曠敏，彭偉偉，許立，鄭雨婷，桑子煥，秦思雨，鄒振興*（1.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長(zhǎng)沙 410013；2.慢病診療小分子藥物發(fā)現(xiàn)與轉(zhuǎn)化湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410013）

微生物代謝是發(fā)現(xiàn)天然活性產(chǎn)物的一大重要途徑，目前為止，從微生物天然產(chǎn)物中分離出的具有生物活性的化合物有1 萬(wàn)多種[1-2]。其中，植物根際土壤真菌因其強(qiáng)大的次生代謝能力、潛在的物種多樣性及便于發(fā)酵和遺傳等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為繼植物內(nèi)生真菌之后研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)。植物根際土壤真菌是指生存于植物根系活動(dòng)區(qū)域的真菌，它們同植物根系緊密聯(lián)系，又廣泛參與土壤生態(tài)中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的循環(huán)，其代謝途徑獨(dú)特，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、生物活性顯著的次生代謝產(chǎn)物[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，植物根際土壤真菌目前研究偏重于農(nóng)業(yè)應(yīng)用，其化學(xué)成分研究存在較大的探索空間[4-5]。

木霉屬真菌是普遍存在于土壤中的一種常見(jiàn)植物根際微生物。在自然界中，木霉屬真菌多通過(guò)化學(xué)途徑幫助植物抵抗蟲(chóng)害，具有強(qiáng)大的代謝能力。目前，木霉屬真菌已被發(fā)現(xiàn)數(shù)百種次生代謝產(chǎn)物，主要包括萜類、環(huán)肽類、二酮哌嗪類、生物堿類及聚酮類化合物，且大多具有較好的抗腫瘤、抗菌等藥理活性[6-7]?，F(xiàn)有研究表明，木霉屬真菌能產(chǎn)生眾多結(jié)構(gòu)獨(dú)特的活性分子，具有極大的挖掘價(jià)值。本研究前期從藥用植物根際土壤樣本中分離篩選出一株木霉屬真菌Trichoderma velutinum，化學(xué)豐度篩選顯示其代謝產(chǎn)物豐富，且經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)Trichoderma velutinum的次級(jí)代謝產(chǎn)物成分研究稀少，因此，有必要對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行深入探索。將其進(jìn)行大規(guī)模固體發(fā)酵并用乙酸乙酯冷浸提取發(fā)酵產(chǎn)物，利用各色譜層析手段進(jìn)一步分離純化獲得13 個(gè)化合物，其中包括4 個(gè)細(xì)胞松弛素、6 個(gè)二酮哌嗪、1 個(gè)N-acetyltryptamine 和2 個(gè)腺苷類化合物?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如圖1 所示。

圖1 化合物1 ～13 的結(jié)構(gòu)Fig 1 Structures of compounds 1 ～13

1 材料

Agilent 1290 型高效液相色譜-Agilent 6500 series Q-TOF 質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）；Bruker AV-400/AV-500/AV-600 型核磁共振儀（德國(guó)Bruker 公司）；Autopol IV-T 全自動(dòng)旋光儀（美國(guó)魯?shù)婪蚬荆籜-6 熔點(diǎn)測(cè)定儀（北京泰克儀器有限公司），安捷倫1100 半制備型液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；高壓滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ODS 反相C18填料（日本YMC 公司）；Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠（美國(guó)GE 公司）；柱色譜硅膠（80 ～100 目、200 ～300 目、300 ～400 目，青島海洋化工有限公司）；大孔樹(shù)脂（HPD-100 型大孔吸附樹(shù)脂，滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；Innoval ODS-2半制備色譜柱（10 μm，10 mm×250 mm）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；二甲基亞砜（DMSO）、無(wú)水乙醇、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷試劑均為市售分析純，乙腈為色譜純。萬(wàn)古霉素（批號(hào)：V871983，規(guī)格：250 mg）、硫酸阿米卡星（批號(hào)：A837351，規(guī)格：1 g）（上海麥克林生化科技有限公司）。

本實(shí)驗(yàn)的真菌于2019年7月從湖南省江華縣大玗鎮(zhèn)長(zhǎng)山村海拔520 m 的深綠卷柏根際土壤中分離得到，通過(guò)ITS 序列比對(duì)鑒定為Trichoderma velutinum，目前該菌株保存于中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室?？咕钚詼y(cè)試菌株來(lái)自于中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院，分別為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC29213、糞腸球菌 ATCC29212。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌株發(fā)酵

