常 青

(濮陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濮陽(yáng) 457000)

作為陸地植物初級(jí)生產(chǎn)力的主要限制因子，氮在植物生長(zhǎng)發(fā)育及生理代謝中具有不可替代的作用[1]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，施用氮肥是保障作物品質(zhì)及產(chǎn)量的常規(guī)措施，然而施氮量與產(chǎn)量間存在一定閾值，當(dāng)?shù)适┯眠^(guò)高時(shí)作物的氮肥利用率反而降低[2]。此外，氮肥的廣泛運(yùn)用和過(guò)量施用帶來(lái)的負(fù)面影響日趨嚴(yán)重，如何有效降低氮肥使用量，提高作物氮利用率已成為發(fā)展可持續(xù)性農(nóng)業(yè)的關(guān)鍵問(wèn)題[3]。為了提高作物氮肥利用率，已經(jīng)開(kāi)展了作物育種、緩釋控釋技術(shù)以及均衡施肥等多種策略[4]，盡管上述策略在作物生產(chǎn)中表現(xiàn)出良好的生產(chǎn)效果，但確定最佳氮素管理實(shí)踐，仍是一個(gè)亟待探索的過(guò)程。

關(guān)于施氮水平對(duì)植物的影響，許多研究已經(jīng)探索了煙草、大豆及水稻等減肥實(shí)踐，發(fā)現(xiàn)適宜減施氮肥，產(chǎn)量無(wú)明顯變化，當(dāng)減施比例提高時(shí)，氮肥利用率顯著下降[8]，但不同作物適宜的氮肥減施比例不同。玉米(ZeamaysL.)是世界范圍內(nèi)廣泛種植的農(nóng)作物之一，具有較高的代謝能力，為了獲得最大產(chǎn)量，玉米植株需要大量的化學(xué)氮肥，使用的主要氮肥類型是尿素[9]。因此，在不影響作物產(chǎn)量的情況下提高尿素中氮的利用效率，仍是亟待解決的問(wèn)題。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

試驗(yàn)于2020年5—6月在濮陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院溫室大棚中進(jìn)行。供試玉米品種為鄭單958，是河南省目前主栽的優(yōu)良品種之一，使用1%次氯酸鈉對(duì)種子表面進(jìn)行消毒并暗處理催芽24 h。供試氮肥為15N-尿素(15N含量為10.11%)，購(gòu)自上?；ぱ芯吭河邢薰尽９┰嚿锾坑珊幽鲜∩锾抗こ碳夹g(shù)研究中心提供，采用玉米和小麥秸稈(質(zhì)量比為1 ∶2)在低氧、440 ℃條件下連續(xù)炭化65 min制得，其基本性質(zhì)：全碳含量為49.82%，總氮含量為2.13%，比表面積為15.66 m2/g，容重為 0.26 g/cm3，pH值為8.36，主要官能團(tuán)為羥基、烷烴和酰胺基[13]。

供試土壤取自濮陽(yáng)市農(nóng)業(yè)科學(xué)院清豐試驗(yàn)田(114°46′49″N，35°44′17″E)，為0～20 cm土層土壤。土壤類型為黃褐土。土壤理化性質(zhì)：有機(jī)質(zhì)含量為20.59 g/kg，全氮含量為1.16 g/kg，堿解氮含量為78.44 mg/kg，有效磷含量為19.01 mg/kg，速效鉀含量為137.36 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置2因素3水平完全隨機(jī)組合設(shè)計(jì)，因素1：施用生物炭(BC)，設(shè)置施用0、3%、9%等3個(gè)生物炭水平，分別記作：BC0、BC3、BC9；因素2：施用氮素(N)，設(shè)置施用100%、80%、60%等3個(gè)氮素水平，分別記作：N100、N80、N60；共設(shè)置9個(gè)處理組合。其中，施用生物炭處理的0、3%、9%為施用生物炭的質(zhì)量與培養(yǎng)土壤質(zhì)量之比，施用氮素處理的100%、80%、60%為施氮量與常規(guī)施氮量(150 kg/hm2，種植密度7.5×104株/hm2)的質(zhì)量之比，即N100、N80、N60的施氮量分別為2.0、1.6、1.2 g/盆。每個(gè)處理重復(fù)3次。

