馬文奎，王建魁，李廣棟，吳 昊，孫光澤，高 爽，李 瑞，肖西山，劉建斌，鄧學(xué)梅，阿布力孜·吾斯曼，劉國(guó)世*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；3.內(nèi)蒙古草原金峰畜牧有限公司，內(nèi)蒙古赤峰 024000；4.北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院畜牧獸醫(yī)系，北京 102400；5.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅蘭州 730050）

胚胎移植技術(shù)可充分發(fā)揮優(yōu)良母畜在家畜品種改良和種群擴(kuò)繁中的潛力[1]，還可使優(yōu)質(zhì)種畜基因穩(wěn)定遺傳下去，有效縮短世代間隔[2-5]，是普遍使用的快速擴(kuò)繁手段[6]。前列腺素在調(diào)節(jié)母畜發(fā)情、超數(shù)排卵、人工流產(chǎn)等羊業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)中起著至關(guān)重要的作用[7-8]。當(dāng)前技術(shù)人員不能借助現(xiàn)有的B 超儀器將30 d 以內(nèi)的胎兒檢測(cè)出來(lái)，因此對(duì)甘肅高山美利奴細(xì)毛羊埋栓前進(jìn)行前列腺素處理，不但可以起到人工流產(chǎn)的作用，而且可以治療繁育障礙，還能提高同期發(fā)情和胚胎移植效率。但在胚胎移植中采集到的胚胎質(zhì)量會(huì)影響胚胎移植的整體效果[9]，因此在手術(shù)沖胚后對(duì)收集到的胚胎進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析和鑒定獲得的高質(zhì)量胚胎能顯著提高胚胎移植效率。本實(shí)驗(yàn)旨在探究甘肅高山美利奴細(xì)毛羊在CIDR 埋栓前14 d 注射前列腺素是否會(huì)提高排卵效率，以期為提高羊良種繁育效率提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用內(nèi)蒙古赤峰市草原金峰畜牧有限公司12 只甘肅高山美利奴細(xì)毛羊作為供體，體重在45～76 kg，年齡2～3 歲,體況良好，無(wú)繁殖疾病。選用膘情良好，無(wú)繁殖疾病的2～3 歲烏珠穆沁羊做受體，供受體胎次均為3～5 胎。采精公羊性欲旺盛，精液品質(zhì)檢查優(yōu)良，精子活力0.6 以上。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 促卵泡素（Follicle-Stimulating Hormone，F(xiàn)SH）、促黃體素（Luteinizing hormone，LH）、孕馬血清促性腺激素（Pregnant Mare Serum Gonadotropin，PMSG）、氯前列醇鈉注射液（Prostagla ndin，PG）均由寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn)；陰道栓CIDR：購(gòu)買新西蘭產(chǎn)EAZI-BREED-CIDR，20 個(gè)/袋；Holding 培養(yǎng)液：新西蘭生產(chǎn)，50 mL/袋；75%酒精、碘伏、高濃度新潔爾滅、磺胺、維生素AD、林可霉素、生理鹽水等為國(guó)產(chǎn)。

1.3 設(shè)備和器械 采精設(shè)備（假陰道）、精液品質(zhì)檢測(cè)顯微鏡、內(nèi)窺鏡輸精設(shè)備、手術(shù)架、沖卵管、恒溫板、體視鏡（檢胚）、手術(shù)刀柄、直剪、止血鉗、子宮鉗、創(chuàng)巾鉗等。

1.4 供體羊超數(shù)排卵 將試驗(yàn)羊分成試驗(yàn)組和對(duì)照組，均采用CIDR+FSH+PMSG 法。試驗(yàn)羊肌肉注射前列腺素1 mL（劑量0.2mg），注射后第14 天埋置CIDR 栓，同時(shí)肌肉注射3～5 mL 維生素AD。埋栓后第10 天開(kāi)始注射FSH，根據(jù)體重和手術(shù)次數(shù)調(diào)控劑量，總劑量區(qū)間為300～500 IU/ 只，4 d 8 針注射法依次遞減，第13 天注射最后1 針（第7 針）FSH 時(shí)同時(shí)取出CIDR 栓，取栓后12 h 注射PMSG，劑量330～450 IU/只。

