胡 焓 馮 丹 田佳玉 童勝雄 張書(shū)力（武漢市第一醫(yī)院疼痛科，武漢 430022）

坐骨神經(jīng)痛（sciatica）是以椎間盤突出、腰椎退行性病變引起的一種外周神經(jīng)病理性疼痛，以陣發(fā)性、持續(xù)性麻木疼痛為主要臨床癥狀，其疼痛劇烈，發(fā)病率高達(dá)40%，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量［1-2］。坐骨神經(jīng)痛的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且不明確，目前研究發(fā)現(xiàn)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、星型膠質(zhì)細(xì)胞活化、神經(jīng)損傷等是導(dǎo)致坐骨神經(jīng)痛等神經(jīng)疼痛的關(guān)鍵因素［3］。炎癥介質(zhì)TNF-α不僅可以增加神經(jīng)節(jié)中鈉通道電流的產(chǎn)生，加劇嚙齒動(dòng)物模型機(jī)械異常疼痛，還可通過(guò)激活轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路表達(dá)來(lái)激活星形膠質(zhì)細(xì)胞、炎癥反應(yīng)等，介導(dǎo)神經(jīng)病理性疼痛進(jìn)程［4-6］。但TNF-α/STAT3通路的調(diào)控機(jī)制在坐骨神經(jīng)痛過(guò)程中的研究較少。天然藥物天麻中的天麻素在臨床上常用于頭痛、癲癇、神經(jīng)衰弱等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療，且近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，天麻素對(duì)長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的外周神經(jīng)病理性疼痛有較好的鎮(zhèn)痛效果，但其鎮(zhèn)痛機(jī)制還不甚明確［7-8］。本研究建立大鼠坐骨神經(jīng)痛疼痛模型，從TNF-α/STAT3通路探討天麻素的鎮(zhèn)痛機(jī)制，以期闡明坐骨神經(jīng)痛疼痛的分子生物學(xué)機(jī)制，為臨床合理用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠60只，7～8周齡，體質(zhì)量220～240 g，由浙江維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2020-0002。所有大鼠于武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物房中常規(guī)飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照國(guó)際疼痛學(xué)會(huì)（IASP）綱領(lǐng)和要求實(shí)施，并經(jīng)武漢市第一醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：IACUC-01（20190917）。

1.1.2 主要試劑及儀器 天麻素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海寶曼生物科技有限公司，貨號(hào)：D1355，規(guī)格：20 mg；HE染色試劑盒購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司，貨 號(hào)：LMO105；前 列 腺 素E2（prostaglandin E2，PGE2）及降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）等ELISA試劑盒購(gòu)自上海圻明生物科技有限公司及浙江羽翔生物科技有限公司，貨號(hào)：R31545、EYX-DD02605；雞抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）、小鼠抗TNF-α、兔抗電壓門控鈉通道亞型（voltage-gated sodium channel subtype，Nav1.6）、雞抗微管相關(guān)蛋白2（microtubule-associated protein 2，MAP2）購(gòu) 自 美 國(guó)Abcam公 司，貨 號(hào)：ab134436、ab109322、ab68153、ab5392；TNF-α、STAT3、Nav1.6、IL-6、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、趨化因子配體2（CCL2）等抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab109322、ab68153、ab230654、ab208113、ab179800、ab25124。蛋白電泳儀（型號(hào)：1659001）購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；免疫熒光共聚焦顯微鏡（型號(hào)：DM2500）購(gòu)自德國(guó)徠卡公司；Von Frey電子測(cè)痛儀（型號(hào)：BIOEVF4）購(gòu)自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；熱輻射刺激器（型號(hào)：BME-410C）購(gòu)自天津伯爾尼科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)［9］掀開(kāi)大鼠L6硬脊膜置入PE-10導(dǎo)管，行坐骨神經(jīng)結(jié)扎手術(shù)構(gòu)建坐骨神經(jīng)痛模型。術(shù)后2 d觀察大鼠行為，若大鼠出現(xiàn)激惹行為且機(jī)械痛敏閾值（paw withdrawal latency，PWL）及熱刺激反應(yīng)潛伏期（paw withdrawal threshold，PWT）檢測(cè)結(jié)果異常，視為造模成功。共造模成功50只，隨機(jī)分為模型組、天麻素組（120 mg/kg）、TNF-α過(guò)表達(dá)的重組腺病毒組（Ad-TNF-α，4μl/只）、空腺病毒組（Ad-GFP，4μl/只）、天麻素+Ad-TNF-α組（120 mg/kg+4μl/只），每組10只；另取10只大鼠，只暴露L6硬脊膜不結(jié)扎，其余操作同模型組，作為假手術(shù)組。各組大鼠均于術(shù)后第3天開(kāi)始給藥，天麻素組參照文獻(xiàn)［10］設(shè)置劑量并用生理鹽水稀釋成濃度為12.00 mg/ml的混懸液，按10 ml/kg的容積經(jīng)腹腔注射給藥，1次/d；Ad-TNF-α及Ad-GFP參照文獻(xiàn)［11］經(jīng)脊髓鞘內(nèi)注射，4μl/只，2次/周；天麻素+Ad-TNF-α組腹腔注射天麻素的同時(shí)，經(jīng)鞘內(nèi)注射Ad-TNF-α溶液；模型組和假手術(shù)組注射等劑量生理鹽水，各組連續(xù)給藥14 d。

