晉 彪張 靜洪坤強(qiáng)王智文陳 濤?

嗜鹽微生物(Halophiles)是六大極端微生物的一種[1],其正常的生長需要較高的鹽濃度來維持。相比于其他常見底盤微生物,嗜鹽菌的高耐鹽特性使其在培養(yǎng)過程中不易染菌,可以進(jìn)行不嚴(yán)格的滅菌發(fā)酵[2],下游提取胞內(nèi)PHB 產(chǎn)物時,加入適量清水即可實現(xiàn)細(xì)胞破壁,在節(jié)約能耗的同時,也簡化了發(fā)酵工藝。 但嗜鹽微生物的遺傳背景不清晰、基因編輯難度大制約了其發(fā)展。 自新疆艾丁湖分離純化得到的嗜鹽菌TD01(Halomonassp. TD01),最適生長溫度37 ℃,最適生長鹽濃度為60 g·L-1NaCl,最高可耐受250 g·L-1NaCl,是1 株中度嗜鹽菌并可天然生產(chǎn)聚3-羥基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrate,PHB)[3]。 CRISPR/Cas9 基因編輯系統(tǒng)[4]、組成型啟動子庫PPorin[5]、誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)[6]等基因編輯手段在Halomonassp. TD01 中的成功應(yīng)用,為其作為下一代工業(yè)生物技術(shù)的底盤細(xì)胞打下堅實基礎(chǔ)。

聚羥基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHA)是一類由含羥基脂肪酸單體聚合而成的生物大分子聚合物,無毒無害可再生,具有生物相容性、可降解性和良好的物化特性[7],在生物塑料[8]、藥物緩釋載體、植入性材料[9]等領(lǐng)域擁有廣泛前景[10]。 聚3-羥基丁酸酯由3-羥基丁酸聚合而成,是結(jié)構(gòu)最簡單,研究最清楚的PHA。

乙酸作為一種二元弱酸,不僅常作為生物發(fā)酵時產(chǎn)生的副產(chǎn)物,還廣泛存在于各種纖維素水解液中[11]。 乙酸鈉的價格比葡萄糖每噸低150 美元左右[12],研究表明,利用廉價的乙酸鹽代替葡萄糖進(jìn)行如異丙醇[13]、乙醇酸[14]等高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)是具有一定潛力的。 但高濃度的乙酸根和鹽離子會抑制菌體生長,降低產(chǎn)量和產(chǎn)率,因此提高工程菌株對乙酸鹽的耐受和利用效率至關(guān)重要。

本研究測試發(fā)現(xiàn)Halomonassp. TD1.0 具有天然耐受高濃度乙酸鈉的優(yōu)勢,并可利用乙酸高效合成PHB。 隨后我們通過過表達(dá)枯草芽孢桿菌來源的乙酰輔酶A 合成酶(ACS)進(jìn)一步提高了菌株的乙酸利用速度和PHB 產(chǎn)量,并初步研究了ACS 的表達(dá)對TD1.0 利用葡萄糖和乙酸鈉混合碳源進(jìn)行代謝的影響。

1 實驗部分

1.1 菌株和質(zhì)粒

菌株和質(zhì)粒見表1。

表1 菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

1.2 培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基:5 g·L-1酵母抽提物,10 g·L-1胰蛋白胨,10 g·L-1氯化鈉,pH=7.0。 需要時額外添30 μg·mL-1相應(yīng)抗生素。 固體培養(yǎng)基添加2%的瓊脂。

20LB 培養(yǎng)基:LB 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上把氯化鈉濃度提到20 g·L-1。

60LB 培養(yǎng)基:LB 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上把氯化鈉濃度提到60 g·L-1,pH 值調(diào)至9.0。

