高榕冬，孫磊龍，章敏敏，彭 驄

（揭陽市疾病預(yù)防控制中心，廣東揭陽 522000）

河豚在世界各地均有分布，我國河豚種類多達(dá)40余種，分布在沿海一帶。由于河豚具有肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，我國在很早以前就有食用河豚的習(xí)俗。日本、韓國等國家將河豚魚加工成各式料理直接食用。河豚魚某些器官組織中具有毒性很強(qiáng)的河豚毒素，若誤食河豚毒素，毒素將作用于人的中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)，從而導(dǎo)致神經(jīng)肌肉麻痹，嚴(yán)重的會導(dǎo)致誤食者死亡。在我國沿海地區(qū)時(shí)常會出現(xiàn)河豚毒素中毒事件，同時(shí)海豚毒素所具有的劇毒特性在軍事、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域也具有十分廣泛的應(yīng)用。目前河豚毒素檢測有生物測定法、免疫化學(xué)法、儀器分析法等，但是這些檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，不能很好地滿足河豚毒素的法醫(yī)鑒定、臨床診斷救治、食品安全監(jiān)控等要求[1-3]。隨著液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定技術(shù)的不斷成熟，將該技術(shù)應(yīng)用于中毒樣品中河豚毒素的測定，可以有效滿足實(shí)際需求[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品（純度為99.3%，Aifa Scientific Co）。甲醇（色譜純），德國默克；乙腈（色譜純），德國默克；甲酸（優(yōu)級純），阿拉丁科技有限公司；乙酸（優(yōu)級純），廣州化學(xué)試劑廠；乙酸銨（優(yōu)級純），廣州化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIEX 5500+液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國SCIEX，技術(shù)指標(biāo)如表1、表2所示。PT-MR2100均質(zhì)機(jī)，德國IKA；MSI旋渦混勻器，德國IKA；H2050R醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

表1 SCIEX 5500+液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀液相技術(shù)指標(biāo)表

表2 SCIEX 5500+液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜技術(shù)指標(biāo)表

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 配制工作溶液

選取1 mg的河豚毒素對照品，用甲醇進(jìn)行溶解配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，溶液濃度為100 mg·L-1，同時(shí)將標(biāo)準(zhǔn)溶液放置在4 ℃的冰箱內(nèi)存放。將河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到空白的魚肉與魚肝中，獲得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1～10.0 mg·kg-1實(shí)驗(yàn)樣品，按照樣品處理的方式進(jìn)行處理，然后進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測定河豚毒素。

1.3.2 樣品前處理

（1）河豚魚。①用天平稱取2.0 g魚肉或者魚肝樣品，將樣品切碎放置到50 mL的離心管中，同時(shí)加入5 mL甲酸-甲醇溶液（1+99）攪拌均勻。②將其放入80 ℃的水浴鍋中加熱10 min，選擇離心速度為10 000 r·min-1的離心機(jī)離心5 min，同時(shí)用吸管吸取上層的清液2.5 mL。③對溶液的pH值進(jìn)行調(diào)整，確保溶液pH在6～8，同時(shí)在溶液中加入40 mg的木瓜蛋白酶。④將溶液進(jìn)行充分混合之后放置到55 ℃的水浴中進(jìn)行水解2 h。離心速度為10 000 r·min-1的離心機(jī)中離心10 min，然后采用吸管吸取上層的清液2 mL，將其放置到另外一個(gè)離心管中。在該離心管中加入2 mL的石油醚并振蕩30 s，進(jìn)行離心操作將有機(jī)相舍棄。⑤將1 mL的樣品提取液上樣到經(jīng)過甲醇和水活化后的固相萃取柱后，依次采用3 mL的水溶液、3 mL的甲醇溶液淋洗萃取柱。通過真空抽取的方式來抽干萃取柱1 min，然后采用3 mL含有2%三氟乙酸的水溶液進(jìn)行洗脫處理。⑥采用吸管吸取 2 mL洗脫液，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干之后，用1 mL的甲酸-甲醇溶液（1+9）溶解殘?jiān)?.22 μm的濾膜進(jìn)行過濾處理，最后對處理后的溶液進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析。