將菌株從－80℃冰箱的30%甘油水溶液中接種到PDA 培養(yǎng)基上復(fù)蘇，再接種到4 L 滅菌液體培養(yǎng)基中，于28℃恒溫?fù)u床中以150 r·min－1震蕩培養(yǎng)7 d，將此種子液倒入40 L 滅菌大米固體培養(yǎng)基中于室溫下培養(yǎng)28 d。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化

采用乙酸乙酯將固體培養(yǎng)基浸泡提取3 次，減壓濃縮得到浸膏78 g。首先通過(guò)大孔樹(shù)脂層析將粗提物劃分為20%乙醇、80%乙醇、100%乙醇3 個(gè)部位。選取80%餾分（30 g）通過(guò)硅膠柱層析（以石油醚-二氯甲烷-甲醇三相體系梯度洗脫）劃分為5 個(gè)組分（Fr.1 ～Fr.5）。Fr.2 經(jīng)過(guò)ODS 柱層析（以水-甲醇體系梯度洗脫），得到Fr.2.1 ～Fr.2.8，F(xiàn)r.2.3 和Fr.2.4 經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20 柱色譜（以甲醇等度洗脫）得到化合物1（20.1 mg）、2（4.0 mg）、3（3.2 mg）和4（3.1 mg）。Fr.3 經(jīng)過(guò)ODS 柱層析（以水-甲醇體系梯度洗脫），得到Fr.3.1 ～Fr.3.5。Fr.3.2 再通過(guò)小體積硅膠柱梯度洗脫得到Fr.3.2.2，再利用半制備型高效液相色譜（以純水-乙腈為流動(dòng)相）得到化合物5（2.1 mg）和6（3.0 mg）。Fr.3.3 經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20柱色譜[以二氯甲烷-甲醇（1∶9）等度洗脫]得到Fr.3.3.2，經(jīng)過(guò)半制備型高效液相色譜（以純水-乙腈為流動(dòng)相）得到化合物7（2.2 mg）、8（2.0 mg）和13（5.7 mg）。Fr.3.4 經(jīng)過(guò)Sephadex LH-20 柱色譜（以甲醇等度洗脫）得到Fr.3.4.3 和Fr.3.4.4，通過(guò)重結(jié)晶得到化合物9（1.4 mg）和10（1.5 mg）。Fr.4 經(jīng)過(guò)反相硅膠柱層析，得到兩個(gè)白色沉淀為化合物11（6.5 mg）和12（2.4 mg）。

2.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末，易溶于DMSO，＋150°（c0.10，MeOH），HR-ESI-MS 顯示：m/z531.2857 [M ＋H]＋，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR譜推測(cè)該化合物的分子式為C32H38N2O5；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：8.10（1H，s，NH-2），3.32（1H，m，H-3），2.79（1H，s，H-4），3.64（1H，m，H-7），4.50（1H，d，J＝11.4 Hz，OH-7），1.97（1H，m，H-8），2.34（1H，m，H-10α），2.70（1H，m，H-10β），1.51（3H，s，H-11），1.10（3H，s，H-12），6.22（1H，dd，J＝19.8，13.2 Hz，H-13），5.06（1H，m，H-14），2.36（1H，m，H-15α），1.97（1H，m，H-15β），2.70（1H，m，H-16），1.01（3H，d，J＝9.6 Hz，C-16a），6.27（1H，d，J＝14.4 Hz，H-17），1.71（3H，s，C-18a），4.76（1H，m，H-20），4.89（1H，d，J＝9.6 Hz，OH-20），1.76（2H，m，H-21），2.70（1H，m，H-22α），2.93（1H，m，H-22β），10.92（1H，s，NH-1'），7.05（1H，s，H-2'），7.40（1H，d，J＝12.0 Hz，H-4'），6.98（1H，t，J＝11.4，10.8 Hz，H-5'），7.06（1H，t，J＝10.2，8.4 Hz，H-6'），7.34（1H，d，J＝12.6 Hz，H-7'）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：173.9（C-1），57.1（C-3），49.3（C-4），125.5（C-5），133.5（C-6），67.7（C-7），50.9（C-8），61.6（C-9），31.9（C-10），14.7（C-11），16.2（C-12），128.5（C-13），133.4（C-14），40.7（C-15），32.9（C-16），19.8（C-16a），148.3（C-17），135.1（C-18），12.0（CH3-18a），204.1（C-19），70.1（C-20），30.5（C-21），36.5（C-22），210.3（C-23），136.2（C-1'），123.6（C-2'），109.9（C-3'），117.9（C-4'），118.5（C-5'），121.1（C-6'），111.6（C-7'），127.1（C-3'a）。 以上核磁及旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[8]基本一致，故鑒定化合物1 為chaetoglobosin E。

