郭 榮，曹雁行，艾德強(qiáng)，董建寶，張國(guó)梁，黃嬌嬌，官卻扎西，索佳佳，孫玉江,6*，劉書(shū)琴*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.東營(yíng)市現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，山東東營(yíng) 257091；3.青海省海北州剛察縣青海省種羊繁育推廣服務(wù)中心，青海海北藏族自治州 812200；4.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061；5.青海省畜牧總站，青海西寧 810008；6.東營(yíng)職業(yè)學(xué)院，山東東營(yíng) 257091）

馬屬動(dòng)物是食草性非反芻動(dòng)物，具有高度分隔的胃腸道（Gastrointestinal Tract，GIT），可利用多種植物纖維[1-2]。驢作為馬屬動(dòng)物，其與反芻動(dòng)物最大的區(qū)別是屬于后腸發(fā)酵，具有發(fā)育良好的后腸結(jié)構(gòu)，驢后腸的潛在長(zhǎng)度和體積超過(guò)4.5 m 和110 L，約為其前腸體積的15.95 倍[3]。

動(dòng)物腸道中的微生物生態(tài)系統(tǒng)相對(duì)比較復(fù)雜，它們對(duì)宿主的生長(zhǎng)代謝、營(yíng)養(yǎng)消化與吸收、免疫力以及抵抗病菌入侵的能力等有著重要影響[4-5]。區(qū)域[6]及環(huán)境[7]是影響腸道微生物的主要因素。趙金香等[8]研究了干旱沙漠地帶新疆驢盲腸中的細(xì)菌多樣性，發(fā)現(xiàn)乳球菌科和松毛蟲(chóng)科在消化粗飼料過(guò)程中起關(guān)鍵作用。已有研究成果證實(shí)地理環(huán)境條件對(duì)鬣蜥、蝠屬動(dòng)物和歐洲熒火蟲(chóng)等腸道微生物的生物多樣性有著非常重要的塑造效果[9-11]。

我國(guó)多樣化的生態(tài)類(lèi)型造就了品種高達(dá)30 多個(gè)豐富的驢種資源，青海毛驢主要分布在青海省海東、海南、海北以及黃南等地的農(nóng)區(qū)和半農(nóng)半牧區(qū)，屬于高原大陸性氣候[12]。不同地區(qū)往往有著不同環(huán)境條件，而宿主與共生菌如何適應(yīng)不同地區(qū)環(huán)境且體內(nèi)不同部位微生物差異一直是研究的熱點(diǎn)之一[13]。現(xiàn)階段隨著對(duì)腸道微生物研究的日益重視，而對(duì)于驢腸道微生物的研究還為之甚少。本文利用高通量16S rRNA 測(cè)序的方法，與山東德州驢相比較，分析不同地區(qū)（青海和山東）和不同部位（胃、小腸、盲腸和直腸）對(duì)青海毛驢腸道菌群的組成和結(jié)構(gòu)差異，對(duì)改善青海毛驢胃腸道微生態(tài)環(huán)境、預(yù)防與控制疾病的發(fā)生有重要的理論指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 樣本采集 各選取來(lái)自青海?。ㄇ嗪ＣH，海拔＞3 000 m，試驗(yàn)組）和山東省（德州驢，海拔＜30 m，對(duì)照組）的6 個(gè)個(gè)體（3 公3 母），采樣對(duì)象均為成年健康驢（5～10 歲）。青海毛驢為舍飼，以麥草、青稞和豆秸等飼料為主，每日飼喂2～3 kg；德州驢為舍飼，以花生秧、玉米秸和麥糠麥秸等飼料為主，每日飼喂5～6 kg。

