蔣一博 杜可欣 陳 軍 牟維林 于建偉 趙樂榮

(煙臺新時代健康產(chǎn)業(yè)日化有限公司，山東 煙臺 264000)

馬尾松花粉是我國重要的針葉用材樹種，其花粉具有產(chǎn)量大、純天然的優(yōu)點，有研究證明松花粉多糖能激活T、B淋巴細胞的增殖，其通過影響IL-1β刺激B細胞分化和分泌抗體，并刺激T細胞分化IL-2及干擾素C，刺激中性粒細胞，提高NK細胞殺傷活性，增強機體免疫功能。但由于松花粉的水溶性較低，為了使其可以在在化妝品各類劑型中更好的應(yīng)用，通常采用松花粉提取物的形式添加，此法既豐富了松花粉的應(yīng)用領(lǐng)域，同時也有助于提高活性成分的功效作用。

目前化妝品松花粉提取工藝常用方法主要有傳統(tǒng)水煮法、萃取法、酶解法、酸(堿)浸提法、超聲法、超臨界流體萃取法、微波法和深成層發(fā)酵培養(yǎng)法等[1]，其中酶解法、微波法、超聲法、超臨界流體萃取法過程復(fù)雜、酸(堿)浸提法易破壞多糖結(jié)構(gòu)[2]，發(fā)酵培養(yǎng)法耗時較長，結(jié)合傳統(tǒng)水煮法和萃取法衍生出的水提醇沉法、醇提水沉發(fā)及油溶萃取法等較為方便實用。

1 材料與試劑

1.1 實驗用細胞

巨噬細胞。

1.2 檢測試劑

純化水(自制)、乙醇(分析純)、GTCC(Croda Singapore Pte Ltd)、馬尾松花粉(采摘自浙江的千島湖)、IL-1βELISA測定試劑盒(聯(lián)科生物技術(shù)有限公司)。

2 提取工藝

2.1 醇提醇沉

①提取劑為75%乙醇，按照松花粉：乙醇料液比1∶30進行投料，50℃、40W、40KHz超聲回流提取2h；

②過濾后對濾渣進行二次提取，收集兩次濾液；

③60℃減壓濃縮至浸膏狀態(tài)，加入濃縮液重量3.5倍的濃度95wt%乙醇，攪拌5min，靜置醇沉12h；

④醇沉液過濾，濾液60℃減壓濃縮至浸膏狀態(tài)，加入濃縮液重量12倍的1,3-丁二醇和濃縮液重量2倍的純化水，再加入濃縮液重量0.02倍MTI，得松花粉提取物。

2.2 水提醇沉

①提取劑為去離子水，按照松花粉∶水料液比1∶30進行投料，50℃、40W、40KHz超聲回流提取2h；

②過濾后對濾渣進行二次提取，收集兩次濾液；

③60℃減壓濃縮至浸膏狀態(tài)，加入濃縮液重量3.5倍的濃度75wt%乙醇，攪拌5min，靜置醇沉12h；

④醇沉液過濾，濾液60℃減壓濃縮至浸膏狀態(tài)，加入濃縮液重量3.5倍的濃度95wt%乙醇，攪拌5min，靜置醇沉12h；

⑤醇沉液過濾，對濾渣噴淋無水乙醇，對濾渣進行冷凍干燥，研磨成粉，即為松花粉水提物,。

2.3 GTCC提取

①提取劑為GTCC(辛酸/癸酸甘油酯)，按照松花粉∶GTCC料液比1∶10進行投料，50℃、40W、40KHz超聲回流提取2h；

②過濾后對濾渣進行二次提取，料液比1∶8，收集兩次濾液；

③加入濾液量0.4%wt的苯氧乙醇，攪拌均勻后再次過濾，即為松花粉GTCC提取物。

3 實驗方法

3.1 待檢原料的溶液配制

①配制1%濃度的待檢原料溶液

原液經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾除菌后，取100μl到9.9ml無菌超純水中

②配制工作濃度(萬分之一)的待檢原料溶液

取以上配制好的1%濃度的待檢原料溶液40μl，加3960μl培養(yǎng)液中，0.22μm微孔濾膜過濾除菌。

3.2 標準曲線的繪制

①濃縮的IL-1β標準品150μl加上150μl細胞瓶培養(yǎng)基，作為標準曲線的最高濃度(500pg/ml)。

②在每一個試管中加入150μl的細胞培養(yǎng)基。使用標準品的最高濃度做1:1系列稀釋。

③移液，確保充分混勻，細胞培養(yǎng)基作為標準曲線的零濃度。

4 數(shù)據(jù)

4.1 標準曲線制作

表1 不同濃度標準品OD值測定

4.2 不同樣品處理后的OD值的測定

使用酶標儀主波長450nm，次波長630nm檢測出OD值，根據(jù)標準曲線公式：

OD=0.714n(濃度)-1.398

計算出原液樣品稀釋萬分之一后，其中含有1L-1β細胞因子的濃度見表2。

表2 培養(yǎng)上清的OD值

5 結(jié)果與分析

5.1 酶標儀檢測后所有樣品的OD值都比對照組偏低，說明松花粉提取物對抑制1L-1β細胞因子的作用較明顯。

5.2 根據(jù)標準曲線計算出對照組和加樣組后的1L-1β細胞因子濃度趨勢，與對照組相比抑制率依次為樣品2(10.81%)>樣品1(10.25%)=樣品3(10.25%)。

5.3 由此可見對比以上三種常用的馬尾松花粉提取工藝，水提醇沉法更能保留其活性成分并在功效作用發(fā)揮方面具有更高的作用價值。

6 結(jié)論

巨噬細胞屬于免疫細胞，參與到人體非特異性防衛(wèi)(先天性免疫)和特異性防衛(wèi)(細胞免疫),它們的主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行噬菌作用，并激活淋巴球或其他免疫細胞，令其對病原體做出反應(yīng)[3]。

1L-1β是由活化的免疫細胞和一些基質(zhì)細胞分泌的，具有多種生物活性，能介導(dǎo)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的小分子蛋白質(zhì)和多肽，是一類非特異性物質(zhì)[4]。1L-1β主要有單核-巨噬細胞產(chǎn)生，可刺激B細胞分化和分泌抗體，并刺激T細胞分化1L-2及干擾素C產(chǎn)生，刺激中性粒細胞，提高NK細胞殺傷活性，增強機體免疫功能，1L-1β還有拮抗RV的作用[5]，使用1L-1βELISA試劑盒和酶標儀可以快速有效的檢測原料提取物對巨噬細胞分泌1L--1β細胞因子的影響，從而測試其在抗炎功效方面的作用，對篩選和驗證功能原料的提取方法具有十分有效。