1.2.2 大鼠一般行為觀察 各組大鼠均于給藥期間觀察飲食、活動(dòng)及精神狀態(tài)。

1.2.3 大鼠PWT及PWL檢測(cè) 各組大鼠于末次給藥12 h后，參照文獻(xiàn)［10］用Von Frey電子測(cè)痛儀及熱輻射刺激器測(cè)定各組大鼠PWT及PWL值。

1.2.4 大鼠背根神經(jīng)節(jié)標(biāo)本采集 各組大鼠檢測(cè)完P(guān)WT及PWL后，麻醉處死大鼠，迅速解剖手術(shù)同側(cè)的L4、L6、L5段背根神經(jīng)節(jié)，剪取約3 cm組織置于-80℃冰箱保存，其余組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h后備用。

1.2.5 大鼠背根神經(jīng)節(jié)痛覺(jué)敏感相關(guān)物質(zhì)CGRP及PGE2水平檢測(cè) 取1.2.4項(xiàng)下-80℃冰箱保存的背根神經(jīng)節(jié)，用組織勻漿研磨器勻漿、研磨后，離心取上清液，按CGRP及PGE2試劑盒說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)CGRP及PGE2水平。

1.2.6 各組大鼠脊髓HE染色 取1.2.4項(xiàng)下4%多聚甲醛固定的背根神經(jīng)節(jié)組織，常規(guī)處理并切成20μm厚的切片。取部分切片按HE試劑盒說(shuō)明書(shū)染色、封片后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。

1.2.7 免疫熒光雙標(biāo)記法檢測(cè)TNF-α與GFAP共表達(dá)水平 取1.2.6項(xiàng)下部分切片，室溫風(fēng)化及0.5%曲拉通（Triton X-100）透化后，加入一抗（小鼠抗TNF-α、雞抗GFAP，稀釋倍數(shù)均為1∶500）4℃孵育過(guò)夜后加入二抗（TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗雞IgG，稀釋倍數(shù)為1∶200）孵育顯色后，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.8 免疫熒光雙標(biāo)記法檢測(cè)TNF-α、Nav1.6與MAP2共表達(dá)水平 取1.2.6項(xiàng)下部分切片，室溫風(fēng)化及0.5%曲拉通（Triton X-100）透化后，加入一抗（小鼠抗TNF-α、兔抗Nav1.6、雞抗MAP2，稀釋倍數(shù)均為1∶500）4℃孵育過(guò)夜后加入二抗（TRITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、TRITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、FITC標(biāo)記的山羊抗雞IgG，稀釋倍數(shù)為1∶200），DAPI復(fù)染孵育顯色后，置于熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.9 Western blot檢測(cè)背根神經(jīng)節(jié)組織TNF-α、STAT3、Nav1.6、CCL2、IL-6、COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取1.2.4項(xiàng)下-80℃冰箱保存的背根神經(jīng)節(jié)組織，于4℃解凍后剪碎，加入RIPA裂解液，用組織勻漿器置于冰上研磨、裂解、離心后取上清液，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取50μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉反應(yīng)后，加入抗體（TNF-α、STAT3、Nav1.6、CCL2、IL-6、COX-2抗體，稀釋倍數(shù)均為1∶800，內(nèi)參β-actin，1∶2 000）4℃孵育過(guò)夜，加入1∶1 000兔抗鼠二抗溶液，室溫孵育及漂洗后，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色并拍照，并以Image J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 天麻素對(duì)大鼠一般行為的影響 假手術(shù)組大鼠進(jìn)食、飲水及精神活動(dòng)正常；模型組大鼠進(jìn)食、飲水及活動(dòng)量減少，精神萎靡，易激惹行為增多；天麻素組大鼠易激惹行為減少，活動(dòng)量有所增加；Ad-TNF-α組大鼠易激惹行為進(jìn)一步增多；天麻素+Ad-TNF-α組、Ad-GFP組大鼠上述行為活動(dòng)變化與模型組相似。