驢屠宰后，正確分離胃、小腸和大腸，具體部位確定如下：胃-賁門(mén)部至幽門(mén)部；十二指腸-胃結(jié)合部后10 cm；空腸-十二指腸結(jié)合部后10 cm；回腸-回盲口向前10 cm 處；盲腸-呈“逗號(hào)”狀，為一盲端；直腸-靠近肛門(mén)端。用繩子扎緊各段間狹小接口，水平放置，從各腸道段中部取樣，取等量的十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物，混合后定義為小腸內(nèi)容物。對(duì)包含內(nèi)容物的胃、小腸（十二指腸、空腸和回腸）和大腸（盲腸、結(jié)腸和直腸）的重量進(jìn)行稱(chēng)重記錄，之后立即無(wú)菌采集胃、小腸、盲腸和直腸4 個(gè)部分的新鮮內(nèi)容物樣品，無(wú)菌收集于2 mL 無(wú)菌康寧冷凍管中（Corning Incorporated，New York，USA），做好標(biāo)記后立即放于液氮中進(jìn)行速凍，然后放于-80℃低溫冰箱保存；收集完畢后排出內(nèi)容物，對(duì)不含內(nèi)容物的胃、小腸和大腸的重量再次進(jìn)行稱(chēng)重記錄，并測(cè)量記錄小腸和大腸的長(zhǎng)度。收集的樣本送往Majorbio 生物公司進(jìn)行16S rRNA 基因組分析。其中青海毛驢的小腸和大腸長(zhǎng)度及其比例，胃、小腸和大腸內(nèi)容物重量（內(nèi)容物重量=含內(nèi)容物重量-不含內(nèi)容物重量）及比例如表1 所示。

表1 青海毛驢胃腸道長(zhǎng)度及其內(nèi)容物重量統(tǒng)計(jì)

1.2 16S rRNA 基因測(cè)序

1.2.1 總DNA 提取和PCR 擴(kuò)增 使用 TransGen AP221-02 DNA 試劑盒從腸道內(nèi)容物樣品中提取微生物群落基因組總DNA。使用1%瓊脂糖凝膠來(lái)檢測(cè) DNA 提取物，并使用NanoDrop 2000 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Wilmington，USA）測(cè)定DNA濃度和純度。通過(guò)ABI GeneAmP? 9700 PCR 熱循環(huán)儀（ABI，CA，USA）對(duì)細(xì)菌16S rRNA 基因的高變區(qū)V3-V4 進(jìn)行擴(kuò)增用，用的引物對(duì)為338F（5'-ACTCCTACGGGA GGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTW TCTAAT-3'）。16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增流程為：95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，共27 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃終止。PCR 混合物包含5 ×TransStart FastPfu 緩沖液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、正反向引物（5 μmol/L）各0.8 μL、TransStart FastPfu DNA 聚合酶0.4 μL、模板DNA 10 ng，最后ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。PCR 反應(yīng)一式三份進(jìn)行。PCR 產(chǎn)物從2%瓊脂糖凝膠中提取，并使用AxyPreP DNA 凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）根據(jù)使用說(shuō)明進(jìn)行純化，并使用QuantusTM熒光計(jì)（Promega，USA）進(jìn)行定量。

1.2.2 Illumina MiSeq 測(cè)序 根據(jù)美吉生物公司（中國(guó)上海）的標(biāo)準(zhǔn)方案，在Illumina MiSeq PE300 平臺(tái)（Illumina，San Diego，USA）上以等摩爾和雙端方式匯集純化的擴(kuò)增子。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 原始16S rRNA 基因測(cè)序讀數(shù)被解復(fù)用，由FASTQ 版本0.20.0[14]對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行過(guò)濾，用FLASH 版本1.2.7[15]對(duì)其合并，標(biāo)準(zhǔn)如下：在任何位點(diǎn)的300 bp 讀數(shù)在50 bp 滑動(dòng)窗口上被截?cái)啵瑥亩@得＜20 的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，并且小于50 bp 的截?cái)嘧x數(shù)被棄去，包含歧義字符的讀數(shù)同樣被舍棄；只有超過(guò)10 bp的重疊序列才會(huì)根據(jù)它們的重疊序列進(jìn)行組裝。重疊區(qū)域的最大失配率為0.2。棄去無(wú)法組裝的讀數(shù)；區(qū)分樣品的方法是根據(jù)條形碼和引物，調(diào)整序列方向，條形碼精確匹配。