60MMG 發(fā)酵培養(yǎng)基:60 g·L-1NaCl,1 g·L-1酵母抽提物,20 g·L-1葡萄糖或27.3 g·L-1NaAC,9.85 g·L-1Na2HPO4·12H2O,1.5 g·L-1KH2PO4,1 g·L-1NH4Cl,0.4 g·L-1MgSO4·7H2O,0.05 g·L-1Fe(Ⅲ)-NH4-Citrate,0.02 g·L-1CaCl2·2H2O,0.1 mg·L-1Zn-SO4·7H2O,0.03 mg·L-1MnCl2·4H2O,0.3 mg·L-1H3BO3,0.2 mg·L-1CoCl2·6H2O,0.01 mg·L-1CuSO4·5H2O,0.02 mg·L-1NiCl2·6H2O,0.03 mg·L-1NaMoO4·2H2O。

1.3 引物設(shè)計

引物設(shè)計見表2。

表2 引物設(shè)計Table 2 Primers used in this study

1.4 質(zhì)粒的構(gòu)建

一般高拷貝表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:將枯草芽孢桿菌屬來源的acs基因序列,根據(jù)嗜鹽單胞菌的密碼子偏愛性進(jìn)行優(yōu)化,并由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行基因合成,合成的acs基因連接至pU17 獲得pU17-acs。 以 pU17-acs為模板, 采用引物 ACSPN59-M-F 和ACS-PN59-M-R,PCR 擴(kuò)增得到acs 片段(引物2 端分別帶有與質(zhì)粒骨架有互補(bǔ)的25 bp序列)。 以攜帶誘導(dǎo)型啟動子PMmp1的高拷貝質(zhì)粒pN59-pSEVA341[16]為模板,采用引物PN59-M-ACSF 和PN59-M-ACS-R,PCR 擴(kuò)增得到質(zhì)粒骨架(2 端有25bp 與ACS 互補(bǔ)的序列)。 將得到的目標(biāo)片段和質(zhì)粒骨架,采用Gibson 組裝試劑盒(NEB 公司),進(jìn)行無縫融合。 誘導(dǎo)型低拷貝穿梭質(zhì)粒pN85-pSEVA321[17]以同樣的方法進(jìn)行構(gòu)建,基因acs的擴(kuò)增引物采用ACS-PN85-M-F 和ACS-PN85-M-R,質(zhì)粒pN85-pSEVA341 的擴(kuò)增引物采用PN85-M-ACS-F 和PN85-M-ACS-R。

1.5 接合轉(zhuǎn)化的方法

E. coliDH5α 的化轉(zhuǎn)和E. coliS17-1 的電轉(zhuǎn)方法參照Ma 等[17]方法。 接合轉(zhuǎn)化方法同Ye 等[18]。最終接合菌體用無抗60LB 重懸菌體后涂布到加有30 μg·mL-1氯霉素抗性的 60LB 平板上,37 ℃培養(yǎng)48 h,獲的單菌落進(jìn)行菌落PCR 驗證得到正確的轉(zhuǎn)化菌株。

1.6 提取總蛋白

取適量菌液,離心去上清,洗滌2 次,100 ℃煮10 min,離心取上清,進(jìn)行SDS-PAGE 分析。

1.7 搖瓶發(fā)酵

將菌株在60LB 平板上劃線,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落接種至60LB,37 ℃,220 r·min-1下培養(yǎng)12 h,連續(xù)活化2 次。 最后將二級活化種子液接種到60 MMG(Glu/NaAC)發(fā)酵培養(yǎng)基(50 mL/500 mL錐形瓶)中,接種量為0.25(OD600),需要時添加30 μg·mL-1氯霉素抗性,和1 mmol·L-1誘導(dǎo)物IPTG(OD600為0.4～0.6 時添加),在37 ℃,220 r·min-1條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.8 發(fā)酵液分析與產(chǎn)物測定

細(xì)胞OD600值使用紫外可見分光光度計測定。葡萄糖和乙酸鈉濃度使用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測,色譜柱型號HPX87H-安捷倫,流動相為5 mmol·L-1H2SO4,流速0.5 mL·min-1,柱溫60 ℃,檢測器為示差 RID 檢測器。

