呂艷秋，徐海峰，曲星霖，張雨陽，李春宇，顧偉玉，金 一*

（1.延邊大學(xué)東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心，吉林延吉 133002；2.長春市第一中等專業(yè)學(xué)校，吉林長春 130000）

延邊黃牛是國家資源保護品種，是中國五大地方精品牛之一，提高延邊黃牛的繁殖力對分子育種計劃十分重要。精液的冷凍和解凍會對精子質(zhì)膜的滲透性、頂體和DNA 的完整性有很大影響，這些變化導(dǎo)致mRNA 和蛋白質(zhì)的降解，從而影響生殖能力[1]。甘油是主要的滲透型冷凍保護劑，保護精子免受冰點以下的熱休克，提供 “鹽緩沖”的機制，可與金屬離子結(jié)合，使細胞脫水，降低冷凍壓力，并減少凝固過程中精子內(nèi)部的冰晶體積，從而防止精子損傷[2-4]。解凍后牛精子活力和受精能力受冷凍保護劑中甘油濃度的影響[5]。研究表明牛精子冷凍保存過程中甘油最佳濃度為6%[6]，但有報道稱甘油會破壞精子的核膜，且濃度高于4%時會影響精子質(zhì)膜流動性[7]，進而導(dǎo)致受精能力下降。

膽固醇是細胞膜的主要結(jié)構(gòu)成分[8]。Mocé 等[9]研究發(fā)現(xiàn)通過添加環(huán)糊精以提高膽固醇:磷脂的比例，和甘油有著相似的作用，即使精子細胞保護免受冰點以下的熱休克。膽固醇負載的環(huán)糊精（CLC）為非滲透型冷凍保護劑，已被廣泛用于公豬[10]、公牛[11]、種馬[12]等動物精子保存，以提高精子活力。本研究在冷凍保護劑中用CLC 替代部分甘油，探究在降低甘油毒性后，不同濃度CLC 對凍融延邊黃牛精子質(zhì)量的影響，為進一步完善牛精子凍融損傷機理和完善冷凍保護液配方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑 微量總RNA、cDNA 和熒光定量PCR提取試劑盒購置美國Thermo Fisher 公司。膽固醇、甲基-β-環(huán)糊精、Tris、檸檬酸鈉、葡萄糖、青霉素、硫酸鏈霉素、甘油、CMA3、七水合磷酸氫二鈉、氯化鎂等試劑購置美國Sigma 公司。

1.1.2 CLC的制備采用Purdy和Graham[13]法制備CLC。簡單地說，將200mg 膽固醇溶解于1 mL 氯仿中，混合后，吸取0.45 mL 加入1 g 甲基-β-環(huán)糊精溶解的2 mL 甲醇溶液中，在電擊儀中完全融合。然后倒入干凈的無菌玻璃血中，放入干燥箱中，37℃烘干。干燥后，取出載有膽固醇的環(huán)糊精（CLC）晶體放入干凈的玻璃瓶中，22℃保存。使用前，將50 mg CLC 加入1 mL TALP[14]溶液中，混勻后使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 精液的收集與冷凍解凍程序 選擇5 頭3～5 歲、健康無疾病的延邊黃?；旌暇?，以消除個體差異，使用假陰道法每周采集2 次，僅收集活力≥85%精液進行試驗。為評價不同濃度的CLC 對牛精子的影響，先配制不含甘油的Tris 稀釋液（Tris 2.42 g、檸檬酸鈉 1.35 g、葡萄糖 1.1 g、青霉素 0.08 g、硫酸鏈霉素 0.1 g 和卵黃20 mL，雙蒸水定容至100 mL），之后將含有甘油和不同濃度CLC 的Tris 稀釋液將精子稀釋至1.2×108個/mL，鮮精組使用PBS 進行稀釋。具體試驗分組為鮮精組、6%甘油對照組（無CLC，甘油6 mL，Tris 稀釋液94 mL）、3%甘油組（無CLC，甘油3mL，Tris稀釋液97mL）和3%甘油+不同濃度CLC組（0.75、1.5、3.0 mg/mL CLC，甘油3 mL，Tris 稀釋液97 mL）。為了使CLC最佳地摻入到精子膜中，用CLC 處理過的樣品在22℃孵育15 min，在精子冷凍前600 r/min 離心8 min 取出CLC，之后再用只含有3%甘油的Tris 稀釋液重懸（不含CLC），為了與處理組一致，對照組使用含有6%甘油的Tris 稀釋液進行相同的處理，使各組精子最終濃度為 80×106個/mL（pH=7.0，300 mOsm）。然后，在室溫22～25℃，將精子樣本灌注到0.25 mL 法式細管，平衡在4℃，3.5 h。在液氮上方5 cm 靜液氮蒸汽中熏蒸8～10 min，然后放入液氮中保存。解凍時將冷凍的細管在37℃的水浴中解凍30 s，用于研究精液的不同參數(shù)。