使用 UPARSE 7.1 版[16]對(duì)具有97%相似性截止值的操作分類(lèi)單元（OTU）[16-17]進(jìn)行聚類(lèi)，并識(shí)別并刪除嵌合序列。每個(gè)OTU 代表序列的分類(lèi)通過(guò)RDP 分類(lèi)器版本2.2[18]針對(duì)16S rRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)（Silva v138）使用0.7的置信閾值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 稀釋曲線分析 圖1 顯示，在8 個(gè)分組中，Shannon指數(shù)曲線上升后均逐步趨于平緩，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)達(dá)到飽和，能夠覆蓋腸道微生物組群落的絕大部分物種，結(jié)果可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 Shannon 指數(shù)曲線

2.2α多樣性分析 在OTU 水平，青海毛驢的胃、小腸、盲腸和直腸的微生物物種豐富度和多樣性均高于德州驢。其中，小腸的豐富度和多樣性最低，盲腸和直腸的豐富度和多樣性均高于胃和小腸。

Shannon 指數(shù)表明（圖2-A），青海毛驢胃的物種多樣性低于其盲腸和直腸（P≤0.05），青海毛驢胃的物種多樣性高于德州驢小腸（P≤0.01）；青海毛驢小腸的物種多樣性低于其盲腸和直腸（P≤0.01），而青海毛驢小腸的物種多樣性低于德州驢盲腸和直腸的物種多樣性（P≤0.05）；青海毛驢盲腸和直腸的物種多樣性高于德州驢各組（P≤0.05）；德州驢小腸的物種多樣性顯著低于其盲腸和直腸（P≤0.01）。

Ace 指數(shù)表明（圖2-B），青海毛驢胃的物種豐富度低于其直腸（P≤0.05）；青海毛驢盲腸的物種豐富度顯著低于青海毛驢直腸，青海毛驢盲腸的物種豐富度高于德州驢胃（P≤0.05）和小腸（P≤0.01）的物種豐富度；青海毛驢直腸的物種豐富度高于德州驢胃和盲腸（P≤0.01）以及小腸（P≤0.001）的物種豐富度；德州驢胃的物種豐富度低于其直腸（P≤0.05）；德州驢小腸的物種豐富度低于其盲腸（P≤0.05）和其直腸（P≤0.01）；德州驢盲腸的物種豐富度低于其直腸的物種豐富度（P≤0.05）。

圖2 α 多樣性分析

2.3 基于門(mén)和屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成 在門(mén)水平上，共鑒定到20 個(gè)門(mén)水平菌，其中共有門(mén)18 個(gè)（90%），青海毛驢小腸有2 個(gè)獨(dú)有菌門(mén)為P__Caldisericota（50%）和氫化戊烯菌（P__Hydrogenedentes，50%）（圖3-A）。

青海毛驢前腸的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)（Proteobacte ria，36.01%）和厚壁菌門(mén)（Fimicutes，32.68%），青海毛驢后腸的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)（Fimicutes，56.89%）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidota，29.19%）。德州驢前腸的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)（Fimicutes，89.20%）和擬桿菌門(mén)（Bacteroidota，6.37%），德州驢后腸的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)（Fimicutes，54.87%）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidota，36.28%）和螺旋菌門(mén)（Spirochaetota，5.12%）（圖3-C）。