（2）血樣。全血樣于冷凍離心機(jī)離心3 min，取上層血清（或血漿）0.1 mL至塑料離心管中，加入 0.9 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，于冷凍離心機(jī) 10 000 r·min-1離心5 min，上清液全部轉(zhuǎn)移至另一塑料離心管，下層加入0.9 mL乙腈再提取1次，合并乙腈層，提取液置于40 ℃氮吹儀上吹干，準(zhǔn)確加入0.50 mL乙腈復(fù)溶剩余物，過0.22 μm濾膜后上液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

（3）尿樣。靜置，過0.22 μm濾膜后直接上液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析。

（4）洗 胃 液/嘔 吐 物。洗 胃 液/嘔 吐 物 于 5 000 r·min-1離心3 min，取上清液2 mL，加適量氯化鈉，加2 mL乙腈，以下前處理步驟同血樣處理。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

（1）色譜條件。色譜柱選擇Phenomenex Kinetex C18（100 mm×3.0 mm，2.6 μm），流動相的流速為 0.2 mL·min-1，色譜柱室溫范圍為20～25 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，表3為梯度洗脫程序。

表3 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。質(zhì)譜條件為電噴霧正離子源，電離電壓為4.5 kV，毛細(xì)管的溫度為350 ℃，碰撞的能量為25 eV，鞘氣流為1.4 bar，輔助氣流為 0.003 L·min-1，采用MS1、MS2、MS3全掃描質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。在上述色譜、質(zhì)譜條件下對質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，將河豚毒素的母離子與兩個(gè)子離子組成兩對母離子/子離子對，具體如圖1所示。

圖1 河豚毒素二級質(zhì)譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理方式選擇

一般而言，含復(fù)雜基質(zhì)樣品并不能直接進(jìn)行液相色譜質(zhì)譜分析，必須經(jīng)過處理將樣品中的內(nèi)源性蛋白、脂質(zhì)、鹽類等各種雜質(zhì)去除。目前對生物樣品的處理主要有液液萃取、固相萃取、蛋白質(zhì)沉淀等方法，考慮到河豚毒素具有比較強(qiáng)的極性，不溶于弱極性有機(jī)溶劑，能溶于pH值為3～7的弱酸性水溶液，因此采用固相萃取的方式來對含復(fù)雜基質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)處理。采用固相萃取對生物樣品進(jìn)行前處理主要包括選擇蛋白沉淀劑、確定蛋白沉淀劑和樣品的比例等多個(gè)方面的內(nèi)容，通過科學(xué)選擇蛋白沉淀劑以及合理確定蛋白沉淀劑與樣品的比例來優(yōu)化樣品處理方法。通過比較不同沉淀劑對蛋白的沉淀效果，發(fā)現(xiàn)1%的甲酸甲醇溶液沉淀效果最好；血樣、尿液、胃液可通過靜置、離心、乙腈提取的方法得到較滿意的結(jié)果。

2.2 色譜柱選擇

河豚毒素分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)具有比較高的極性和水溶性，如果采用離子對色譜法進(jìn)行分離，就無法使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析儀，方法中采用由美國菲羅門公司生產(chǎn)的Kinetex系列C18的液相色譜柱，該色譜柱具有更高的靈敏度和分離度，線性速度和耐壓范圍更寬，對各種生物性樣品，如血液、尿液、胃液等具有更強(qiáng)的適應(yīng)性。通過一定比例的梯度洗脫程序，能夠有效使得親水性物質(zhì)和雜質(zhì)做到完全分離。實(shí)際的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明選擇Phenomenex Kinetex能夠取得良好的效果。

2.3 河豚毒素測定方法選擇

在空白血液中添加10 ng·mL-1河豚毒素，對添加河豚毒素的空白血液進(jìn)行多反應(yīng)監(jiān)測，獲得多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖，如圖2所示。

圖2 多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖（空白血液添加10 ng·mL-1河豚毒素）

用吸管吸取空白的血液和尿液，對血液和尿液樣品進(jìn)行預(yù)處理，并進(jìn)行空白血液和尿液的多反應(yīng)監(jiān)測，獲得多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖，如圖3所示。由圖3可知，空白血液河豚毒素出現(xiàn)波峰的地方（2 min處），檢測色譜強(qiáng)度比較大，未出現(xiàn)比較大的響應(yīng)；空白尿液河豚毒素出現(xiàn)波峰的地方（7 min處），檢測色譜強(qiáng)度比較大。由此可知空白基質(zhì)不會產(chǎn)生干擾，河豚毒素測定方法選擇是良好的。

