張藝政 王 念 武天舒 謝軍偉 孫 星

（1.滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽 滁州 239000；2.江蘇碧清園食品科技有限公司，江蘇 鹽城 224100）

0 引言

近年來，隨著養(yǎng)殖科技水平的提升以及人們對(duì)水產(chǎn)品需求的增加，淡水養(yǎng)殖業(yè)得到了蓬勃發(fā)展［1-3］。然而，由于多年來人們一直片面追求產(chǎn)量而忽略質(zhì)量，導(dǎo)致淡水養(yǎng)殖水體的水質(zhì)不斷下降，滋生出諸多淡水魚類致病菌，嚴(yán)重影響淡水魚養(yǎng)殖業(yè)的生產(chǎn)效益［4-5］。使用普通抗生素藥物防治淡水魚類致病菌會(huì)出現(xiàn)諸多問題，如致病菌耐藥性增強(qiáng)、藥物殘留污染環(huán)境、水產(chǎn)品品質(zhì)下降等［6］。因此，尋找到一種高效無污染的防治技術(shù)至關(guān)重要。

生物防治技術(shù)以無污染、成本低、作用時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)勢(shì)，逐漸成為魚類病害防治的熱門技術(shù)。其中，海洋來源的微生物因其特殊的生境而具有耐高鹽、耐高壓、寡營(yíng)養(yǎng)等強(qiáng)大的適應(yīng)環(huán)境能力及良好的抑菌作用，被引入諸多生境中用于防治魚類病害［7-9］。筆者從黃海海域采集淺海的海泥與海草等樣品，從中篩選可抑制奇異變形桿菌的菌株，以期為防治淡水魚類致病菌提供更多的理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

海泥與海草，采自江蘇省連云港市黃海海域海岸線淺海地區(qū)；奇異變形桿菌，來自滁州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 培養(yǎng)基

2216E培養(yǎng)基：蛋白胨5.0 g、酵母膏1.0 g、磷酸高鐵0.1 g、瓊脂15.0～20.0 g、蒸餾水1 000 mL，加熱溶解后121 ℃高壓滅菌15 min，待冷卻至50 ℃倒入無菌平皿備用。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化鈉10.0 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH值約為7.0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株的提取與分離。取少許海草與海泥放入試管，倒入10 mL蒸餾水，充分振蕩；用移液槍吸取1 mL渾濁液滴在2216E培養(yǎng)基上，用滅過菌的涂布棒將渾濁液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；將培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落根據(jù)形態(tài)分離純化成單菌落，保存于4 ℃冰箱。

1.3.2 抑菌菌株的篩選。用滅過菌的接種環(huán)分別挑取分離出的單菌株及奇異變形桿菌少許菌絲，接種到LB液體培養(yǎng)基中，在180 r/min、37 ℃的恒溫?fù)u床中過夜培養(yǎng)；用移液槍吸取1 mL奇異變形桿菌的菌液滴到2216E培養(yǎng)基上，用滅過菌的涂布棒均勻涂開，而后在培養(yǎng)皿中放3張已滅過菌、直徑6 mm的濾紙片，分別吸取分離出的單菌株菌液0.5 mL滴到各濾紙片上。將接種好的單菌株篩選培養(yǎng)皿放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察每個(gè)培養(yǎng)基中3個(gè)濾紙片周圍有無抑菌圈，測(cè)量抑菌圈的直徑，取平均值，保留具有明顯抑菌圈、可抑制奇異變形桿菌的菌株。

1.3.3 抑菌菌株的生理生化鑒定。對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察，根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》進(jìn)行革蘭氏染色、淀粉水解、分解纖維素、硫化氫反應(yīng)、過氧化氫反應(yīng)、甲基紅反應(yīng)、乙酰甲基醇反應(yīng)和吲哚反應(yīng)等試驗(yàn)。

1.3.4 16S rDNA鑒定。取少量篩選到具有抑菌作用菌株的菌絲，接種到2216E培養(yǎng)液中37 ℃振蕩過夜培養(yǎng)。根據(jù)DNA提取試劑盒推薦步驟，對(duì)菌株的DNA進(jìn)行提取：移取2 mL菌液到EP管中，8 000 rpm/min離心2 min，取沉淀物。根據(jù)細(xì)菌16S rDNA兩端的保守序列，設(shè)計(jì)細(xì)菌通用引物（滁州通用生物有限公司）為PCR擴(kuò)增，引物序列27F：5＇-TACCTTGTTACGACTT-3＇，1492R：5＇-ATTAGATACCCTDGTAGTCC-3＇。反 應(yīng) 條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延長(zhǎng)1.5 min；30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