細(xì)胞干質(zhì)量測量:取適量發(fā)酵菌體,離心去上清,- 80 ℃超低溫冰箱內(nèi)冷凍12 h,采用德國CHRIST 公司的冷凍干燥機(jī)凍干12 h,精密電子天平測量細(xì)胞干質(zhì)量。

PHB 產(chǎn)物分析:稱取20 mg 左右干菌體和適量PHB 標(biāo)品,置于耐高溫封閉性好的酯化管中,加入1.5 mL 酯化液(485 mL 甲醇,15 mL 濃硫酸,0.25 g苯甲酸)和1.5 mL 三氯甲烷,100 ℃酯化4 h。 向酯化后的體系中加入1 mL 雙蒸水,震蕩混勻,靜置分層,取下層有機(jī)相用于氣相色譜的檢測。 色譜條件為:N2載氣,H2燃燒氣體,流速30 mL·min-1,空氣400 mL·min-1,柱子為安捷倫HP-5,氣相程序:進(jìn)樣口溫度240 ℃,檢測器溫度250 ℃,初始溫度80 ℃,維持1.5 min,30 ℃·min-1升溫至140 ℃,40 ℃·min-1升溫至240 ℃,維持2 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 TD1.0 對乙酸鈉的利用和耐受性測試

為表征嗜鹽單胞菌TD1.0 對乙酸鈉的利用和耐受能力,60 MMG 為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,以25、50、75、100 g·L-1的乙酸鈉代替葡萄糖為碳源進(jìn)行生長測試。 菌株在不同濃度乙酸鈉為碳源條件下的生長曲線見圖1。

圖1 NaAC 耐受測試Fig.1 Tolerance of NaAC

由圖1 可知,TD1.0 在高濃度乙酸鈉(25 ～100 g·L-1)的碳源下均可以生長,其中在25 g·L-1乙酸鈉為碳源下長勢最好,最高生物量達(dá)到了16.8(OD600)。 但隨著乙酸鈉濃度的提高,菌株生長受到了抑制,濃度越高,抑制程度越明顯。 在生長前期(12 h 內(nèi)),100 g·L-1乙酸鈉條件下,培養(yǎng)12 h OD600僅從0.25 長到0.87,而此時以25 g·L-1乙酸鈉為碳源的菌株OD600已經(jīng)達(dá)到了5.48。 培養(yǎng)72 h,TD1.0 在100 g·L-1NaAC 中最大OD600為9.1,相比于在25 g·L-1乙酸鈉實驗組,其生長抑制率達(dá)到45.8%,而大多數(shù)微生物在乙酸鹽濃度超過 0.5 g·L-1時,其生長就會受到嚴(yán)重抑制[19]。 以上結(jié)果表明嗜鹽單胞菌TD1.0 具有天然的利用和耐受高濃度乙酸鈉的生理優(yōu)勢,為后續(xù)開發(fā)嗜鹽單胞菌利用廉價的乙酸鹽代替葡萄糖生產(chǎn)相關(guān)化學(xué)品具有巨大潛力。

2.2 過表達(dá)ACS 對乙酸利用和PHB 合成的影響

在嗜鹽菌中,以葡萄糖和乙酸鈉為碳源合成PHB 的途徑如圖2 所示。 葡萄糖經(jīng)過糖酵解途徑轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A,乙酸鈉經(jīng)過乙酰-CoA 合成酶(ACS)得到乙酰輔酶A,其中一部分乙酰-CoA 進(jìn)入TCA 循環(huán),另一部分在乙酰-CoA 乙?；D(zhuǎn)移酶(PhaA)的作用下生成乙酰乙酰-CoA,繼而在3-羥基丁酰-CoA 脫氫酶(PhaB)的作用下生成3-羥基丁酰-CoA,最終在聚羥基脂肪酸酯合成酶(PhaC)的作用下生成聚3-羥基脂肪酸酯(PHB)。