采用黑色聚乙烯塑膠桶，每盆裝土4 kg。稱取相應(yīng)質(zhì)量的上述生物炭及15N-尿素與土壤充分?jǐn)嚢杈鶆蚝笱b盆，其中每盆純磷施入量為1 g(P2O5∶K2O=1 ∶1)。每盆播種已催芽的玉米種子6粒，7 d后間苗至每盆3株，土壤持水量保持為80%，共培育35 d。

1.3 樣品采集及測(cè)定分析

1.3.1 玉米植株、土壤氮測(cè)定 培養(yǎng)結(jié)束后，將玉米植物地上部、根系分離，65 ℃烘干并稱質(zhì)量以確定植株干物質(zhì)。在測(cè)定15N豐度和全氮(TN)含量之前，將植物樣品和風(fēng)干土壤樣品細(xì)磨并通過(guò) 0.15 mm 網(wǎng)篩。植物和土壤15N同位素比采用穩(wěn)定同位素比質(zhì)譜儀(DELTA plus XP，Thermo Finnigan，USA)測(cè)定；葉片全碳(TC)含量采用重鉻酸鉀-硫酸氧化法測(cè)定[14]。

1.3.2 核磁共振和代謝物分析測(cè)定 稱取0.50 g植物樣品在液氮中快速研磨，移入離心管中 7 000 r/min、4 ℃快速離心5 min，加入2 mL甲醇和2 mL三氯甲烷，渦旋30 s，并在冰浴中超聲提取 60 s。然后10 000 r/min、4 ℃高速離心20 min；重復(fù)該步驟3次，分別收集底部有機(jī)相(非極性相)和上層水相(極性相)。對(duì)于水相，在真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇(<5%)，然后將上清液在-80 ℃冷凍24 h。對(duì)于有機(jī)相，在旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器中進(jìn)行減壓干燥，接著加入800 μL 純重水(D2O)、160 μL磷酸鹽緩沖鹽水(pH值為7)、10%重水以及0.02 mmol/L 3-三甲基硅基-[2，2，3，3-D4]-丙酸鈉(TSP)，旋蒸蒸發(fā)3 min；加入1 mL含有0.03% 四甲基硅烷(TMS)的氚代三氯甲烷-d(CDCl3)至干燥有機(jī)組分中，并采用TSP和TMS作為內(nèi)標(biāo)。將水樣、有機(jī)相提取物分別轉(zhuǎn)移到埃彭多夫管中，12 000g離心 5 min。移取0.65 mL樣品轉(zhuǎn)移到核磁共振(NMR)樣品管中。對(duì)每個(gè)樣本進(jìn)行核磁共振分析。

使用Bruker AVANCE Ⅲ 600 超導(dǎo)高分辨核磁共振譜儀(Bruker AVANCE Ⅲ 600，Germany)掃描生成極性和非極性代謝譜。使用TopSpin 2.1軟件(Bruker Biospin)對(duì)樣品處理、自動(dòng)化和采集進(jìn)行控制，對(duì)于水相、有機(jī)相樣品，皆使用標(biāo)準(zhǔn)的1H 90°脈沖序列，每個(gè)光譜為32 k數(shù)據(jù)點(diǎn)，譜寬為16×10-6Hz。水相頻域譜采用手動(dòng)調(diào)整，有機(jī)相采用CDCl3對(duì)光譜自動(dòng)調(diào)整，1H NMR譜的基線校正、相位校正以及等寬累積處理參考Sun等的研究[16]。以上分析均委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3.3 氮素相關(guān)代謝基因表達(dá)分析 使用TRIpure Reagent Plant RNA Mini Kit(BioTeke，中國(guó)北京)按照試劑盒說(shuō)明提取葉部、根系總RNA，使用高容量cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript? Ⅱ QRT SuperMix，Vazyme Biotech，中國(guó)南京)按照試劑盒說(shuō)明合成第1條cDNA。以ZmUBC為看家基因，采用StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng)(ThermoFisher Scientific，USA)對(duì)cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析。氮素相關(guān)代謝基因(ZmAS1、ZmGS1)的特異性引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Premix ExTaqⅡ、1.0 μL正向引物、1.0 μL反向引物、2.0 μL cDNA和10 μL ddH2O。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72.0 ℃ 30 s，40個(gè)PCR循環(huán)。借助RQ Manager(ThermoFisher Scientific，USA)采用2-ΔΔCT斷層掃描方法分析數(shù)據(jù)。

表1 ZmGS1、ZmAS2和ZmUBC的實(shí)時(shí)PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