化合物2：白色粉末，易溶于甲醇，＋60°（c0.10，MeOH），HR-ESI-MS 顯 示：m/z531.2864 [M ＋H]＋，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR譜推測(cè)該化合物的分子式為C32H38N2O5；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：3.45（1H，m，H-3），2.58（1H，m，H-4），2.54（1H，m，H-5），3.79（1H，d，J＝10.8 Hz，H-7），1.85（1H，m，H-8），2.56（1H，m，H-10α），2.83（1H，m，H-10β），1.02（3H，d，J＝6.6 Hz，H-11），5.06（1H，s，H-12α），5.24（1H，s，H-12β），6.05（1H，dd，J＝17.4，9.6 Hz，H-13），5.18（1H，m，H-14），2.41（1H，m，H-15α），1.98（H，m，H-15β），2.84（1H，m，H-16），0.91（3H，d，J＝4.8 Hz，H-16a），6.15（1H，d，J＝9.6 Hz，H-17），1.78（3H，s，H-18a），4.63（1H，m，H-20），1.41（1H，m，H-21α），1.58（1H，m，H-21β），2.76（2H，m，H-22），6.99（1H，s，H-2'），7.48（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4'），7.02（1H，t，J＝6.6 Hz，H-5'），7.08（1H，t，J＝6.6 Hz，H-6'），7.33（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7'）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：176.8（C-1），54.2（C-3），48.2（C-4），34.7（C-5），150.2（C-6），71.9（C-7），50.5（C-8），64.3（C-9），32.8（C-10），13.9（C-11），114.4（C-12），129.3（C-13），136.8（C-14），42.2（C-15），33.3（C-16），12.5（C-16a），151.2（C-17），135.8（C-18），20.3（C-18a），205.8（C-19），72.3（C-20），31.6（C-21），38.2（C-22），210.6（C-23），138.0（C-1'），125.6（C-2'），110.4（C-3'），119.4（C-4'），120.3（C-5'），122.6（C-6'），112.7（C-7'），129.3（C-3'a）。以上核磁及旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9]基本一致，故鑒定化合物2 為chaetoglobosin Fex。

化合物3：白色粉末，易溶于甲醇，－15.0° （c0.53，MeOH），HR-ESI-MS 顯示：m/z549.2967 [M＋H]＋，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 譜推測(cè)該化合物的分子式為C32H40N2O6；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：3.81（1H，dd，J＝9.0，4.8 Hz，H-3），2.50（1H，m，H-4），2.03（1H，m，H-5），3.16（1H，d，J＝12.0 Hz，H-7），2.63（1H，dd，J＝12.0，10.2 Hz，H-8），2.80（1H，dd，J＝14.4，4.8 Hz，H-10α），2.97（1H，dd，J＝14.4，4.8 Hz，H-10β），1.03（3H，d，J＝7.2 Hz，H-11），1.22（3H，s，H-12），5.95（1H，dd，J＝16.2，10.2 Hz，H-13），5.12（1H，dt，J＝15.6，10.8，2.4 Hz，H-14），2.41（1H，m，H-15α），1.99（1H，m，H-15β），2.75（1H，m，H-16），1.02（3H，d，J＝7.2 Hz，H-16a），6.19（1H，d，J＝9.6 Hz，H-17），1.77（3H，s，H-18a），4.66（1H，dd，J＝6.6 Hz，4.8 Hz，H-20），1.89（1H，s，OH-20），1.36（1H，m，H-21α），1.60（1H，m，H-21β），1.83（1H，m，H-22α），2.50（1H，m，H-22β），7.03（1H，s，H-2'），7.50（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4'），7.03（1H，t，J＝7.2 Hz，H-5'），7.08（1H，t，J＝7.8 Hz，H-6'），7.33（1H，d，J＝7.2 Hz，H-7'）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：176.9（C-1），54.5（C-3），45.9（C-4），40.2（C-5），74.2（C-6），73.7（C-7），47.4（C-8），65.8（C-9），33.5（C-10），13.6（C-11），24.9（C-12），129.4（C-13），135.1（C-14），42.1（C-15），34.7（C-16），20.3（C-16a），150.1（C-17），136.5（C-18），12.5（C-18a），205.8（C-19），72.6（C-20），31.9（C-21），38.7（C-22），210.1（C-23），138.1（C-1'），125.8（C-2'），110.0（C-3'），119.4（C-4'），120.3（C-5'），122.7（C-6'），112.7（C-7'），129.6（C-3'a）。以上核磁及旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[10]基本一致，故鑒定化合物3 為armochaetoglobin S。

