劉孟超，張金鑫，曲魯江，劉華貴 ,王 梁

（1.北京市農業(yè)農村局，北京 100005；2.中國農業(yè)大學動物科學技術學院，北京 100193；3.北京市農林科學院，北京 100097；4.北京市畜牧總站，北京 100107）

家養(yǎng)動物馴化以后，隨著人類的遷移分散到世界各地，在人類的生產、生活中發(fā)揮著重要作用。家養(yǎng)動物和野生動物相比，其外貌表型、生活習性、抗病免疫等方面都存在顯著差異。家雞由紅色原雞馴化而來（已有報道證實紅色原雞中的部分基因來源于灰色原雞的滲入[1]），經過數(shù)千年的人工和自然選育，逐漸形成了體型外貌、行為習性、生產用途各異的地方雞品種，用來滿足人類對雞蛋、雞肉、娛樂（如斗雞、觀賞雞等）等方面的需求。

北京油雞作為北京的地方品種，在清朝中期已經形成，經過長期的選育形成了具有特殊外貌（即鳳頭、毛腳和胡子嘴）、肉蛋品質兼優(yōu)的地方雞種，此外北京油雞少數(shù)個體存在多趾現(xiàn)象。近年來，研究者利用微衛(wèi)星、線粒體和高密度芯片等多種數(shù)據針對北京油雞遺傳資源現(xiàn)狀展開了調研[2]，圍繞北京油雞進行了相應的遺傳資源評估、保護和利用工作，目前該品種已經在保種場得到了保護，同時通過將北京油雞作為遺傳品系進行選育配套，形成了相應的配套系。另外，針對北京油雞的不同外觀性狀，鑒定找到了與多趾、鳳冠性狀相關的基因或基因組區(qū)段[3-4]。這些工作為北京油雞的品種保護和利用提供了有價值的研究基礎和理論依據。

隨著全基因組測序技術價格的降低，該技術在雞等動物遺傳資源鑒定和評估方面得到了廣泛應用。本研究利用北京油雞和其他國內外雞種的基因組數(shù)據，應用di選擇參數(shù)[5]，比對北京油雞和其他品種的基因組分化區(qū)域，分析北京油雞所特有的基因組選擇信號，并鑒定這些選擇信號下相關的特定基因，分析這些區(qū)域與北京油雞特異性性狀之間的關聯(lián)，找到北京油雞特異性性狀的全基因組特征，為進一步了解和開發(fā)北京油雞奠定遺傳學基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 北京油雞、紅色原雞和其他7 個中外雞種（白來航、白洛克、洛島紅、絲羽烏骨雞、藏雞、瓢雞和東濤雞），共計133 個樣本，其中：

1）瓢雞、東濤雞和北京油雞群體中部分個體進行翅下靜脈采集，約1 mL 血樣置于盛有0.3 mL 抗凝劑（ACD）的離心管（2 mL）中，顛倒混勻后置于-20℃冰箱長期保存?zhèn)溆?。采用天根基因組試劑盒（TIANGEN，DP318）提取禽血DNA，最后取DNA 樣本進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，以保證DNA 條帶的完整性，最后將滿足質量的DNA 用于建庫測序（Illumina Hiseq 2500 平臺）；

2）紅色原雞組織樣為中國農科院韓建林老師提供，通過Illumina Hiseq 2500 平臺進行測序；

3）白洛克、白來航、洛島紅、絲羽烏骨雞和藏雞樣本來自華南農業(yè)大學發(fā)表在NCBI 上的二代測序數(shù)據（SAMN14651083）。

1.2 數(shù)據比對和統(tǒng)計分析 全基因組原始數(shù)據利用BWA軟件[6]進行比對，GATK4.0 軟件[7]獲得原始SNP 和indel。之后，利用VCFTOOLs 對數(shù)據進行過濾及FST計算[8]。9 個雞群共計133 個樣本的基因組數(shù)據用于FST 及di 數(shù)據分析。

本研究利用了2 個參數(shù)，即群體分化指數(shù)FST[9]和di 統(tǒng)計量[5]。FST 是衡量2 個品種差異最為常見的選擇信號分析方法之一，將FST 結果進一步轉化為di 統(tǒng)計量分析，采用滑動窗口的形式，檢測不同品種特異性受選擇區(qū)域。該方法能夠更好地用于3 個以上群體的群體差異分析，從而鑒定到針對北京油雞特異性性狀的基因組學特征。以下是這2 個參數(shù)的計算方法：