2.2 天麻素對(duì)大鼠PWL、PWT的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠PWL、PWT降低（P＜0.05）。與模型組相比，天麻素組大鼠PWL、PWT升高（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠PWL、PWT降低（P＜0.05）。與天麻素組相比，天麻素+Ad-TNF-α組大鼠PWL、PWT降低（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠PWT、PWL結(jié)果比較（±s）Tab.1 Comparison of PWT and PWL results of rats in each group（±s）

表1 各組大鼠PWT、PWL結(jié)果比較（±s）Tab.1 Comparison of PWT and PWL results of rats in each group（±s）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP n 10 10 10 10 10 10 PWT/s 42.96±2.23 9.96±0.411）28.31±1.121）2）6.30±0.321）2）9.78±0.491）3）9.89±0.421）3）PWL/s 19.94±0.82 6.09±0.311）12.43±0.691）2）4.43±0.291）2）6.63±0.311）3）6.03±0.321）3）

2.3 天麻素對(duì)大鼠痛覺(jué)敏感相關(guān)物質(zhì)CGRP、PGE2表達(dá)水平的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CGRP、PGE2水平升高（P＜0.05）。與模型組相比，天麻素組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CGRP、PGE2水平降低（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠PWL、PWT背根神經(jīng)節(jié)CGRP、PGE2水平升高（P＜0.05）。天麻素+Ad-TNF-α組上述指標(biāo)高于天麻素組（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CGRP、PGE2水平比較（±s）Tab.2 Comparison of CGRP and PGE2 levels in dorsal root ganglion of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CGRP、PGE2水平比較（±s）Tab.2 Comparison of CGRP and PGE2 levels in dorsal root ganglion of rats in each group（±s）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP n 10 10 10 10 10 10 PGE2/（ng·g-1）48.69±4.03 198.96±19.611）85.91±8.021）2）272.30±21.121）2）199.18±19.191）3）199.09±18.201）3）CGRP/（pg·g-1）46.04±3.02 162.39±16.311）73.06±7.281）2）254.33±23.261）2）162.01±15.111）3）163.23±16.121）3）

2.4 天麻素對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)病理形態(tài)的影響假手術(shù)組大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)纖維排列整齊致密，結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠神經(jīng)纖維排列紊亂、軸突及髓鞘崩解、雪旺細(xì)胞破壞較多，郎飛結(jié)構(gòu)重疊、模糊不清。天麻素組大鼠可見(jiàn)神經(jīng)纖維排列較為規(guī)則，雪旺細(xì)胞增殖分化及郎飛結(jié)構(gòu)新生明顯。Ad-TNF-α組大鼠神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)排列紊亂、軸突及髓鞘崩解、雪旺細(xì)胞及郎飛結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重。天麻素+Ad-TNF-α組、Ad-GFP組大鼠上述病理變化與模型組相近，見(jiàn)圖1。

圖1 背根神經(jīng)節(jié)組織HE染色圖（×200）Fig.1 HE staining of dorsal root ganglion tissue（×200）

2.5 天麻素對(duì)大鼠TNF-α、GFAP陽(yáng)性共表達(dá)的影響 與假手術(shù)相比，模型組大鼠TNF-α與GFAP陽(yáng)性共表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，天麻素組大鼠TNF-α與GFAP陽(yáng)性共表達(dá)水平降低（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠TNF-α與GFAP陽(yáng)性共表達(dá)水平升高（P＜0.05）。天麻素+Ad-TNF-α組上述指標(biāo)高于天麻素組（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