2.4 線性關(guān)系

在空白的血液、尿液、胃液中加入適量的河豚毒素，將其配制成含有河豚毒素2～100 ng·mL-1的血液、尿液、胃液樣品，并且對血液、尿液、胃液樣品進(jìn)行分析處理。以河豚毒素含量作為橫坐標(biāo)，峰面積作為縱坐標(biāo)，對峰面積y與河豚毒素含量x之間的關(guān)系采用最小二乘法進(jìn)行回歸分析。定義檢出限為河豚毒素定性離子對峰強(qiáng)度信噪比大于3的含量，定量限為河豚毒素定性離子對峰強(qiáng)度信噪比大于10的含量。表4為血液、尿液、胃液3種基質(zhì)中河豚毒素測定結(jié)果。由表4可知，血液、尿液、胃液中河豚毒素在線性范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，能夠有效滿足對生物檢材河豚毒素測定的分析 要求。

表4 血液、尿液、胃液3種基質(zhì)中河豚毒素測定結(jié)果

2.5 精密度分析

在化學(xué)實(shí)驗(yàn)中多次測定值之間的接近程度被稱為精密度，通過精密度能夠有效反映測定結(jié)果重現(xiàn)性的優(yōu)良。為了對中毒樣品中河豚毒素測定精密度分析，分別在空白血液、尿液、胃液中加入適量的河豚毒素，配制成含有河豚毒素的低質(zhì)量濃度（8 ng·mL-1）的血液、尿液、胃液，含有河豚毒素的中質(zhì)量濃度 （50 ng·mL-1）的血液、尿液、胃液，含有河豚毒素的高質(zhì)量濃度（80 ng·mL-1）的血液、尿液、胃液各10份，并且對不同質(zhì)量濃度的血液、尿液、胃液進(jìn)行預(yù)處理。根據(jù)當(dāng)天標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算不同樣品中的河豚毒素含量，獲得10份樣品的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，將其作為日內(nèi)精密度值。采用同樣的實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)測定3 d，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，將該數(shù)值作為日間精密度值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 血液、尿液、胃液3種基質(zhì)河豚毒素精密度

由表5可知，不論是血液、尿液還是胃液，伴隨著河豚毒素添加量的增加，其日內(nèi)精密度值和日間精密度值均呈現(xiàn)下降的趨勢，即生物基質(zhì)中河豚濃度越高，其多次測定值之間的接近程度越高；生物基質(zhì)中河豚毒素濃度越低，其多次測定值之間的接近程度越低。

2.6 回收率與基質(zhì)效應(yīng)

采取和精密度分析一樣的方法來制備血液、尿液、胃液，并對制備的樣品進(jìn)行預(yù)處理。采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀測定河豚毒素的峰值面積A1，相同基質(zhì)的空白樣品經(jīng)過預(yù)處理后，在經(jīng)溶劑吹干的殘留物中加入河豚毒素對照品，制備相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶液，采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀測定河豚毒素的峰值面積A2，那么提取回收率為

另外，取相同量的對照品溶液吹干，采用流動相定容法進(jìn)行采樣，通過液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析儀測定目標(biāo)物的峰面積A3，那么基質(zhì)效應(yīng)為

河豚毒素具有相對比較強(qiáng)的極性，其只能溶于弱酸性的水溶液，這使得不同生物樣品的雜質(zhì)溶得比較多，從而出現(xiàn)比較大的基質(zhì)抑制效應(yīng)，詳見表6。另外，在蛋白沉淀的過程中河豚毒素的溶解性相對比較差，很容易被已經(jīng)沉淀的蛋白質(zhì)雜質(zhì)吸附，這也將對河豚毒素的提取回收率產(chǎn)生一定的影響。

表6 血液、尿液、胃液3種基質(zhì)河豚毒素的回收率與基質(zhì)效應(yīng)

3 結(jié)論

河豚毒素作為小分子化合物中劇毒的非蛋白質(zhì)神經(jīng)毒素，在多種海洋生物體中廣泛存在。本文通過對血液、尿液、胃液、魚樣等生物樣品進(jìn)行靜置離心、乙腈提取、固相萃取等方法處理，采用Phenomenex Kinetex C18色譜柱進(jìn)行分離，構(gòu)建了采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定河豚毒素的方法。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便快捷等優(yōu)點(diǎn)，為生物材料以及各種水產(chǎn)品中河豚毒素的測定提供科學(xué)依據(jù)。