1.3 基因注釋和功能分析 根據雞第6 版的基因組注釋信息，利用Ensembl 數(shù)據庫對北京油雞特異性的全基因組di 分析結果進行注釋（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_000002315.5/），查找相關SNP 的位置信息，通過R 語言對結果進行可視化展示。

2 結果

2.1 測序數(shù)據概況 本研究利用全基因組二代重測序數(shù)據，樣本基因組測序深度在8.1×～48.04×，比對率均在95% 以上（表1）?；诘诹鎱⒖蓟蚪M，通過GATK 軟件本研究共得到31 134 064 個SNPs，經過過濾后（標準：-max-missing 0.5，-maf 0.05，-minQ 20，-min-meanDP 5，-max-meanDP 1000，-minGQ 5）13 768 621 個SNP 被保留用于后續(xù)分析。

表1 樣本來源及測序數(shù)據概況

2.2 選擇信號檢測 研究采用基因組滑動窗口的方式進行，以20 kb 的窗口大小、10 kb 的滑動步長，對北京油雞和其他8 個品種的FST 和di 結果進行分析，探究北京油雞與其他品種表型差異的分子遺傳學原因，鑒定北京油雞特異性性狀的候選基因。通過對北京油雞全基因組di 分析，本研究一共劃分出96 018 個受選擇窗口，其di 選擇信號值范圍在-29.10～44.14 之間，詳細結果見圖1。di 值越大，表明該區(qū)域受選擇強度越高。將di值前1% 的基因組區(qū)域（960 個區(qū)域，di＞18.68）設定為顯著區(qū)域，涉及378 個基因，可以看到顯著區(qū)域覆蓋雞的多條染色體（1，2，3，4，11，13，15，17，33）。在這378 個基因里，鑒定找到了40 個與北京油雞特征性狀（毛腳、鳳冠、毛色，多趾）、適應性性狀（免疫調節(jié)）、生長發(fā)育和繁殖性狀相關的候選區(qū)域及基因（表2）。

圖1 di 在常染色體上檢測到的選擇信號的全基因組分布

2.3 基因注釋及功能分析 與北京油雞特異性性狀相關的候選基因可分為以下4 類。一是與外觀相關的性狀：北京油雞具有多趾、鳳冠、胡子嘴、羽毛較為密集等特征，本研究鑒定到的與之對應的基因包括：與鳳冠形成相關的HOXC8、HOXC10基因[10-11]，與毛脛、多趾相關的PITX1、TBX5基因[12-13]，與羽毛發(fā)育和性狀相關的IL9、HOX家族[14]、FZD4[15-16]基因等（表2）。由于在馴化和品種形成過程中，人類總會依據個人喜好將一些品種特有的外觀性狀保留下來，這就使得相應的等位基因變異得以保存，并在基因組分析過程中使北京油雞與其他雞種特有差異的基因組區(qū)段被鑒定出來。二是與色素沉積相關的性狀：色素沉積的性狀主要包括蛋殼顏色、羽毛顏色和皮膚顏色等，由于色素性狀相對變異比較大，也更容易滿足人們對動物顏色喜好的選擇，所以在品種形成過程中也往往是受到正向選擇的。本研究鑒定到的基因包括影響蛋殼顏色的SLCO1A2[17]、SLCO1C1[18]等基因，與羽毛顏色或者膚色相關的MC1R[19]、TYR[20]等基因（表2）。三是免疫相關性狀。在品種選育過程中，品種所接觸的環(huán)境總會發(fā)生變化，包括接觸到的病原微生物也會有所差異。為了適應新的環(huán)境，所形成品種的免疫反應和相關基因也會受到選擇。本研究鑒定到的與北京油雞相關的基因包括：與禽白血病抗性相關的HSPA5基因，與免疫調節(jié)、炎癥反應相關的CSF2、IL13、IL4、KK34、ZFP36L2基因以及與禽流感抗性相關的USP18基因（表2）。四是與發(fā)育、繁殖、生長等生產性狀相關的基因：包括與生長發(fā)育相關的BCL2L13、CNMD、FGF1、CXCL14、FZD4、IGF1、LMX1B、PBX3、IRX2、PMCH、TBX3等基因[21-23]，與繁殖（產蛋）性狀相關的SYCP3基因等[24]。同時，與視力相關的LHX5基因也在油雞品種形成過程中受到了明顯的選擇，而馴化動物視力下降從而變得溫順也是人類選擇家養(yǎng)動物的指標之一（表2）。di 值檢測選擇信號不僅為雞馴化過程中的選擇信號鑒定提供幫助，同時也證明了利用di 值挖掘品種特異性性狀候選區(qū)域的可靠性。