表3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織TNF-α與GFAP陽(yáng)性共表達(dá)水平比較（±s）Tab.3 Comparison of TNF-αand GFAP positive co-expression levels in dorsal root ganglion tissues of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)組織TNF-α與GFAP陽(yáng)性共表達(dá)水平比較（±s）Tab.3 Comparison of TNF-αand GFAP positive co-expression levels in dorsal root ganglion tissues of rats in each group（±s）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP n 10 10 10 10 10 10 TNF-α+GFAP+/（n·mm-2）32.22±3.10 59.32±5.141）49.02±4.131）2）70.71±7.121）2）58.52±5.111）3）59.51±5.101）3）

圖2 背根神經(jīng)節(jié)組織TNF-α與GFAP免疫熒光染色圖（×400）Fig.2 Immunofluorescence staining of TNF-αand GFAP in dorsal root ganglion tissue（×400）

2.6 天麻素對(duì)大鼠TNF-α、Nav1.6及MAP2陽(yáng)性共表達(dá)的影響 與假手術(shù)相比，模型組大鼠TNF-α與MAP2、Nav1.6與MAP2陽(yáng)性共表達(dá)水平均升高（P＜0.05）；與模型組相比，天麻素組大鼠TNF-α與MAP2、Nav1.6與MAP2陽(yáng)性共表達(dá)水平降低（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠TNF-α與MAP2、Nav1.6與MAP2陽(yáng)性共表達(dá)水平升高（P＜0.05）。天麻素+Ad-TNF-α組上述指標(biāo)變化與天麻素組相反，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)圖3、圖4、表4。

表4 各組大鼠TNF-α、Nav1.6及MAP2陽(yáng)性共表達(dá)水平比較（±s）Tab.4 Comparison of positive co expression levels of TNF-α，Nav1.6 and MAP2 of rats in each group（±s）

表4 各組大鼠TNF-α、Nav1.6及MAP2陽(yáng)性共表達(dá)水平比較（±s）Tab.4 Comparison of positive co expression levels of TNF-α，Nav1.6 and MAP2 of rats in each group（±s）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP n 10 10 10 10 10 10 TNF-α+MAP2+/（n·mm-2）30.12±3.09 56.12±5.041）46.02±4.031）2）71.01±7.151）2）56.12±5.011）3）56.11±5.091）3）Nav1.6+MAP2+/（n·mm-2）29.86±1.28 52.31±4.681）41.09±3.521）2）77.69±6.241）2）56.32±4.981）3）58.69±4.961）3）

圖3 背根神經(jīng)節(jié)組織TNF-α與MAP2免疫熒光染色圖（×400）Fig.3 Immunofluorescence staining of TNF-αand MAP2 in dorsal root ganglion tissue（×400）

2.7 天麻素對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組相比，模型組大 鼠TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋 白 表 達(dá) 升 高（P＜0.05）；與模型組相比，天麻素組大鼠TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。天麻素+Ad-TNF-α組上述指標(biāo)變化與天麻素組相反，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖5、表5。

表5 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of TNF-α，STAT3 and Nav1.6 protein expressions in dorsal root ganglion of rats in each group（±s，n=10）

表5 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of TNF-α，STAT3 and Nav1.6 protein expressions in dorsal root ganglion of rats in each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP TNF-α/β-actin 1.18±0.11 2.36±0.211）1.61±0.161）2）2.91±0.291）2）2.31±0.211）3）2.40±0.221）3）STAT3/β-actin 1.23±0.10 2.48±0.201）1.52±0.161）2）2.92±0.281）2）2.46±0.211）3）2.45±0.201）3）Nav1.6/β-actin 1.01±0.11 2.26±0.221）1.41±0.141）2）2.89±0.291）2）2.21±0.211）3）2.20±0.221）3）

圖5 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)TNF-α、STAT3、Nav1.6蛋白表達(dá)Fig.5 TNF-α，STAT3 and Nav1.6 protein expressions in dorsal root ganglion of rats in each group