圖2 PHB 的生產(chǎn)途徑Fig.2 Biosynthesis pathway of PHB

為進(jìn)一步強(qiáng)化嗜鹽單胞菌利用乙酸鈉的優(yōu)勢,本實驗構(gòu)建了以高拷貝acs表達(dá)載體pN59-M-ACS和低拷貝acs表達(dá)載體pN85-M-ACS。 通過接合轉(zhuǎn)化將2 種質(zhì)粒分別導(dǎo)入TD1.0 后得到菌株TDPN59 和TD-PN85,SDS-PAGE 分析的ACS 蛋白表達(dá)見圖3,TD-PN59 和TD-PN85 中ACS 蛋白(65 kDa)均可正常表達(dá),且高拷貝表達(dá)菌株TD-PN59 的ACS蛋白條帶較TD-PN85 更為明顯,表明表達(dá)載體拷貝數(shù)越高,ACS 的表達(dá)量就越多。

圖3 菌株TD-PN59 和TD-PN85 胞內(nèi)ACS 的PAGE 檢測Fig.3 ACS expression in strain TD-PN59 and TD-PN85

進(jìn)一步對TD-PN59 和TD-PN85 進(jìn)行乙酸鈉為單一碳源搖瓶生長測試,其中乙酸鈉濃度為27.3 g·L-1為碳源,對照組以20 g·L-1葡萄糖(碳物質(zhì)的量等價于27.3 g·L-1乙酸鈉)為單一碳源。 以TD1.0 為對照菌株,以初始OD600=0.25 進(jìn)行接種,其中TD-PN59和TD-PN85 菌株在OD600長至0.4 ～ 0.6 時添加1 mmol·L-1的IPTG 誘導(dǎo)ACS 表達(dá)。 37 ℃,200 r·min-1培養(yǎng),間隔取樣測定碳源剩余量、生物量(OD600)(圖4)和胞內(nèi)PHB 產(chǎn)量(圖5)。

圖4 導(dǎo)入不同拷貝數(shù)ACS 菌株的生長情況Fig.4 Growing status of different strains

圖5 導(dǎo)入不同拷貝數(shù)ACS 菌株的CDW 和PHB 產(chǎn)量Fig.5 CDW and PHB content of different strains

由圖4 和圖5 可知,TD1.0 菌株以葡萄糖為碳源時,前期生長階段(<12 h),生長迅速,優(yōu)于乙酸鈉,最高 OD600為26;以乙酸鈉為碳源雖前期生長速度慢于葡萄糖,但培養(yǎng)12 h 后,乙酸鈉利用加快,最大值達(dá)到30.57(OD600),優(yōu)于葡萄糖為碳源的生長(圖4)。 代謝葡萄糖的對照組pH 值從最初的9.0降到了6.3,代謝乙酸鈉的實驗組pH 值仍維持在9.0 左右,這說明代謝葡萄糖會產(chǎn)生大量的酸性代謝副產(chǎn)物,對菌株生長產(chǎn)生抑制作用[20],而代謝乙酸鈉時能維持堿性環(huán)境從而有利于細(xì)胞在發(fā)酵后期的生長。 TD1.0 以葡萄糖為碳源在42 h 達(dá)到最大細(xì)胞干質(zhì)量(CDW),為9.87 g·L-1,PHB 產(chǎn)量為6.12 g·L-1,PHB 胞內(nèi)產(chǎn)物占比0.62 g/g(PHB/干菌體)。 以乙酸鈉為碳源時,TD1.0 可在36 h 內(nèi)完全消耗完乙酸鈉,并在48 h 時達(dá)到9.6 g·L-1的最大細(xì)胞干質(zhì)量,PHB 產(chǎn)量和胞內(nèi)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5.86 g·L-1和61%。