在屬水平上，共鑒定到276 個(gè)屬水平菌，其中共有屬125 個(gè)（45.29%），青海毛驢胃獨(dú)有77 個(gè)菌門(mén)，占比前兩個(gè)的為黃桿菌屬和噬菌體屬（Flavobacterium24.19%，Algoriphagus9.72%）；青海毛驢小腸獨(dú)有19個(gè)菌門(mén)，占比前2 個(gè)的為普羅威登斯菌屬和原衣原體屬（Providencia65.97%，_Candidatus_Protochlamydia4.17%）；青海毛驢盲腸獨(dú)有2 個(gè)菌門(mén)，占比前兩個(gè)的屬為琥珀弧菌屬和副桿菌屬（Succinivibrionacia_UCG-00250%，Paracaedibacteracia50%）；青海毛驢直腸獨(dú)有5 個(gè)菌屬，占比前兩個(gè)的為DMER64 和脫硫孢屬（DMER6434.78%，DesulfurisPora30.43%）；德州驢胃獨(dú)有37 個(gè)菌屬，占比前兩個(gè)的為巨型單胞菌屬和桿菌屬（Megamonas19.52%，Coriobacteriacia8.5%）；德州驢小腸獨(dú)有9 個(gè)菌屬，占比前兩個(gè)的為脫甲基菌屬和乳酸菌屬（Demequinacia29.99%，Lacticigenium16.67%）；德州驢盲腸獨(dú)有1 個(gè)菌屬為g__norank_f__NS11-12_marine_group；德州驢直腸獨(dú)有1 個(gè)菌屬為奧秘桿菌屬（Arcanobacterium）（圖3-B）。

青海毛驢前腸的優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬（Streptococc us，14.12%）、放線菌屬（Actinobacteria，16.62%）和乳酸桿菌屬（Lactobacillus，6.31%），青海毛驢后腸的優(yōu)勢(shì)菌屬為理研菌屬（Rikenellacia，10.11%）密螺旋體（Treponema，6.60%）和乳酸桿菌屬（Lactobac illus，5.64%）；德州驢前腸的優(yōu)勢(shì)菌屬為乳酸桿菌屬（Lactobacillus，61.13%）和鏈球菌屬（Streptococcus，14.22%），德州驢后腸的優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬（Strepto coccus，15.77%）和理研菌屬（Rikenellacia，8.73%）（圖3-D）。

圖3 腸道微生物群落結(jié)構(gòu)組成

2.4 Beta 多樣性分析

2.4.1 樣本層級(jí)聚類(lèi)分析 試驗(yàn)樣品的菌群組成關(guān)系和結(jié)構(gòu)利用相似度樹(shù)狀圖描述。首先使用描述群落組成關(guān)系和結(jié)構(gòu)的Weighted-unifrac 算法計(jì)算在OTU 水平各個(gè)樣本間的距離，即根據(jù) beta 多樣性距離矩陣進(jìn)行層次聚類(lèi)分析，得到相似度樹(shù)狀圖，結(jié)果如圖4 所示，青海毛驢胃和小腸的菌群組成結(jié)構(gòu)相似，成簇聚類(lèi)到同一樹(shù)杈分支點(diǎn)上；德州驢胃和小腸菌群具有不同的聚落結(jié)構(gòu)，成簇聚類(lèi)到另一樹(shù)杈分支點(diǎn)上。青海毛驢直腸和德州驢直腸的菌群分別聚類(lèi)在樹(shù)杈分支點(diǎn)上，青海毛驢盲腸和德州驢盲腸的菌群分別聚類(lèi)在樹(shù)杈分支點(diǎn)上，從而形成鮮明的菌群結(jié)構(gòu)派別。

圖4 樣本層級(jí)聚類(lèi)分析

2.4.2 PCoA 分析 利用主坐標(biāo)（Principal co-ordinates analysis，PCoA）比較微生物的組成，結(jié)果表明，青海毛驢和德州驢的地區(qū)差異顯著，且來(lái)自相同/相鄰區(qū)域（胃和小腸，盲腸和直腸）的微生物群落比來(lái)自其他區(qū)域的微生物群落更相似（圖5）。