2.8 天麻素對(duì)大鼠背根神經(jīng)節(jié)CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)結(jié)果 與假手術(shù)相比，模型組大鼠CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與模型組相比，天麻素組大鼠CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；Ad-TNF-α組大鼠CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。天麻素+Ad-TNF-α組上述指標(biāo)變化與天麻素組相反，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Ad-GFP組與模型組比較上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖6、表6。

圖6 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)Fig.6 CCL2，IL-6 and COX-2 protein expressions in dorsal root ganglia of rats in each group

表6 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)水平（±s，n=10）Tab.6 Protein expression levels of CCL2，IL-6 and COX-2 in dorsal root ganglia of rats in each group（±s，n=10）

表6 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)水平（±s，n=10）Tab.6 Protein expression levels of CCL2，IL-6 and COX-2 in dorsal root ganglia of rats in each group（±s，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with gastrodin group，3）P＜0.05.

Groups Sham operation Model Gastrodin Ad-TNF-α Gastrodin+Ad-TNF-α Ad-GFP CCL2/β-actin 1.19±0.10 2.01±0.251）1.56±0.161）2）2.85±0.291）2）2.09±0.231）3）2.01±0.201）3）IL-6/β-actin 1.01±0.12 2.19±0.231）1.32±0.151）2）2.76±0.111）2）2.18±0.201）3）2.19±0.201）3）COX-2/β-actin 0.96±0.13 2.35±0.211）1.89±0.171）2）2.95±0.291）2）2.39±0.221）3）2.32±0.211）3）

3 討論

坐骨神經(jīng)痛疼痛常呈放射性，疼痛常分布在臀部大腿及小腿后外側(cè)、足外側(cè)等，其疼痛癥狀常由坐骨神經(jīng)壓迫、損傷、炎癥等因素刺激所致［12］。本研究采用壓迫坐骨神經(jīng)法建立坐骨神經(jīng)痛模型，發(fā)現(xiàn)大鼠易激惹行為增多，且足底PWT、PWL降低，大鼠出現(xiàn)疼痛及疼痛敏感性增強(qiáng)癥狀，提示造模成功。另外，機(jī)體CGRP及PGE2變化與疼痛關(guān)系密切。ZHANG等［13］發(fā)現(xiàn)具有感受傷害信號(hào)的神經(jīng)介質(zhì)CGRP在三叉神經(jīng)痛患者血漿中表達(dá)升高，且CGRP表達(dá)增多可導(dǎo)致痛覺(jué)敏感提高，并長(zhǎng)時(shí)間維持傷害性疼痛及炎癥性疼痛狀態(tài)，加重患者疼痛感。PINTO等［14］發(fā)現(xiàn)PGE2與炎癥性疼痛產(chǎn)生有關(guān)，能夠通過(guò)調(diào)控非特異性陽(yáng)離子通道瞬態(tài)受體電位香草酸1、嘌呤能受體、電壓門控鈣或鈉通道等傷害感受器中的通道蛋白表達(dá)，導(dǎo)致痛覺(jué)過(guò)敏，加重疼痛感。本研究在坐骨神經(jīng)痛大鼠坐骨神經(jīng)節(jié)中也檢測(cè)到CGRP及PGE2表達(dá)水平升高，進(jìn)一步表明造模成功。

大量研究證實(shí)炎癥細(xì)胞因子TNF-α在慢性疼痛的建立和維持中發(fā)揮重要作用［15］。KANDA等［16］發(fā)現(xiàn)脊髓中活化的膠質(zhì)細(xì)胞可分泌促炎介質(zhì)TNF-α、IL-6、COX-2等刺激神經(jīng)興奮，促進(jìn)機(jī)體對(duì)傷害刺激的敏感性，而鞘內(nèi)注射TNF-α抑制劑可迅速降低血管中COX-2表達(dá)，減輕神經(jīng)損傷后的機(jī)械性異常疼痛，并推測(cè)TNF-α是參與疼痛敏化，導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛的重要促炎細(xì)胞因子。本研究在坐骨神經(jīng)痛坐骨神經(jīng)節(jié)中檢測(cè)到TNF-α與MAP2共表達(dá)神經(jīng)元、TNF-α與GFAP共表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞均顯著增加，且鞘內(nèi)注射TNF-α重組腺病毒，進(jìn)一步激活TNF-α在神經(jīng)元及活化膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)后，大鼠足底PWT、PWL減少及痛覺(jué)過(guò)敏相關(guān)物質(zhì)CGRP、PGE2表達(dá)進(jìn)一步升高，證實(shí)了TNF-α與疼痛敏化關(guān)系密切。