擴(kuò)增后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，取5 μL擴(kuò)增樣品在1%瓊脂糖凝膠上、80 V電壓下進(jìn)行電泳檢測(cè)，將條帶清晰、大小正確的目的片段送至通用生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.5 序列分析和數(shù)據(jù)處理。測(cè)序完成后，將所測(cè)細(xì)菌16S rRNA基因序列（大約1 500 bp），與在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫中選取的與這些菌株親緣關(guān)系較近的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)菌16S rDNA基因序列，用BioEdit的多序列比對(duì)排列軟件進(jìn)行序列比對(duì)；用DNASTAR Lasergene軟件建立Neighbour-Joining發(fā)育樹。

2 試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 抑菌菌株的篩選

筆者從海泥與海草中共分離出32株單菌株，利用奇異變形桿菌對(duì)分離出的菌株進(jìn)行抑菌篩選，僅篩選出一株對(duì)奇異變形桿菌生長(zhǎng)具有良好抑制作用的菌株，編號(hào)為YZ1。菌株YZ1單菌落為乳白色，圓形、全緣、半透明、濕潤(rùn)、易挑取，菌落直徑1.0～1.5 mm，抑菌圈直徑為22.3 mm。

2.2 菌株YZ1的生理生化鑒定

生理生化鑒定結(jié)果表示，菌株YZ1為革蘭氏陽性菌，淀粉水解試驗(yàn)呈陽性，分解纖維素試驗(yàn)呈陰性，硫化氫反應(yīng)呈陽性，在過氧化氫試驗(yàn)中出現(xiàn)氣泡，甲基紅試驗(yàn)呈陰性，乙酰甲基醇試驗(yàn)呈陽性，吲哚反應(yīng)呈陰性（見表1）。

表1 菌株YZ1的生理生化鑒定結(jié)果

2.3 菌株YZ1的16S rDNA鑒定

提取菌株YZ1的DNA，通過PCR擴(kuò)增目的片段，將目的片段進(jìn)行測(cè)序，利用DNA Star軟件分析目的片段的DNA序列，序列全長(zhǎng)為1 429 bp（見圖1）。

圖1 目的片段DNA序列圖（1 429 bp）

將目的片段的DNA序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)（見表2），其中近200株芽孢桿菌（Bacillussp.）的DNA序列與目的片段的DNA序列相似性在99%以上。選擇其中9株相似性較高的菌株序列，利用DNASTAR Lasergene軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖3），發(fā)現(xiàn)菌株YZ1與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciensstain）M16.s的親緣關(guān)系最為接近，結(jié)合菌株YZ1的生理生化鑒定結(jié)果及采樣地點(diǎn)，證明菌株YZ1屬于海洋來源的芽孢桿菌，暫將其命名為Bacillussp.YZ1。

表2 菌株YZ1 DNA序列BLAST比對(duì)結(jié)果

圖2 菌株YZ1的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論

因特殊的生境，海洋源微生物具有獨(dú)特適應(yīng)能力、代謝過程及生理功能，進(jìn)而產(chǎn)生不同于陸地微生物的結(jié)構(gòu)，以及新穎、功能獨(dú)特的生物活性物質(zhì)［8］，應(yīng)用前景廣泛。筆者通過對(duì)從海泥與海草中分離出的32株菌株進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，僅發(fā)現(xiàn)一株菌株可抑制奇異變形桿菌生長(zhǎng)，編號(hào)為YZ1。筆者初步觀察菌株YZ1的形態(tài)（乳白色，圓形、全緣、半透明、濕潤(rùn)、易挑取，菌落直徑為1.0～1.5 mm）；并對(duì)菌株YZ1進(jìn)行生理生化鑒定，發(fā)現(xiàn)其為革蘭氏陽性菌，能水解淀粉，產(chǎn)生硫化氫氣體，分解過氧化氫產(chǎn)生氣泡，但不能分解纖維素和葡萄糖；通過16S rDNA鑒定，其與芽孢桿菌屬在同一物種水平上，與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciensstain）的親緣關(guān)系最近，初步認(rèn)定菌株YZ1屬于海洋來源的解淀粉芽孢桿菌。此結(jié)果為淡水魚類病原菌的防治提供了一個(gè)可行途徑，但其防治效果和防治機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。