圖5 PCoA 分析

2.4.3 組間差異顯著性檢驗(yàn) 在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)（Fimicutes）的豐度在德州驢中高于青海毛驢（P=0.002），在德州驢小腸中的豐度最高，在德州驢胃中的豐度高于青海毛驢小腸（P=0.037），在德州驢胃中的豐度高于青海毛驢直腸（P=0.04），在德州驢胃中的豐度高于青海毛驢胃（P=0.0019）。擬桿菌門(mén)（Bacteroidota）在青海毛驢和德州驢中，盲腸和直腸的豐度均高于胃和小腸（P=0.0002）。變形菌門(mén)（Proteobacteria）在青海毛驢的豐度高于德州驢（P=0.003），且在青海毛驢胃和小腸的豐度高于盲腸和直腸。藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）只出現(xiàn)在青海毛驢中（P=0.0001），且只存在胃中。螺旋菌門(mén)（Spirochaetota）在青海毛驢和德州驢的盲腸和直腸的豐度高于胃和小腸（P=0.0006），在德州驢中，在盲腸中的豐度高于直腸，且在青海毛驢小腸的豐度高于德州驢小腸（P=0.048），在青海毛驢盲腸的豐度高于德州驢直腸（P=0.04）。放線菌門(mén)（Actinobacteria）在青海毛驢的豐度高于德州驢（P=0.001），且在青海毛驢中胃和小腸的豐度高于盲腸和直腸；在青海毛驢盲腸的豐度高于德州驢盲腸（P=0.0007）。乳頭菌門(mén)（Patescibacteria）在青海毛驢的豐度高于德州驢（P=0.008）（圖6）。

圖6 在門(mén)水平進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)

在屬水平上，乳酸菌屬（Lactobacillus）在德州驢中的豐度高于青海毛驢（P=0.000006），且德州驢的平均相對(duì)豐度在胃和小腸中高于盲腸和直腸且高于青海毛驢的胃和小腸，青海毛驢的盲腸和直腸的乳酸菌豐度較低。鏈球菌屬（Streptococcus）在德州驢的豐度高于青海毛驢（P=0.014），且在德州驢盲腸的豐度顯著高于青海毛驢直腸（P=0.03），在青海毛驢胃的豐度顯著高于青海毛驢直腸（P=0.04）。理研菌屬（Rikenellacia）在盲腸和直腸的豐度高于胃和小腸，在青海毛驢直腸中的豐度高于青海毛驢盲腸（P=0.04）。放線菌屬（Actinobacteria）在青海毛驢胃和小腸的豐度較高，在德州驢的豐度較低。葉綠體（Chloroplast）只存在于青海毛驢的胃中（P=0.001）。密螺旋體屬（Treponema）在兩組中盲腸和直腸的豐度高于胃和小腸，在德州驢小腸的豐度較低。毛螺菌屬（Lachnospiracia）在青海毛驢的豐度高于德州驢，在盲腸和直腸中的豐度高于胃和小腸，在青海毛驢的盲腸豐度較高，在青海毛驢盲腸中的豐度高于青海毛驢直腸（P=0.0017）。產(chǎn)氣莢膜桿菌（Clostridium）在德州驢的豐度高于青海毛驢（P=0.006）（圖7）。

圖7 在屬水平進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)

2.4.4 LEfSe 多級(jí)物種差異判別分析 通過(guò)LEfSe 分析進(jìn)行組別間差異比較，找到與豐度有顯著性差異的類(lèi)群，如圖8 所示，對(duì)樣本劃分產(chǎn)生顯著差異影響的群落或物種含量前三的細(xì)菌在青海毛驢胃中是藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）、葉綠體（Chloroplast）和放線桿菌門(mén)（Actinobacteria）；青海毛驢小腸中是變形菌門(mén)（Proteobacteria）、γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、巴氏桿菌科（Pasteurellaceae）；青海毛驢盲腸中是梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）、乳螺目（Lachnospirales）、振螺目（Oscillospirales）；青海毛驢直腸是理研菌科（Rikenellaceae）、毛螺菌科_AC2044（Lachnospiraceae_AC2044）、疣菌群屬（Verrucomicrobiota）。

圖8 LEfSe 多級(jí)物種層級(jí)樹(shù)圖

德州驢胃中是伯克氏菌目（Burkholderiales）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）、糞桿菌屬（Faecalibacte rium）；德州驢小腸是乳桿菌目（Lactobacillales）、桿菌（Bacilli）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）；德州驢盲腸是普雷沃菌科（Prevotellaceae）、螺旋體屬（Spiroch aetota）、密螺旋體屬（Treponema）；德州驢直腸是擬桿菌目（Bacteroidales）、擬桿菌屬（Bacteroidia）、擬桿菌屬（Bacteroidota）。