化合物4：白色粉末，易溶于甲醇，＋14.5° （c0.34，MeOH），HR-ESI-MS 顯示：m/z591.3073 [M ＋H]＋，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 譜推測(cè)該化合物的分子式為C34H42N2O7；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：3.78（1H，m，H-3），2.76（1H，m，H-4），1.98（1H，m，H-5），4.74（1H，d，J＝12.0 Hz，H-7），2.91（1H，m，H-8），2.83（1H，dd，J＝14.4，5.4 Hz，H-10α），2.86（1H，dd，J＝14.4，4.8 Hz，H-10β），1.03（3H，d，J＝7.8 Hz，H-11），1.15（3H，s，H-12），5.98（1H，m，H-13），5.16（1H，dt，J＝15.6，10.8，3.0 Hz，H-14），2.34（1H，m，H-15α），1.97（1H，m，H-15β），2.76（1H，m，H-16），1.02（3H，d，J＝7.2 Hz，H-16a），6.21（1H，d，J＝9.0 Hz，H-17），1.77（3H，s，H-18a），4.71（1H，t，J＝5.4 Hz，H-20），1.46（1H，m，H-21α），1.68（1H，m，H-21β），2.64（1H，m，H-22α），2.92（1H，m，H-22β），7.06（1H，s，H-2'），7.51（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4'），7.02（1H，t，J＝7.2 Hz，H-5'），7.09（1H，t，J＝7.2 Hz，H-6'），7.33（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7'），1.98（3H，s，H-2''）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：176.4（C-1），55.3（C-3），44.9（C-4），41.9（C-5），73.9（C-6），75.0（C-7），46.2（C-8），65.2（C-9），33.0（C-10），13.4（C-11），24.9（C-12），128.6（C-13），135.5（C-14），41.9（C-15），34.6（C-16），20.2（C-16a），150.0（C-17），136.4（C-18），12.4（C-18a），205.6（C-19），72.7（C-20），32.3（C-21），38.9（C-22），210.3（C-23），138.1（C-1'），125.5（C-2'），110.5（C-3'），119.4（C-4'），120.2（C-5'），122.3（C-6'），112.6（C-7'），129.2（C-3'a），172.5（C-1''），21.0（C-2''）。 以上核磁及旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[10]基本一致，故鑒定化合物4 為7-O-acetylarmochaetoglobin S。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇，＋77.3° （c0.50，EtOH），HR-ESI-MS 顯示：m/z300.1717 [M ＋H]＋，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 譜推測(cè)該化合物的分子式為C17H21N3O2；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：7.07（1H，s，H-2），7.31（1H，d，J＝10.2 Hz，H-4），6.99（1H，t，J＝8.4 Hz，H-5），7.06（1H，t，J＝8.4 Hz，H-6），7.61（1H，d，J＝9.6 Hz，H-7），3.21（1H，dd，J＝17.4，4.8 Hz，H-8α），3.42（1H，dd，J＝18.0，6.0 Hz，H-8β），4.31（1H，dd，J＝5.4，1.8 Hz，H-9），3.63（1H，dd，J＝5.4，2.4 Hz，H-12），1.22（1H，m，H-15），0.38（1H，m，H-16α），0.55（1H，m，H-16β），0.52（3H，t，J＝7.8 Hz，H-17），0.60（3H，d，J＝8.4 Hz，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：125.9（C-2），109.9（C-3），129.6（C-3a），120.1（C-4），120.2（C-5），122.6（C-6），138.2（C-7），112.6（C-7a），40.1（C-8），57.5（C-9），169.3（C-11），61.1（C-12），170.2（C-14），30.4（C-15），24.5（C-16），11.9（C-17），15.3（C-18）。以上核磁與旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[11]基本一致，故鑒定化合物5 為cyclo-（L-Trp-D-Ile）。