來(lái)自15N標(biāo)記尿素的氮素(Ndff)、土壤氮素殘留以及植物氮素利用率(NUE)等的計(jì)算公式[17]如下：

玉米器官Ndff=玉米器官15N原子百分超/15N- 尿素原子百分超×100%；

土壤Ndff=土壤的15N原子百分超/15N-尿素原子百分超×100%；

NUE=玉米干質(zhì)量×植株全氮含量×玉米整株Ndff/施氮量×100%；

土壤殘留率=土壤總干質(zhì)量×土壤全 N含量×土壤Ndff/施氮量×100%；

氮肥損失率=100%-NUE-土壤氮肥殘留率。

根據(jù)Sun等的方法[16]分配和量化代謝物，基于代謝物的半定量數(shù)據(jù)計(jì)算處理之間代謝物的響應(yīng)比生成代謝物相關(guān)網(wǎng)絡(luò)，并采用Cytoscape 2.8.3(http：//www.cytoscape.org/)對(duì)玉米氮組分與代謝物之間的關(guān)系進(jìn)行典型對(duì)應(yīng)分析(CCA)。采用進(jìn)行雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)和最小顯著法(LSD)進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析(P<0.05)，圖片采用Origin 2018進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物炭與氮肥配施對(duì)玉米氮相關(guān)指標(biāo)的影響

2.2 生物炭與氮肥配施對(duì)15N標(biāo)記氮肥去向的影響

由圖1-A可知，在不添加生物炭(BC0)處理中，隨著施氮量降低，玉米地上部的N利用率升高，而玉米根部的N利用率降低。在添加BC處理中，玉米地上部的氮利用率隨著施氮量的降低而增加，這與各處理在根系中的趨勢(shì)一致。就BC處理來(lái)看，與不添加生物炭處理(BC0)相比，以添加3%比例的生物炭處理(BC3)具有最高的土壤殘留率和最低的氮肥損失率，而在9%比例的生物炭處理(BC9)中，玉米地上部利用率、根系利用率及土壤殘留率皆明顯降低、氮肥損失率增加。由圖1-B可知，在玉米氮素利用率中，當(dāng)添加3%生物炭且氮肥施用比例為60%時(shí)(BC3N60)，玉米植株的氮素利用率最高，為29.4%；其他處理較BC3N60處理降低2.0～14.7百分點(diǎn)，其中與BC3N80、BC0N80、BC0N100處理無(wú)顯著差異外，皆顯著高于其他處理。

表2 不同生物炭和氮肥處理對(duì)玉米葉部礦質(zhì)氮組分、全氮和全碳含量的影響

2.3 生物炭與氮肥配施對(duì)玉米葉片氮代謝譜的影響

由圖2可知，在玉米幼苗的葉片中，降低施N水平導(dǎo)致氨基酸含量普遍增加。當(dāng)添加BC時(shí)，減少N輸入則減少了葉片中的糖庫(kù)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)玉米葉片中的糖分對(duì)N減少和BC添加在單個(gè)糖指標(biāo)中具有強(qiáng)烈響應(yīng)。結(jié)果表明，某些糖組分的反應(yīng)不僅在合成量上同時(shí)也在組分上都與糖庫(kù)總體趨勢(shì)不同，例如果糖、蔗糖、α-葡萄糖和β-葡萄糖含量隨著N添加量的減少而減少；而加入BC后，果糖和蔗糖含量均不同程度的表現(xiàn)為增加趨勢(shì)，表明生物炭降低了糖水解的通量。此外，添加BC的情況下，減少N施入量改變了葉片中的有機(jī)酸含量，特別是當(dāng)BC添加量為9%時(shí)。與BC0N100處理相比，由于減少N添加、BC施用比例提高使得乳酸和莽草酸含量增加，同時(shí)其在不同處理間的有機(jī)酸譜中顯示出非常高的穩(wěn)定性。在葉片中，與BC0N100對(duì)照相比，在有機(jī)酸庫(kù)中，如蘋(píng)果酸和琥珀酸含量，隨著B(niǎo)C添加和N減少，皆表現(xiàn)為下降趨勢(shì)。