1.2.2 精子活力的評估 將精子樣品置于已預(yù)熱（37℃）的載玻片上，通過計算機輔助精子運動分析技術(shù)（CASA，中國，同方）對精子進行評估。簡而言之，對于每個樣品，將5 μL 精液放在分析儀的腔室中，該腔室在分析過程中保持在37℃。隨機選擇5 個視野，至少計數(shù)200 個精子，檢測精子活力。

1.2.3 精子頂體完整性的評估 頂體完整性通過考馬斯亮藍染色進行檢測，取100 μL 稀釋后的精液涂于載玻片上，再取1 mL 考馬斯亮藍染色液將精子鋪蓋，避光下染色30 min，隨后鏡檢（400×），至少計數(shù)200 個精子，檢測精子頂體完整率。其中精子頭部受損被認為是頂體不完整的精子，精子頭部完整被認為是頂體完整的精子。

1.2.4 魚精蛋白損失的評估 精液在不含Ca2+和Mg2+的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中洗滌2 次，并在4℃條件下于固定液（甲醇: 冰醋酸=3:1）中固定5 min。涂片，將每張載玻片用100 μL CMA3 染色工作液（在McIlvaine 緩沖液中加入0.25 mg/mL（0.1 mol/L 檸檬酸7 mL +0.12 mol/L 七水合磷酸氫二鈉32.9 mL，pH 7.0，其中包含氯化鎂10 mmol/L）避光染色處理20 min。然后將載玻片在McIlvain 的緩沖液中沖洗并風(fēng)干。隨后鏡檢（400×），至少計數(shù)200 個精子，檢測精子魚精蛋白損失率。其中精子頭部亮綠色熒光染色質(zhì)結(jié)構(gòu)異常被認為魚精蛋白損失，精子頭部暗綠色熒光染色質(zhì)結(jié)構(gòu)正常被認為魚精蛋白未損失。

1.2.5 基因表達量的評估 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（RTqPCR）用于使用寡核苷酸引物序列評估轉(zhuǎn)錄本豐度，所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，所有序列均列于表1。簡而言之，根據(jù)制造商推薦方案使用DynabeadsTMmRNA DIRECT Kit 將用PBS 清洗3次后的精子細胞（1×107個/mL）提取總RNA，并用分光光度計測量其濃度；使用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 合成互補DNA，置于 PCR 儀中，設(shè)置程序為50℃，30 min，85℃，5 min；最后使用Fast SYBRTMGreen Master Mix 制備反應(yīng)體系，每20μL反應(yīng)體系中含cDNA（1 500 ng/μL）2 μL，2×SYBR Green（1X）10 μL，上下游引物各1（10 pmol/L）μL，ddH2O 6 μL。采用PCRmax Eco 48 實時PCR 系統(tǒng)進行RT-qPCR 分析，PCR 擴增步驟為：95 ℃10 min,然后95℃變性15 s，54℃退火15 s，72℃20 s，40 個循環(huán)，每個反應(yīng)體系進行3 次獨立生物學(xué)重復(fù)。并使用公式2-ΔΔCT法計算基因的表達量。

表1 RT-qPCR 引物序列

1.3 統(tǒng)計分析 所有試驗均重復(fù)五次，使用統(tǒng)計學(xué)軟件包SPSS 25.0 進行單因素ANOVN 檢驗。結(jié)果以平均值±標準差表示，當P＜0.05 時，差異為顯著。

2 結(jié)果

2.1 用CLC 替代部分甘油對凍融精子活力、頂體膜完整性和魚精蛋白損失率的影響 如圖1 所示，精子通過色霉素A3（CMA3）和考馬斯亮藍染色。由表2 可以看出，與對照組相比，3%甘油組精子活力和頂體完整性顯著下降，魚精蛋白損失率顯著升高，3%甘油+CLC（0.75、1.5、3 mg/mL）處理組精子活力顯著升高，魚精蛋白損失率顯著下降，且CLC 濃度為1.5 mg/mL 時效果最佳。因此后續(xù)試驗將使用濃度為1.5 mg/mL 的CLC 進行研究。

表2 CLC 替代部分甘油對凍融精子活力、頂體完整性和魚精蛋白損失率的影響

圖1 凍融前后精子魚精蛋白損失和頂體完整性的鏡檢

2.2 用CLC 替代部分甘油對凍融精子魚精蛋白基因的影響 由圖2 可以看出，經(jīng)過凍融處理的精子魚精蛋白基因PRM2和PRM3表達量顯著下降，同時，與對照組相比（1.04%），3% 甘油組PRM2（0.72%）和PRM3（0.56%）表達量顯著下降，3%甘油+1.5 mg/mL CLC組顯著升高（1.92%、1.89%）。