化合物6：白色粉末，易溶于甲醇，－10.6° （c0.14，MeOH），HR-ESI-MS 顯示：m/z300.1716 [M ＋H]＋，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 譜推測(cè)該化合物的分子式為C17H21N3O2；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：7.06（1H，s，H-2），7.31（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4），6.99（1H，t，J＝16.8 Hz，7.2Hz，H-5），7.07（1H，t，J＝16.8，7.2 Hz，H-6），7.59（1H，d，J＝7.8 Hz，H-7），3.11（1H，dd，J＝14.4，4.2 Hz，H-8α），3.48（1H，dd，J＝14.4，3.6 Hz，H-8β），4.27（1H，dd，J＝4.2，3.6 Hz，H-9），3.57（1H，dd，J＝10.2，4.8 Hz，H-12），0.17（1H，ddd，J＝13.8，10.2，4.8 Hz，H-15α），0.66（1H，ddd，J＝13.8，9.6，4.2 Hz，H-15β），1.14（1H，m，H-16），0.46（3H，d，J＝6.6 Hz，H-17），0.60（3H，d，J＝6.6 Hz，H-18）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：126.0（C-2），109.6（C-3），129.4（C-3a），120.2（C-4），120.3（C-5），122.6（C-6），137.9（C-7），112.6（C-7a），45.2（C-8），54.3（C-9），170.0（C-11），57.6（C-12），170.7（C-14），24.7（C-15），30.8（C-16），21.4（C-17），23.4（C-18）。以上核磁與旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[12]基本一致，故鑒定化合物6 為cyclo-（L-Trp-L-Leu）。

化合物7：白色針晶，易溶于DMSO，－249.5°（c1.00，MeOH），mp：281 ℃，HR-ESI-MS顯示：m/z334.1560 [M ＋H]＋， 結(jié)合1H-NMR和13C-NMR 譜推測(cè)該化合物的分子式為C20H19N3O2；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：10.89（1H，s，H-1），6.96（1H，s，H-2），7.48（1H，d，J＝8.4 Hz，H-4），6.98（1H，t，J＝7.8 Hz，H-5），7.08（1H，t，J＝7.2 Hz，H-6），7.32（1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），2.52（1H，dd，J＝14.4，5.4 Hz，H-10α），2.81（1H，dd，J＝14.4，4.2 Hz，H-10β），3.98（1H，m，H-11），7.92（1H，s，H-12），3.89（1H，m，H-14），7.70（1H，s，H-15），2.45（1H，dd，J＝13.2，4.8 Hz，H-17α），1.83（1H，dd，J＝13.2，7.2 Hz，H-17β），7.16（1H，m，H-19），6.70（1H，m，H-20），7.17（1H，m，H-21），6.70（1H，m，H-22），7.16（1H，m，H-23）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：120.9（C-2），108.8（C-3），118.5（C-4），118.8（C-5），124.5（C-6），111.4（C-7），127.6（C-8），136.1（C-9），29.7（C-10），55.3（C-11），166.3（C-13），55.7（C-14），170.0（C-15），166.9（C-16），39.9（C-17），136.5（C-18），128.1（C-19），129.8（C-20），126.5（C-21），129.8（C-22），128.1（C-23）。以上核磁與旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[13]基本一致，故鑒定化合物7 為cyclo-（L-Trp-L-Phe）。

化合物8：白色簇晶，易溶于甲醇，－108° （c0.30，MeOH），mp：242 ℃，HR-ESI-MS 顯示：m/z373.1669 [M ＋H]＋，結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR譜推測(cè)該化合物的分子式為C22H20N4O2；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：4.06（1H，dd，J＝7.2，4.2 Hz，H-2），2.18（1H，dd，J＝14.4，7.2 Hz，H-3α），2.92（1H，dd，J＝14.4，4.2 Hz，H-3β），7.44（1H，d，J＝7.8 Hz，H-4），7.02（1H，t，J＝7.2 Hz，H-5），7.10（1H，t，J＝7.2 Hz，H-6），7.31（1H，d，J＝8.4 Hz，H-7），6.48（1H，s，H-8a）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：57.0（C-2），31.5（C-3），109.5（C-3a），128.7（C-3b），119.8（C-4），120.2（C-5），122.7（C-6），112.6（C-7），138.2（C-7a），126.1（C-8a），169.9（C-9）。以上核磁與旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[14]基本一致，故鑒定化合物8 為cyclo-（L-Trp-L-Trp）。