1.5 供體羊配種 供體羊在取栓后48～54 h 進(jìn)行內(nèi)窺鏡人工輸精。提前組裝好內(nèi)窺鏡輸精設(shè)備。將無(wú)傳染性疾病，性欲旺盛的供體公羊生殖器部位用衛(wèi)生紙擦拭干凈，找1 只發(fā)情母羊，利用假陰道采集精液。供體母羊仰臥保定，備好表皮，在距離乳房下側(cè)6～8 cm 處進(jìn)行微創(chuàng)打孔，一般左右兩側(cè)對(duì)稱。最后左手持內(nèi)窺鏡進(jìn)入羊腹腔找到子宮角，右手利用輸精槍將公羊精液輸入即可，子宮左右側(cè)各輸精0.2 mL。

1.6 胚胎收集和質(zhì)量檢測(cè) 內(nèi)窺鏡輸精后第5～6 天手術(shù)法從子宮角沖胚，回收胚胎。在40 倍體視顯微鏡下?lián)斐雠咛?，剔除未受精卵，觀察受精卵狀態(tài)、色澤、大小、數(shù)量、飽滿度以及發(fā)育期和發(fā)育階段。

1.7 受體羊的處理和腹腔鏡胚胎移植 采用CIDR+PMSG法處理，與供體同步埋栓，且同時(shí)撤栓，撤栓時(shí)肌肉注射PMSG，劑量330～450 IU/只,撤栓后24～36 h 試情，記錄發(fā)情時(shí)間。供體在5～6 d 進(jìn)行沖胚，受體通過(guò)腹部微創(chuàng)手術(shù)法進(jìn)行移植，采用腹腔鏡觀察子宮兩側(cè)，單側(cè)發(fā)現(xiàn)1～3個(gè)黃體則可進(jìn)行移植，術(shù)后注射抗生素進(jìn)行消炎。

1.8 供受體羊術(shù)后管理 供受體羊術(shù)后分欄喂養(yǎng)，保持足夠飲水和飼料，圈舍內(nèi)保持干燥整潔，防止術(shù)后感染，觀察1～2 d，在胚胎移植后45 d 進(jìn)行妊娠檢查。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)先用Excel 歸類匯總，使用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果如未特殊說(shuō)明，均使用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤進(jìn)行表示，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 注射前列腺素對(duì)甘肅高山美利奴細(xì)毛羊發(fā)情率和黃體數(shù)的影響 由表1 可知，注射前列腺素對(duì)發(fā)情率、平均黃體數(shù)、平均左側(cè)黃體數(shù)、平均右側(cè)黃體數(shù)沒(méi)有顯著影響。試驗(yàn)組的發(fā)情率為100%，對(duì)照組為83.33%；試驗(yàn)組的平均黃體數(shù)為18.50 枚，對(duì)照組為14.66 枚；試驗(yàn)組的平均左側(cè)黃體數(shù)為9.17 枚，對(duì)照組為7.33 枚；試驗(yàn)組平均右側(cè)黃體數(shù)為7.67 枚，對(duì)照組為7.33 枚。

表1 注射前列腺素對(duì)甘肅高山美利奴細(xì)毛羊發(fā)情率和黃體數(shù)的影響

2.2 注射前列腺素對(duì)甘肅高山美利奴細(xì)毛羊回收胚胎數(shù)和可用胚胎數(shù)的影響 由表2 可知，試驗(yàn)組的平均回收胚胎數(shù)、平均可用胚胎數(shù)以及胚胎回收率均高于對(duì)照組（P＜0.05）。注射前列腺素有利于胚胎移植中獲得平均回收胚胎數(shù)、平均可用胚胎數(shù)和提高胚胎回收率。

表2 注射前列腺素對(duì)甘肅高山美利奴細(xì)毛羊回收胚胎數(shù)和回收胚胎率的影響

2.3 注射前列腺素對(duì)甘肅高山美利奴細(xì)毛羊受精率和胚胎質(zhì)量的影響 由表3 可知，試驗(yàn)組的受精率為91.18%，對(duì)照組為89.36%（P＞0.05）；試驗(yàn)組的平均桑椹胚數(shù)為5.33 枚，對(duì)照組為3.83 枚（P＞0.05），試驗(yàn)組的平均囊胚數(shù)高于對(duì)照組（P＜0.05）。注射前列腺素有利于提高胚胎移植中獲得的囊胚數(shù)。

表3 注射前列腺素對(duì)甘肅高山美利奴細(xì)毛羊受精率和胚胎質(zhì)量的影響

2.4 注射前列腺素對(duì)甘肅高山美利奴細(xì)毛羊受胎率的影響 由表4 可知，妊娠率試驗(yàn)組85.06%，對(duì)照組81.58%（P＞0.05）。

