性菌；甲基紅（M-R）試驗(yàn)均為紅色，為陽(yáng)性菌；淀粉水解試驗(yàn)除了1個(gè)50 g/L的為深藍(lán)色，為陰性菌，其余菌株為紫色、紫紅色或無(wú)色，為陽(yáng)性。

2.3 分子鑒定

49株供試菌株通用引物8 f和1492 r擴(kuò)增出1 600 bp左右的單一條帶，經(jīng)過(guò)4種限制性?xún)?nèi)切酶消化分別產(chǎn)生1～4種圖譜類(lèi)型（圖1），酶切圖譜比對(duì)、組合分析后共獲得5種遺傳型（表2）。選取不同組合類(lèi)型的代表菌株進(jìn)行16S rDNA序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，收集同源性高的序列。

圖1 供試菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物酶切圖譜類(lèi)型

表2 供試菌株16S rDNA PCR-RFLP圖譜類(lèi)型

利用MEGA（7.0）將秋茄和木欖內(nèi)生細(xì)菌菌株與其同源性較高的菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)（圖2）。結(jié)合各菌株的遺傳距離（圖2）和菌株16S rDNA序列的Blast同源性（表3）進(jìn)行比較分析，初步推斷出L1為越南芽孢桿菌（Bacillus vietnamensis），L2為芽孢桿菌（Bacillus cereus），L4為白翎芽孢桿菌（Bacillus baekryun-gensis），L5為巴氏葡萄球菌（Staphylococcus pasteuri）。

圖2 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表3 菌株16S rDNA序列的Blast同源性分析

3 結(jié)論與討論

該文通過(guò)不同鹽濃度的LB培養(yǎng)基對(duì)木欖根莖葉耐鹽內(nèi)生細(xì)菌的分離篩選，共分離到24株耐鹽內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)合生理生化分析、16S rDNA分子鑒定等技術(shù)，推斷出所分離到內(nèi)生細(xì)菌分別為越南芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、白翎芽孢桿菌和巴氏葡萄球菌。

一些研究人員觀(guān)察到，用內(nèi)生細(xì)菌接種植物可以在鹽堿地環(huán)境下促進(jìn)植物生長(zhǎng)和發(fā)育[10]。內(nèi)生細(xì)菌或通過(guò)合成大量甘氨酸甜菜堿等化合物，或通過(guò)誘導(dǎo)滲透保護(hù)劑和抗氧化蛋白的合成[11]，或通過(guò)合成低乙烯產(chǎn)生和抗氧化防御機(jī)制的快速激活來(lái)增強(qiáng)植物在鹽堿地的生長(zhǎng)[12]。有研究通過(guò)分離龍葵等耐鉛植物的內(nèi)生細(xì)菌并轉(zhuǎn)接馬尾松上，促進(jìn)了鉛脅迫下馬尾松的生長(zhǎng)[13]。因此研究從紅樹(shù)林分離耐鹽的內(nèi)生細(xì)菌，轉(zhuǎn)接到其他植物上以增強(qiáng)其在鹽堿地生長(zhǎng)，是可行的，也具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。