圖2 凍融前后精子PRM2、PRM3 相對表達量

2.3 用CLC 替代部分甘油對凍融精子頂體完整性和氧化應(yīng)激相關(guān)基因的影響 由圖3 可以看出，經(jīng)過凍融處理的精子頂體完整性相關(guān)基因SPACA3表達量顯著降低，氧化應(yīng)激相關(guān)基因ROMO1表達量顯著升高。與對照組相比（1.02%，1.07%），3%甘油組SPACA3（0.94%）表達量顯著下），ROMO1（1.32%）表達量顯著升高，3%甘油+1.5 mg/mL CLC 組SPACA3（1.26%）表達量顯著升高，ROMO1（0.92%）表達量顯著下降。

圖3 凍融前后精子ROMO1、SPACA3 相對表達量

2.4 用CLC 替代部分甘油對凍融精子凋亡相關(guān)基因的影響 由圖4 可以看出，經(jīng)過凍融處理的凋亡相關(guān)基因BCL2和BCL2/BAX表達量顯著降低，BAX表達量顯著升高。與對照組相比（1.06%，1.04%，1.02%），3%甘油組BCL2和BCL2/BAX（0.76%，0.62%）表達量顯著下降，BAX（1.22%）表達量顯著升高；3% 甘油+1.5 mg/mL CLC 組BCL2和BCL2/BAX（1.61%，3.07%）表達量顯著升高，BAX（0.51%）表達量顯著下降。

圖4 凍融前后精子BCL2、BAX、BCL2/BAX 相對表達量

3 討 論

3.1 用CLC 替代部分甘油對凍融精子活力、頂體膜完整性的影響 即使隨著冷凍保存技術(shù)的進步，冷凍保存仍然會對精子造成損害，低溫保存通過對精子膜、細胞骨架、運動器官和細胞代謝等產(chǎn)生影響，降低精子的生育能力[15]。精子的活力、頂體完整性和抗氧化狀態(tài)等各種參數(shù)與生育能力有關(guān)，Shiva 等[16]研究表明所有這些精子屬性都受到凍融過程的影響。Lodhi 等[17]報道解凍后正常形態(tài)精子的活力和膜完整性之間有顯著相關(guān)性。本實驗也得到相同結(jié)果，即經(jīng)過凍融處理的精子活力顯著下降，在3% 甘油中添加1.5 mg/mL 的CLC 后精子的活力和頂體完整性得到顯著改善，且精子活力和頂體完整性均優(yōu)于對照組，結(jié)果說明甘油濃度降低至3%后添加CLC 處理可改善精子活力和頂體功能，同時精子活力提高可能是由于在冷凍過程中精子受到CLC 對精子膜的保護作用。

3.2 用CLC 替代部分甘油對凍融精子魚精蛋白損失率的影響 魚精蛋白（PRM）是精子核中的主要蛋白質(zhì)，在其正常功能中起著重要作用，包括 DNA 的結(jié)合過程[18]。PRM 是在精子發(fā)生階段形成的[19]，在此期間，精子核中發(fā)生蛋白質(zhì)替代過程，在最初支配精子核的組蛋白，通過復(fù)雜的過程被 PRM 取代，例如甲基化、磷酸化和泛素化[18]。PRM 將優(yōu)化包裝精子 DNA 以增加染色質(zhì)凝聚，這將保護父本基因組的遺傳完整性，免受核酸酶、誘變劑和其他可能損害 DNA 的因素的影響。本實驗中，與對照組相比，在3%甘油中添加1.5 mg/mL CLC 的精子魚精蛋白損失率顯著降低。Miikeda 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，牛精子中PRM1、PRM2和PRM3的魚精蛋白表達對精子的正常功能發(fā)揮重要作用，所以3%甘油+1.5 mg/mL CLC 處理組魚精蛋白水平的改善可能是由于魚精蛋白相關(guān)基因起到了絕對的作用，為證實這一研究假設(shè)，本實驗又對魚精蛋白PRM2和PRM3基因進行了檢測。