含高拷貝質(zhì)粒pN59-M-ACS 的菌株TD-PN59約30 h 消耗完乙酸鈉,并在36 h 時達(dá)到31.5 的最大細(xì)胞OD600值,發(fā)酵過程中的最大和平均乙酸鹽利用速率為1.47 (9～12 h)和 0.91 g·L-1·h-1,比TD1.0 分別提高 37.4%[1.07 g·L-1·h-1(9～12 h)]和19.7%(0.76 g·L-1·h-1)。 菌株TD-PN59 的細(xì)胞干質(zhì)量也有輕微提升,發(fā)酵42 h 時達(dá)到9.98 g·L-1,PHB 的產(chǎn)量和胞內(nèi)含量分別為6.49 g·L-1和65%,PHB 產(chǎn)量相比于TD1.0 利用乙酸鈉為碳源提高(5.86 g·L-1)了約11%,比TD1.0 利用葡萄糖為碳源(6.12 g·L-1)提高了約6%。 含低拷貝質(zhì)粒pN85-M-ACS 的菌株TD-PN85 在42 h 時達(dá)到最大細(xì)胞OD600值(30.24),其最大乙酸鈉利用速率為1.20 g·L-1·h-1(9～12 h),相比于野生型提高了12%,但平均乙酸鈉利用速率未見明顯提升。 TD-PN85 利用乙酸鈉時的PHB 產(chǎn)量為6.01 g·L-1,此時細(xì)胞干質(zhì)量為9.7 g·L-1,PHB 含量為62%。

20 g·L-1的葡萄糖和27.3 g·L-1的乙酸鈉含有相同的碳摩爾數(shù)(約0.667 mol·L-1)。 當(dāng)菌株TD1.0 以葡萄糖為底物時,其合成PHB 的碳摩爾轉(zhuǎn)化率為42.7% C-mol;以乙酸鈉為底物時的PHB 碳摩爾轉(zhuǎn)化率為40.9% C-mol;工程菌TD-PN59 以乙酸鈉為底物時合成PHB 的碳摩爾轉(zhuǎn)化率為45.3%C-mol,相比于TD1.0 利用葡萄糖或乙酸鈉時分別提升了6.1%和10.8%。

上述結(jié)果表明,以廉價乙酸鹽替代葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)PHB 是可行的,并且通過過表達(dá)ACS,不僅可以提高TD1.0 的乙酸鈉利用速率,還可提高細(xì)胞干質(zhì)量和PHB 的產(chǎn)量。 葡萄糖需要經(jīng)過整個EMP 途徑代謝后才能轉(zhuǎn)化為PHB 的前體物乙酰輔酶A,而乙酸進(jìn)入細(xì)胞后僅需一步反應(yīng)就可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A(圖2),因此以乙酸為碳源合成PHB 時在乙酰輔酶A 供應(yīng)方面具有獨特的優(yōu)勢。 除了過表達(dá)ACS 之外,在后續(xù)的工作中還可以通過激活乙醛酸循環(huán)[21]和實驗室適應(yīng)性進(jìn)化[22]等策略提進(jìn)一步提高乙酸鹽的利用效率。

2.3 葡萄糖與乙酸鈉混合碳源發(fā)酵

隨后考察了ACS 表達(dá)對菌株代謝葡萄糖和乙酸鈉混合碳源(60 MMG,10 g·L-1葡萄糖和10 g·L-1乙酸鈉)的影響,結(jié)果如圖6 所示。