表4 注射前列腺素對(duì)甘肅高山美利奴細(xì)毛羊受胎率的影響

3 討 論

3.1 同期發(fā)情效果分析 同期發(fā)情技術(shù)可以追溯到20世紀(jì)50 年代，最初以孕激素和前列腺素聯(lián)合使用為主。隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，不同激素聯(lián)合使用顯著提高同期發(fā)情效果，因此研究制定同期發(fā)情方案成為了動(dòng)物繁殖領(lǐng)域的焦點(diǎn)問(wèn)題[10-11]。研究表明前列腺素在家畜同期發(fā)情過(guò)程中具有重要作用[12-13]，應(yīng)用PMSG 結(jié)合前列腺素可以提高母牛同期發(fā)情效率[14]。胡雄貴等[15]證實(shí)使用前列腺素會(huì)提高母牛的發(fā)情率。鄧緣等[16]使用PG+PMSG 法對(duì)54 只湘東黑山羊在2～5 d 內(nèi)集中發(fā)情和配種，同期處理的發(fā)情率87.0%（47/54）顯著提高。李芳芳等[17]對(duì)努比亞山羊同期發(fā)情中使用CIDR+PMSG+PG、CIDR+FSH+PG、PIDR+PMSG+PG3種同期方案，發(fā)情率分別為100%、100%、91.67%。鄧緣等[16]在同期發(fā)情方案中，先注射前列腺素進(jìn)行溶解黃體，使母羊處于同一發(fā)情生理階段。李芳芳等[17]在同期發(fā)情方案中最后注射前列腺素，促進(jìn)卵泡發(fā)育和排卵效果。在本研究中，埋植CIDR 栓前14d 注射前列腺素，溶解綿羊卵巢黃體，和鄧緣等方案有類似功能，同期發(fā)情排卵數(shù)和卵母細(xì)胞質(zhì)量顯著提高。

3.2 超數(shù)排卵效果分析 超數(shù)排卵技術(shù)是胚胎移植中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[18]。董志岷等[19]用CIDR+FSH+PMSG+PG對(duì)38 只杜泊羊進(jìn)行超數(shù)排卵，平均沖胚7.52 枚，結(jié)果顯示，注射PMSG 增加了內(nèi)源促黃體素含量，促進(jìn)了卵泡成熟和排卵后顆粒細(xì)胞黃體化，提高了超數(shù)排卵效果。本實(shí)驗(yàn)采用PG+CIDR+FSH+PMSG 進(jìn)行，平均沖胚15.50 枚與上述不同，可能與供體年齡、輸精方式等有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)高山美利奴羊進(jìn)行超排處理，最終平均胚胎回收率為92.00%。馮新宇等[20]在超排時(shí)將 6針遞減法（12.5 mL Folltropin-V）作為對(duì)照組；6 針遞減法（10 mL Folltropin-V）為試驗(yàn) I 組；采用 8 針遞減法（12.5 mL Folltropin-V）為試驗(yàn) II 組；不改變劑量和給藥方式，僅將畜舍內(nèi)溫度降至零下18℃ 時(shí)為試驗(yàn) III 組，結(jié)果表明，對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)I 組、II 組、III 組胚胎回收率分別為93.12%、65.13%、73.83%、82.77 %。高峰等[21]采用二次前列腺素（PG）法、陰道栓（CIDR）+PG 法和CIDR+PMSG+PG 法對(duì)6 組湖羊進(jìn)行同期發(fā)情試驗(yàn)，結(jié)果表明3 種方法中 CIDR+PMSG+PG 法同期發(fā)情效果較理想。馮新宇與高峰等在超數(shù)排卵中使用不同F(xiàn)SH 注射劑量、給藥方式、環(huán)境溫度、超排方案等[20-21]。本試驗(yàn)與馮新宇和高峰試驗(yàn)方案不同，取得的結(jié)果有所不同，可能是與品種、試驗(yàn)方法等不同導(dǎo)致。在本研究中，CIDR 埋栓前14 天進(jìn)行注射前列腺素，發(fā)情率和高峰（93.2%）[22]的研究結(jié)果一致，胚胎回收率高于馮新宇[20]及高峰等[22]（55.60%）。

4 結(jié) 論

在養(yǎng)羊生產(chǎn)中，注射前列腺素14 d 后母羊處于新的周期黃體期，周期黃體功能可能出現(xiàn)退化，此時(shí)埋置CIDR 孕酮陰道栓可延長(zhǎng)黃體期，14 d 左右撤栓（CIDR）后可顯著促進(jìn)卵泡發(fā)育，卵泡數(shù)增加。在同期發(fā)情前14 d 注射前列腺素，可以有效提高胚胎移植供體胚胎回收率和平均可用胚胎數(shù)。