化合物9：白色針晶，易溶于DMSO，HRESI-MS 顯示：m/z261.1611 [M ＋H]＋， 結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 譜推測(cè)該化合物的分子式為C15H20N2O2；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：8.10（1H，s，NH-1），3.57（1H，m，H-3），7.88（1H，s，NH-4），4.20（1H，m，H-6），1.39（1H，m，H-7），0.59（1H，m，H-8α），0.56（1H，m，H-8β），0.56（3H，m，H-9），0.54（3H，d，J＝7.2 Hz，H-10），2.84（1H，dd，J＝13.8，5.4 Hz，H-11α），3.16（1H，dd，J＝13.8，4.2 Hz，H-11β），7.17 ～7.23（1H，m，H-13），7.17～7.23（1H，m，H-14），7.17～7.23（1H，m，H-15），7.17 ～7.23（1H，m，H-16），7.17 ～7.23（1H，m，H-17）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：166.4（C-2），58.7（C-3），166.3（C-5），55.0（C-6），37.8（C-7），23.1（C-8），11.8（C-9），14.4（C-10），37.6（C-11），136.3（C-12），130.4（C-13），127.9（C-14），126.5（C-15），127.9（C-16），130.4（C-17）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[15]基本一致，故鑒定化合物9 為cyclo-（L-Ile-L-Phe）。

化合物10：白色針晶，易溶于DMSO， －29.8°（c0.10，MeOH），mp：284 ℃，HR-ESI-MS 顯示：m/z261.1605 [M ＋H]＋， 結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 譜推測(cè)該化合物的分子式為C15H20N2O2；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：8.11（1H，s，NH-1），3.46（1H，m，H-3），8.08（1H，s，NH-4），4.17（1H，m，H-6），0.09（1H，m，H-7α），0.73（1H，m，H-7β），1.40（1H，m，H-8），0.62（3H，d，J＝6.6 Hz，H-9），0.59（3H，d，J＝6.6 Hz，H-10），2.84（1H，dd，J＝13.2，4.8 Hz，H-11α），3.13（1H，dd，J＝13.2，3.6 Hz，H-11β），7.12 ～7.28（1H，m，H-13），7.12～7.28（1H，m，H-14），7.12～7.28（1H，m，H-15），7.12 ～7.28（1H，m，H-16），7.12 ～7.28（1H，m，H-17）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：167.6（C-2），55.5（C-3），166.3（C-5），52.3（C-6），43.7（C-7），22.9（C-8），22.8（C-9），21.4（C-10），38.5（C-11），136.3（C-12），130.5（C-13），128.2（C-14），126.8（C-15），128.2（C-16），130.5（C-17）。以上核磁與旋光數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[16]基本一致，故鑒定化合物10 為Cyclo-（L-Leu-L-Phe）。

化合物11：白色粉末，易溶于DMSO，HR-ESIMS 顯示：m/z282.1209 [M ＋H]＋，結(jié)合1H-NMR和13C-NMR 譜推測(cè)該化合物的分子式為C11H15N5O4；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：8.39（1H，s，H-2），8.14（1H，s，H-8），6.00（1H，d，J＝5.4 Hz，H-1'），4.34（1H，m，H-2'），4.36（1H，m，H-3'），3.98（1H，m，H-4'），3.66（1H，dd，J＝12，3.6 Hz，H-5'α），3.57（1H，dd，J＝12，3.6 Hz，H-5'β），3.30（3H，s，O-CH3），7.35（1H，s，NH2-6）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：139.7（C-2），149.0（C-4），119.3（C-5），156.2（C-6），152.6（C-8），82.5（C-1'），85.8（C-2'），68.8（C-3'），86.5（C-4'），61.5（C-5'），57.5（OCH3）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[17]基本一致，故鑒定化合物11 為2'-O-methyladenosine。