3.3 用CLC 替代部分甘油對凍融精子魚精蛋白、凋亡、頂體完整性和氧化應(yīng)激基因的影響 精子是一種特殊細胞，其功能取決于蛋白質(zhì)的激活[21]，受精前蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在獲能受精過程中起關(guān)鍵作用[22]。多年來，人們一直認為成熟的精子細胞中不會發(fā)生蛋白質(zhì)翻譯，第一，精子發(fā)生過程中組蛋白被魚精蛋白取代而導(dǎo)致的緊湊的精子核使轉(zhuǎn)錄機制無法進入基因組；第二，大多數(shù)細胞器的損失，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核糖體，限制或阻止了翻譯活動。盡管有這些觀察結(jié)果，但在人類精子中已經(jīng)鑒定出幾種類型的編碼和非編碼 RNA[23]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的精子不僅具有合成線粒體編碼RNA 的能力，而且還含有核編碼的mRNA 和蛋白質(zhì)，在獲能過程中，精子可以替代降解的蛋白質(zhì)或合成新的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)對受精至關(guān)重要[24]。在凍融犬精液中發(fā)現(xiàn)魚精蛋白PRM2和PRM3基因會發(fā)生變化[25-26]，同樣在本研究中發(fā)現(xiàn)牛精液PRM2和PRM3基因也發(fā)生了顯著變化，在3%甘油+1.5 mg/mL CLC 組PRM2和PRM3表達量顯著增加，驗證了我們的假設(shè)，與CMA3 染色結(jié)果一致，說明添加CLC 替代部分甘油在冷凍保存期間減少精子魚精蛋白的損失，是由PRM2和PRM3大量聚集而阻止了精子魚精蛋白的損失。同時值得注意的是，在冷凍的種馬精子中PRM2基因表達量與對照組相比顯著下降[27]，這可能是不同物種的原因。細胞凋亡，也稱為選擇性細胞死亡，是一種影響細胞活力的現(xiàn)象，該過程已在人類精子中被記錄，并與輔助生殖技術(shù)后的受精失敗有關(guān)。如今，精子的冷凍和解凍通常與宮內(nèi)受精和體外受精等輔助生殖技術(shù)結(jié)合使用，但冷凍和解凍過程會增加凋亡精子的數(shù)量，從而降低輔助生殖技術(shù)的成功率。因此，應(yīng)仔細評估當前精子的冷凍和解凍方法，以確保最大限度地減少細胞凋亡誘導(dǎo)的損傷，對判斷凍融后的精子能夠保持其受精能力是十分重要的[28]。據(jù)報道[29]，BCL2超家族的成員是線粒體凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，該超家族可分為促凋亡成員和抗凋亡成員，促凋亡BCL2成員，如BAX和BAK 主要位于細胞質(zhì)中，可以根據(jù)需要而插入到線粒體外膜（OMM）中；抗凋亡成員，如BCL2本身和BCL-XL 位于 OMM 中，可通過阻止與促凋亡BCL2成員相關(guān)的電壓依賴性陰離子通道（VDAC）的開放，也可通過抑制促凋亡BCL2成員形成的超分子開口的組裝來抑制細胞凋亡[30]。精子尾中段大量的線粒體為細胞內(nèi)細胞凋亡應(yīng)激提供可能性[31]。在本實驗中，3% 甘油+1.5 mg/mL CLC 組與對照組相比，抗凋亡基因BCL2的轉(zhuǎn)錄表達增加和促凋亡基因BAX的轉(zhuǎn)錄表達降低，BCL2/BAX的值顯著升高，這與精子活力的檢測是一致的，說明冷凍保護液中添加CLC 替代部分甘油在冷凍保存期間減少了細胞凋亡，保護精子發(fā)生。ROMO1是產(chǎn)生線粒體ROS 的關(guān)鍵基因[32]，線粒體呼吸鏈中產(chǎn)生大量內(nèi)源性ROS，可引起基因隨機突變并導(dǎo)致程序性細胞死亡[33]。在本實驗中，與對照組相比，3% 甘油+1.5 mg/mL CLC 組ROMO1基因轉(zhuǎn)錄表達降低，說明冷凍保護液中添加CLC 替代部分甘油在凍融過程中可保護線粒體，并減少ROS 的產(chǎn)生。SPACA3基因存在于質(zhì)膜周圍細胞外基質(zhì)中的N-乙酰氨基葡糖寡糖的結(jié)合位點，可編碼SPRASA 蛋白進而參與精卵細胞的識別和結(jié)合，并在生育力中起絕對作用[34-35]。研究結(jié)果顯示與對照組相比，3%甘油+1.5mg/mL CLC 組的SPACA3基因轉(zhuǎn)錄表達增加，說明冷凍保護液中添加CLC 替代部分甘油在冷凍保存期間可使精子保持其正常的生理機能。這也有可能是細胞凋亡減少和線粒體保護增加的原因。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果顯示，減少3%甘油濃度后添加1.5 mg/mL CLC 可顯著改善冷凍保存精子質(zhì)量。