2.4.5 功能預(yù)測(cè)分析 通過(guò)PICRUSt 對(duì)OTU 豐度表進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，然后對(duì)OTU 進(jìn)行COG 功能注釋?zhuān)@得OTU 在COG 功能水平的注釋信息及各功能在不同樣本中的豐度信息。圖9 顯示，除去COG 的功能中比重最高的功能未知基因（Function unknown）和一般功能預(yù)測(cè)基因（General Function Prediction only）這兩大類(lèi)別，其中碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝基因（Carbohydrate Transport and Metabolism）除了青海毛驢胃外，在青海毛驢的小腸、盲腸和直腸以及德州驢4 個(gè)部位均呈現(xiàn)高豐度分布狀態(tài)；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝基因（Amino Acid Transport and Metabolism）除了德州驢小腸外，在青海毛驢的4 個(gè)部位以及德州驢的胃、盲腸和直腸均呈現(xiàn)高豐度分布狀態(tài)其余樣品中均呈現(xiàn)高豐度分布狀態(tài)，說(shuō)明腸道中碳源物質(zhì)代表碳水化合物和氮源物質(zhì)代表氨基酸兩種物質(zhì)代謝旺盛。

圖9 COG 功能分類(lèi)統(tǒng)計(jì)圖

3 討 論

3.1 在門(mén)水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成 微生物群落結(jié)構(gòu)組成在門(mén)水平上的結(jié)果顯示，青海毛驢前腸的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，青海毛驢后腸的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)。厚壁菌門(mén)的物種豐度在德州驢中高于青海毛驢，在青海毛驢中的豐度后腸高于前腸，而在德州驢中的豐度前腸高于后腸。劉桂琴等[19]基于16S rRNA 測(cè)序?qū)Φ轮莨H的研究表明，驢前腸優(yōu)勢(shì)菌門(mén)順序?yàn)楹癖诰T(mén)、變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)；后腸為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、螺旋體門(mén)和變形菌門(mén)。劉宇等[20]發(fā)現(xiàn)驢盲腸菌群優(yōu)勢(shì)順序?yàn)楹癖诰T(mén)、擬桿菌門(mén)、疣微菌門(mén)和螺旋體門(mén)。有報(bào)道稱(chēng)厚壁菌門(mén)在草食動(dòng)物中主要是利用碳水化合物[21]，有提高動(dòng)物免疫力和增強(qiáng)腸道功能的作用。

在馬屬動(dòng)物中，前腸主要負(fù)責(zé)食物的消化和吸收，后腸與微生物發(fā)酵有關(guān)[22]。雖然在馬的胃和小腸中已證實(shí)有輕微的發(fā)酵，但大腸仍是飼料發(fā)酵的最重要部分[23-24]。已知擬桿菌擁有豐富的編碼碳水化合物活性酶的基因，能夠根據(jù)可用性在腸道中不同類(lèi)型的能量源之間輕松切換[25]。擬桿菌在大腸的消化相關(guān)微生物群中顯著富集，并且不受粘膜相關(guān)微生物群中腸道位置的影響。李志鵬等[26]在梅花鹿瘤胃中菌群的研究發(fā)現(xiàn)，其中87.9%的16S rRNA 基因序列都屬于擬桿菌門(mén)降解纖維的菌種序列。因此，擬桿菌在大腸中富集可能有助于宿主適應(yīng)復(fù)雜的內(nèi)部環(huán)境和大腸中纖維性碳水化合物的降解。之前已有研究證明，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是山羊[27]、牛[28]和馬[29]等食草動(dòng)物中最具優(yōu)勢(shì)的2 個(gè)門(mén)。同樣，Chen 等[30]研究發(fā)現(xiàn)，肉牛瘤胃中厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的含量隨飼糧干草含量的增加而增加，特別是厚壁菌門(mén)。以上研究成果和本試驗(yàn)結(jié)果均說(shuō)明，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)可能與動(dòng)物個(gè)體飲食特征和消化大量纖維性碳水化合物有關(guān)。瘤胃疣微菌屬于典型的纖維降解菌，與纖維降解密切相關(guān)，可產(chǎn)生纖維酶降解纖維二糖等纖維類(lèi)物質(zhì)[31]。Patra 等[32]和Zhao 等[33]均證明瘤胃菌科微生物的數(shù)量與纖維素消化利用存在密切關(guān)系。由此可以看出，驢后腸具有極強(qiáng)的纖維素分解微生物基礎(chǔ)，可以很好地解釋其耐粗飼的原因。