另外電壓門控鈉通道Nav1.6及STAT3活化參與痛覺(jué)敏化過(guò)程。ZHANG等［4］及ZYBURA等［17］發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮和放電模式中起關(guān)鍵作用的電壓門控鈉通道亞型Nav1.6表達(dá)升高，可調(diào)控神經(jīng)元的動(dòng)作電位和放電特性，并助長(zhǎng)神經(jīng)性疼痛的發(fā)生。廖維勇等［18］及MATSUMOTO等［19］證實(shí)STAT3及磷酸化水平增加，可促進(jìn)炎癥介質(zhì)如CCL2、TNF-α表達(dá)增加，而抑制STAT3通路活化可降低星形膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥介質(zhì)釋放，減弱大鼠機(jī)械異常性疼痛和熱痛覺(jué)過(guò)敏。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，Nav1.6及STAT3活化與TNF-α的調(diào)控有關(guān)。DING等［11］發(fā)現(xiàn)Nav1.6、STAT3及TNF-α可重疊表達(dá)于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，TNF-α抑制劑可抑制Nav1.6表達(dá)的上調(diào)及STAT3通路的激活，推測(cè)TNF-α降低大鼠神經(jīng)病理性疼痛的痛覺(jué)敏化過(guò)程可能與抑制Nav1.6及STAT3有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)TNF-α在坐骨神經(jīng)痛模型大鼠及Ad-TNF-α組表達(dá)升高的同時(shí)，Nav1.6及STAT3、CCL2、IL-6、COX-2蛋白表達(dá)也隨之升高，提示TNF-α可能通過(guò)介導(dǎo)Nav1.6及STAT3通路活化參與坐骨神經(jīng)痛大鼠疼痛敏化過(guò)程。

抗抑郁藥、抗炎藥、局麻藥、辣椒素、阿片物質(zhì)等是目前治療坐骨神經(jīng)痛等神經(jīng)病理性痛的常用藥物，但這些藥副作用較大，且長(zhǎng)期應(yīng)用易發(fā)生耐受性和成癮性［3］。天麻素為來(lái)源于天麻的活性成分，臨床上常用其治療三叉神經(jīng)痛、偏頭疼等中樞神經(jīng)疼痛［7］。但坐骨神經(jīng)痛等外周神經(jīng)疼痛與外周神經(jīng)及脊髓神經(jīng)元興奮及異位自發(fā)放電活動(dòng)關(guān)系密切，且因不受血腦屏障保護(hù)而不同于中樞神經(jīng)病理性疼痛［20-21］。QIU等［22］發(fā)現(xiàn)天麻素可抑制酸敏感離子通道介導(dǎo)的質(zhì)子門控電流改變大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元興奮及去極化動(dòng)作電位數(shù)量，從而減輕大鼠疼痛癥狀，提示天麻素對(duì)外周神經(jīng)疼痛具有一定的治療效果。本研究發(fā)現(xiàn)，天麻素可抑制坐骨神經(jīng)痛大鼠足底PWT、PWL減少及痛覺(jué)過(guò)敏相關(guān)物質(zhì)CGRP、PGE2增多，并降低TNF-α介導(dǎo)的Nav1.6及STAT3通路在背根神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)，且上述作用可被Ad-TNF-α逆轉(zhuǎn)，提示天麻素降低坐骨神經(jīng)痛大鼠痛覺(jué)敏感性作用，可能與抑制TNF-α/STAT3/Nav1.6通路有關(guān)。

綜上所述，天麻素可能通過(guò)抑制TNF-α/STAT3通路激活下調(diào)Nav1.6表達(dá)，降低坐骨神經(jīng)痛模型大鼠痛覺(jué)敏感性，為臨床治療坐骨神經(jīng)痛和闡明天麻素發(fā)揮鎮(zhèn)痛的可能機(jī)制提供一定參考。但TNF-α/STAT3通路與痛覺(jué)敏感性的靶向調(diào)控關(guān)系復(fù)雜，且TNF-α/STAT3與疼痛相關(guān)通路的內(nèi)在作用機(jī)制仍有待深入探討。