圖6 混合碳源條件下菌株碳源消耗和生長曲線Fig.6 OD600 and the consistence of Glu/NaAC

TD1.0 在代謝葡萄糖和乙酸鈉混合碳源時表現(xiàn)出明顯的代謝物阻遏效應(yīng)[23],即先利用葡萄糖后利用乙酸鈉的特征,由于生長前期只快速利用葡萄糖而造成代謝溢流現(xiàn)象,生成了乙酸副產(chǎn)物而使得培養(yǎng)基中乙酸鈉含量略有上升(最高至10.52 g·L-1),待葡萄糖濃度較低(<4 g·L-1)時,逐漸開始利用乙酸鈉,最終在28 h 時完全消耗完2 種碳源。 與野生型TD1.0 相比,過表達(dá)ACS 的菌株TD-PN85 在生長前期葡萄糖利用較緩,但卻具有明顯的葡萄糖和乙酸鈉共利用的特征,且沒有發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中因利用葡萄糖而導(dǎo)致乙酸增加的現(xiàn)象,說明表達(dá)ACS 后導(dǎo)致乙酸利用效率提升而快速消耗掉葡萄糖產(chǎn)生的乙酸,最終在培養(yǎng)26 h 時能夠完全消耗完2 種碳源,最大細(xì)胞OD 為39.68,高于TD1.0(35.62)。 在整個發(fā)酵過程中,TD-PN85 菌株雙碳源共利用的最大速率為1.63 g·L-1·h-1(12 ～ 14 h),比TD1.0(1.08 g·L-1·h-1,6～8 h)提高了約51%。 同樣地,我們也進(jìn)行了TD-PN59 的混合碳源生長實驗,但因為拷貝數(shù)過高,給菌株帶來了巨大的代謝負(fù)擔(dān),延緩了菌株生長,葡萄糖和乙酸利用速率均大幅降低。

由圖7 可知,菌株TD-PN85 的CDW 和PHB 產(chǎn)量均略高于對照菌株TD1.0。 在34 h 時,對照菌株TD1.0 利用混糖取得最大CDW 為7.82 g·L-1,PHB產(chǎn)量為4.22 g·L-1,含量為54%。 菌株TD-PN85 同樣在34 h 時取得最大CDW 為7.91 g·L-1,PHB 產(chǎn)量為4.43 g·L-1,含量為56%,相比于對照菌株均稍有提升。 與單一碳源相比,2 個菌株在利用葡萄糖/乙酸鈉混合碳源時的PHB 碳摩爾轉(zhuǎn)化率均顯著下降(約為35% C-mol),這很可能是因為等量配比的葡萄糖和乙酸鈉造成了比較顯著的代謝模式轉(zhuǎn)換,從而影響到PHB 的合成效率,后續(xù)研究中需要進(jìn)一步優(yōu)化2 種碳源的比例或添加方式以提高PHB 的合成。

圖7 混合碳源條件下菌株CDW 和PHB 產(chǎn)量Fig.7 CDW and PHB from Glu/NaAC

實驗表明,在嗜鹽菌TD1.0 中,采用質(zhì)粒pN85-M-ACS 過表達(dá)ACS 可以有效緩解葡萄糖代謝物阻遏效應(yīng),促進(jìn)葡萄糖和乙酸鈉的共利用,但PHB 產(chǎn)量并沒有得到顯著提高。

3 結(jié)論

1)嗜鹽單胞菌Halomonassp.TD1.0 可耐受高濃度乙酸鈉,乙酸鈉濃度從25 g·L-1提高至100 g·L-1時對其生長抑制程度只有45.8%,其乙酸鈉耐受性顯著優(yōu)于大腸桿菌等普通模式菌株,并可利用乙酸鈉為單一碳源高效合成PHB。

2)在嗜鹽單胞菌TD1.0 中表達(dá)異源乙酰輔酶A 合成酶后的工程菌TD-PN59 的乙酸鹽平均利用速度提高了19.7%,并且其細(xì)胞干質(zhì)量、PHB 產(chǎn)量和PHB 胞內(nèi)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到9.98 g·L-1,6.49 g·L-1和65%,分別比同樣培養(yǎng)條件下的野生型菌株提高了3.2%,10.8%,和 7.3%。

3)低拷貝量表達(dá)acs可以顯著緩解葡萄糖對乙酸鈉的分解代謝物阻遏效應(yīng)實現(xiàn)葡萄糖和乙酸鈉的共利用。