2.4 生物炭與氮肥配施下玉米葉片氮代謝物網(wǎng)絡(luò)相關(guān)分析

基于添加生物炭比例的影響，構(gòu)建了基于相關(guān)性的共線網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性圖可以表明添加生物炭后各氨基酸組分網(wǎng)絡(luò)特性的變化。由圖3-D可知，在葉片中，隨著生物炭施用比例的增加，互相關(guān)聯(lián)較少(1～10條)的代謝物數(shù)量呈先增加后減少趨勢(shì)，而相互關(guān)聯(lián)較多(11～20條)的代謝物數(shù)量減少。將BC添加比例從0增加到3%，然后到9%后，其網(wǎng)絡(luò)密度從0.19降低到0.14，然后增加到0.15；網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性從0.60增加到0.63，然后上升到0.69。整體來(lái)看，在葉片中，施用BC減少了氨基酸組分關(guān)系間的數(shù)量，隨后對(duì)網(wǎng)絡(luò)密度產(chǎn)生了負(fù)面影響，表明添加生物炭稀釋了新陳代謝間的關(guān)系從而達(dá)到了調(diào)節(jié)氮素代謝的目的。

2.5 生物炭與氮肥配施對(duì)玉米葉片氮素代謝基因表達(dá)影響

植物中的氮代謝過(guò)程已被證明是多種相互依賴的途徑，其中涉及許多基因，包含一系列蛋白質(zhì)、酶和代謝物。其中，谷氨酰胺合成酶(GS)和天冬酰胺合成酶(AS)被認(rèn)為在植物氮代謝過(guò)程中具有重要作用。由圖4-A可知，在ZmGS1相對(duì)表達(dá)水平方面，相對(duì)豐度峰值出現(xiàn)在BC3N80處理，其次為BC9N100處理，二者無(wú)顯著差異，同時(shí)BC3N80處理顯著高于其他處理，而B(niǎo)C9N100處理與任一處理均無(wú)顯著差異。在ZmAS1相對(duì)表達(dá)水平方面(圖4-B)，以BC0N80處理的相對(duì)表達(dá)水平最高，其他處理較其降低11.81%～47.22%，其中與BC0N60、BC3N100、BC9N60處理的差異達(dá)顯著水平。此外，在添加BC條件下，ZmGS1基因的相對(duì)表達(dá)豐度整體比ZmAS1基因更高，這意味著在添加BC的代謝調(diào)整過(guò)程中，ZmGS1基因可能比ZmAS1基因更敏感。

2.6 生物炭與氮肥配施下氮素組分與代謝組特征的典范對(duì)應(yīng)分析

3 討論與結(jié)論

相同的代謝物可能涉及多個(gè)代謝途徑，因此代謝物之間的關(guān)系可以采用網(wǎng)絡(luò)相關(guān)性分析來(lái)揭示。本研究結(jié)果表明，葉片的網(wǎng)絡(luò)密度、網(wǎng)絡(luò)異質(zhì)性隨著B(niǎo)C施用比例的增加分別呈降低、增加趨勢(shì)。前人研究表明，為了讓細(xì)胞適應(yīng)新的環(huán)境條件，植物體的新陳代謝會(huì)發(fā)生協(xié)同變化，然后導(dǎo)致與環(huán)境條件更為適配的代謝特征[25]。添加BC與施氮水平可改變代謝物之間的串聯(lián)，從而影響葉片C、N代謝，進(jìn)而刺激植物生長(zhǎng)。在N供應(yīng)減少條件下，BC添加影響了葉部組織之間廣泛的網(wǎng)絡(luò)差異，這一結(jié)果部分歸因于C、N之間的平衡，也取決于植物本身對(duì)二者生理狀態(tài)差異的調(diào)整能力[26]。

在高等植物中，天冬酰胺合成酶負(fù)責(zé)氨同化的第一步，谷氨酰胺合成酶則參與后續(xù)氨的固定、儲(chǔ)存與運(yùn)輸[27]。在植物的N再利用階段，AS與GS共同作用于運(yùn)輸含氮分子，催化谷氨酰胺和天冬氨酸形成天冬酰胺，該過(guò)程對(duì)于環(huán)境壓力下的氮循環(huán)至關(guān)重要[28]。在本研究中，觀察到玉米根系中ZmGS1的表達(dá)受BC添加比例的影響較大，尤其在BC3處理中，這意味著添加3%BC條件下ZmGS1基因在改善氨同化和增加N再利用方面發(fā)揮著更為重要的作用。與ZmGS1的表達(dá)不同，ZmAS1在葉片中的表達(dá)受BC添加和N減少的影響較小，這與Sun等對(duì)玉米葉片的研究[16]一致，即AS活性在低氮脅迫下與銨同化循環(huán)相關(guān)的谷氨酰胺合酶和谷氨酰胺酮戊二酸氨基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)錄水平較低[11]。