3.2 在屬水平的微生物群落結(jié)構(gòu)組成 在屬的水平上觀察細(xì)菌組成時(shí)，青海毛驢前腸的優(yōu)勢(shì)菌屬為鏈球菌屬、放線菌屬和乳酸桿菌屬，青海毛驢后腸的優(yōu)勢(shì)菌屬為理研菌屬、密螺旋體和乳酸桿菌屬。在青海毛驢中，乳酸桿菌在胃內(nèi)和小腸內(nèi)的平均相對(duì)豐度高于盲內(nèi)和直內(nèi)，表明乳酸桿菌是青海毛驢前腸的主要屬。據(jù)報(bào)道，乳酸桿菌具有非纖維性碳水化合物降解能力（如戊糖、己糖和淀粉）[34]，參與膽汁鹽的解偶聯(lián)[35]，并通過(guò)產(chǎn)生抗微生物物質(zhì)（如細(xì)菌素和乳酸鹽）或與病原菌競(jìng)爭(zhēng)粘膜粘附位點(diǎn)和營(yíng)養(yǎng)物來(lái)抑制病原菌的增殖[36-37]。劉桂琴等[19]在驢腸道微生物多樣性及代謝功能差異分析的研究表明，前腸中乳酸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群，約占50.1%，其次為鏈球菌屬，占21.2%。Liu 等[38]研究表明，在屬水平上，乳酸桿菌在前腸中占優(yōu)勢(shì)，而鏈球菌在后腸中占優(yōu)勢(shì)。淀粉分解細(xì)菌-鏈球菌總是存在于飼喂高濃度日糧的反芻動(dòng)物的瘤胃中[39]。與乳酸桿菌屬相似，其發(fā)酵產(chǎn)物乳酸鹽使腸粘膜成為酸性環(huán)境，因此，乳酸桿菌和鏈球菌都被認(rèn)為是對(duì)馬屬動(dòng)物有益的益生菌[40-41]。

3.3α多樣性分析 在細(xì)菌門(mén)水平上，變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和疣菌群門(mén)在青海毛驢的占比高于德州驢；在屬水平上，乳酸菌屬在德州驢高于青海毛驢；放線菌屬在青海毛驢的胃內(nèi)和小腸內(nèi)，德州驢幾乎沒(méi)有；毛螺菌屬在青海毛驢中的豐富度高于德州驢，葉綠體只在青海毛驢組出現(xiàn)，且只存在胃內(nèi)中。葉綠體在青海毛驢的胃里分布的比較多，可能與青海地區(qū)海拔高，植被光合作用較強(qiáng)以及飼料因素有關(guān)，所以飼料中的含量相對(duì)較高。