化合物12：白色粉末，易溶于DMSO，HRESI-MS 顯示：m/z268.1053 [M ＋H]＋， 結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 譜推測(cè)該化合物的分子式為C10H13N5O4；1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH：8.16（1H，s，H-2），8.37（1H，s，H-8），5.90（1H，d，J＝6.0 Hz，H-1'），4.63（1H，m，H-2'），4.17（1H，m，H-3'），3.99（1H，m，H-4'），3.58（1H，m，H-5'α），3.69（1H，m，H-5'β），7.38（2H，s，NH2-6），5.25（1H，s，OH-5'），5.47（1H，s，OH-2'），5.50（1H，s，OH-3'）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC：152.5（C-2），149.1（C-4），119.5（C-5），156.2（C-6），139.6（C-8），88.0（C-1'），73.6（C-2'），70.8（C-3'），86.1（C-4'），61.8（C-5'）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[18]基本一致，故鑒定化合物12 為β-adenosine。

化合物13：黃色油狀物，易溶于甲醇，HRESI-MS 顯示：m/z203.1188 [M ＋H]＋， 結(jié)合1H-NMR 和13C-NMR 譜推測(cè)該化合物的分子式為C12H14N2O；1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：6.91（1H，s，C-2），7.55（1H，d，J＝7.8 Hz，C-4），7.08（1H，t，J＝7.2 Hz，C-5），6.99（1H，t，J＝7.2 Hz，C-6），7.31（1H，d，J＝7.8 Hz，C-7），3.46（2H，t，J＝7.2 Hz，C-10），2.93（2H，t，J＝6.6 Hz，C-11），1.91（3H，s，C-14）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：122.4（C-2），113.4（C-3），119.4（C-4），119.7（C-5），123.5（C-6），112.4（C-7），138.3（C-8），128.9（C-9），26.3（C-10），41.7（C-11），173.4（C-13），22.7（C-14）。以上核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[19]基本一致，故鑒定化合物13 為N-acetyltryptamine。

2.4 抗菌活性評(píng)價(jià)

采用96 孔板倍比稀釋法，分別制備金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、銅綠假單孢菌（Pseudomonas aeruginosa）和大腸埃希菌（Escherichia coli）的懸浮液并稀釋至1×106CFU·mL－1備用。將13 個(gè)樣品用生物級(jí)DMSO 溶解制備成1024 μg·mL－1的母液，取母液置96 孔板第一孔并用肉湯稀釋至128 μg·mL－1，倍比稀釋后各孔質(zhì)量濃度分別為128、64、32、16、8、4、2、0 μg·mL－1，再于每孔中加入菌液，使每孔最終質(zhì)量濃度為64、32、16、8、4、2、1、0 μg·mL－1， 置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h 并觀察細(xì)菌生長(zhǎng)情況。以鹽酸萬(wàn)古霉素和硫酸阿卡米星為陽(yáng)性對(duì)照，以同等濃度DMSO 作為陰性對(duì)照，目視觀察法讀取MIC值。結(jié)果表明化合物1 ～13 在質(zhì)量濃度 64 μg·mL－1下對(duì)4 個(gè)測(cè)試菌株均未顯示出抑制活性。

3 討論

植物根際土壤真菌作為一類獨(dú)特的微生物資源，參與植物體及周圍生態(tài)的物質(zhì)循環(huán)，植物根際分泌物及根際土壤能夠?yàn)槠涮峁┏渥闾荚春涂衫迷?，同時(shí)根際土壤真菌大多能通過(guò)化學(xué)途徑為植物體提供生物防治作用，因此其具有強(qiáng)大的產(chǎn)活性代謝產(chǎn)物的潛力。再者，植物根際土壤真菌物種多樣，能提供豐富的研究資源，具備極大的研究前景。本研究從植物根際土壤真菌Trichoderma velutinum的代謝產(chǎn)物中分離得到13個(gè)化合物，其中化合物1 ～10 為首次從木霉屬真菌中分離得到。雖然本研究中化合物1 ～13 對(duì)所測(cè)4 株致病菌均未表現(xiàn)出抑制作用，但經(jīng)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)細(xì)胞松弛素類化合物1 ～3 對(duì)人前列腺癌細(xì)胞和小鼠黑色素瘤細(xì)胞具有較好的增殖抑制活性[20-22]；二酮哌嗪化合物9 ～10 具有良好的抗炎活性[23]。本研究豐富了木霉屬真菌化學(xué)成分多樣性，可為土壤真菌資源的開(kāi)發(fā)利用提供參考。