表2 di 檢測到的與北京油雞表型性狀相關的潛在候選區(qū)域和基因

3 討 論

家雞在馴化過程中經歷長期的自然選擇、人工選擇、遷移、遺傳漂變等事件的洗禮，逐漸分化出了不同的亞種或亞群，在體型外貌、環(huán)境適應性、行為習性等方面已經與野生祖先大為不同[1]。作為北京地方雞種的北京油雞，體型外貌則尤為特殊，是地方雞多樣性研究的熱點之一。選擇信號分析是生物信息分析中的“考古學”，通過選擇信號檢測能夠找到生物群體在千萬年進化過程中在基因組上留下的痕跡[25]。這些痕跡可能與家禽育種、馴化適應等方面密切相關，因此選擇信號研究有助于挖掘與家禽特異性狀相關的基因，了解性狀形成的潛在的遺傳學基礎，進一步解析群體之間差異性狀的遺傳機制，對于家禽遺傳改良有著重要意義。

選擇信號的檢測方式有很多種，主流的檢測手段可分為四大類：基于等位基因頻率譜、基于連鎖不平衡、基于群體分化和基于基因組雜合度的方法，針對不同的數(shù)據類型、數(shù)據質量以及研究對象，可采用不同的選擇信號檢測方法[26]。本研究采用基于群體分化的di 選擇信號檢測方法來鑒定品種特異性選擇信號，檢測到許多與北京油雞體型、外貌相關的受選擇基因組區(qū)域，如油雞特有的鳳冠、多趾和毛脛等。此外，相比于其他地方雞種，北京油雞羽毛更豐富。因此，在本研究中也鑒定到了與羽毛生長發(fā)育相關的基因。在其他家養(yǎng)動物中，也有類似的發(fā)現(xiàn)，尤其是毛色（羽色）等色素沉積方面的性狀[27]。

家養(yǎng)動物與其野生祖先在生活地域方面也有很大差異。紅色原雞主要生活在東南亞四季溫濕度較高的環(huán)境，家雞則遍布世界各地，所面對的氣候條件、病原微生物則各不相同，雞就需要有相應遺傳學變化去適應這些環(huán)境[1]。本研究中，在北京油雞中鑒定到了很多與免疫調節(jié)、抗病相關的基因，說明這些基因在雞基因組馴化過

程中都受到了強烈的選擇。北京油雞在適應環(huán)境的過程中，形成了自己特有的針對北京及周邊地區(qū)環(huán)境的適應性機制。這也與其他家養(yǎng)動物或者其他雞品種的培育過程中免疫和環(huán)境適應相關的基因組區(qū)段受到選擇的研究結果一致[28-29]。

北京油雞作為家養(yǎng)品種，除了用作觀賞及文化傳承的載體外，最主要的作用還是滿足人們對雞肉和雞蛋的需要。因此，在北京油雞受選擇的基因組區(qū)域本研究還挖掘到部分與生長和產蛋相關的候選基因，其中IGF1基因[23]在很多家養(yǎng)動物中都受到了選擇，該基因與體型和生長速度關系密切。

4 結 論

本研究采用群基因組二代測序技術和基于群體分化計算的di 選擇信號分析，在北京油雞基因組中鑒定出960 個受到選擇的顯著區(qū)域，包括378 個受選擇的候選基因。基因注釋分析結果表明，選擇作用體現(xiàn)在北京油雞的外貌表型、生長發(fā)育等方面，鑒定到了與油雞特異性狀（鳳冠、多趾和毛腳）以及與抗病免疫相關的基因，本研究結果對北京油雞品種遺傳資源的進一步保護和利用具有重要意義。