青海地區(qū)比德州地區(qū)海拔高，隨著海拔高度的增加溫度會(huì)隨之下降，而腸道菌群的物種組成易受環(huán)境溫度的影響，環(huán)境溫度降低會(huì)導(dǎo)致菌群α多樣性降低[42-43]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了隨著溫度的降低，小鼠腸道菌群的α多樣性會(huì)隨之下降。Zietak 等[44]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期生活在12℃的小鼠腸道菌群的α多樣性明顯低于生活在29℃的小鼠。但也有研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境溫度對(duì)宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響也較小，如Li 等[45]研究發(fā)現(xiàn)生活在溫暖環(huán)境（22℃）的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與生活在寒冷環(huán)境（4℃）的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)相似。隨著海拔高度增加，宿主生活環(huán)境中的氧濃度不斷下降，但低氧并不是影響腸道菌群結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵因素[46]；如Lucking 等[46]研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期處于低氧狀態(tài)下小鼠腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)與正常小鼠相似；Khanna 等[47]的研究也證實(shí)宿主處于低氧環(huán)境時(shí)腸道菌群結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。梁田等[48]研究也發(fā)現(xiàn)生活在不同海拔高度的藏族人群腸道菌群結(jié)構(gòu)相似，無(wú)明顯差異，因此推測(cè)低溫和低氧等環(huán)境因素可能對(duì)藏族人腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響較小。在趙俊松等[49]的研究中西藏恒河猴種群的腸道微生物組成多樣性和種群特有菌群種類(lèi)均高于其他5 個(gè)地理種群（云南大理、貴州貴陽(yáng)、四川西昌、廣西南寧、海南?？冢?，即西藏種群中腸道微生物菌群的多樣性最高，且擁有最多種類(lèi)的特有菌群；同時(shí)，青藏高原地區(qū)的低溫、低氧和強(qiáng)紫外線的高海拔環(huán)境也有可能對(duì)恒河猴腸道微生物的組成多樣性產(chǎn)生影響[50]，幫助恒河猴適應(yīng)青藏高原地區(qū)的高海拔環(huán)境[51]。Liu 等[52]通過(guò)高通量測(cè)序V3-V4 區(qū)16s rRNA 基因來(lái)分析藏野驢（中國(guó)青海省海北州高寒草甸）和非洲野驢（中國(guó)青海省玉樹(shù)州沼澤草甸）的腸道微生物群，結(jié)果表明，藏野驢的干物質(zhì)消化率顯著高于非洲野驢，兩組之間的α多樣性沒(méi)有顯著差異，但β多樣性差異顯著，藏野驢比非洲野驢擁有相對(duì)更復(fù)雜的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)，總體結(jié)果表明，藏野驢在干物質(zhì)消化、腸道微生物群落組成和功能方面均優(yōu)于非洲野驢。本文中青海毛驢地處高原，青海毛驢的菌群多樣性和豐富度均高于德州驢，說(shuō)明青海毛驢有其獨(dú)特的腸道菌群以適應(yīng)高原的低溫、低氧以及高海拔。但是目前，低溫和低氧對(duì)于腸道菌群結(jié)構(gòu)的具體作用機(jī)制尚不清楚，需要更多的研究與數(shù)據(jù)支持。

3.4 功能預(yù)測(cè) 為探索微生物群的潛在功能，本實(shí)驗(yàn)使用PICRUSt 來(lái)確定不同腸道位置相關(guān)微生物群的潛在功能，結(jié)果顯示，碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝基因（Carbo hydrate Transport and Metabolism）除了在青海毛驢胃外，在其余各組均呈現(xiàn)高豐度分布狀態(tài)；氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝基因（Amino Acid Transport and Metabolism）除了德州驢小腸外，其余樣品中均呈現(xiàn)高豐度分布狀態(tài)，說(shuō)明腸道中碳源物質(zhì)代表碳水化合物和氮源物質(zhì)代表氨基酸兩種物質(zhì)代謝旺盛。這與其他動(dòng)物的腸道微生物群的功能一致[25-26]，也對(duì)應(yīng)于微生物群的基礎(chǔ)代謝功能及其生長(zhǎng)和增殖所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如碳源和氮源）[53]。

4 結(jié) 論

本研究主要基于16S rRNA 基因高通量測(cè)序研究了青海毛驢的不同部位腸道微生物的差異。結(jié)果表明，青海毛驢的菌群多樣性和豐富度均高于山東德州驢，且后腸的菌群多樣性和豐富度均高于前腸。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)青海毛驢的腸道微生物群有了更多的了解，為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。