陳力維，張鴻雁，曾凱芳,

·農(nóng)產(chǎn)品加工工程·

基于桔梅奇酵母凍干粉制備可濕性粉劑及其在柑橘上的應(yīng)用

陳力維1，張鴻雁1，曾凱芳1,2,3※

（1. 西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715；3. 國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

確保生防制劑的貯藏穩(wěn)定性是保證微生物種群數(shù)量和生物防治效果不受影響的關(guān)鍵因素。為開(kāi)發(fā)貨架期較長(zhǎng)且防治效果穩(wěn)定的拮抗酵母生物制劑，該研究通過(guò)助劑的單因素篩選試驗(yàn)和混料試驗(yàn)研制出一種基于桔梅奇酵母凍干粉制備得到可濕性粉劑，經(jīng)過(guò)升溫加速貯藏試驗(yàn)預(yù)測(cè)制劑的貯藏穩(wěn)定性，同時(shí)評(píng)價(jià)了制劑在離體和活體條件下對(duì)柑橘采后主要病害的控制效果。試驗(yàn)結(jié)果表明：試驗(yàn)篩選得到制劑優(yōu)化配方的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為皂角粉5.69%、亞甲基二萘磺酸鈉8.74%、母粉85.57%。凍干制劑中酵母活菌數(shù)可達(dá)到4.72×108CFU/g，貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，凍干制劑的貯藏穩(wěn)定性較好，預(yù)測(cè)在4℃貯藏后制劑中酵母活菌數(shù)約為4.6×108CFU/g。適當(dāng)降低貯藏溫度可延長(zhǎng)凍干制劑貯藏期。離體試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與新鮮酵母相比，液體制劑對(duì)柑橘采后病原菌的抑制作用無(wú)顯著變化，抑菌圈可達(dá)到9 mm以上。在柑橘果實(shí)上能夠有效控制柑橘果實(shí)采后青霉病、綠霉病、酸腐病和炭疽病，可將發(fā)病率降低約40%～70%。綜上，對(duì)桔梅奇酵母進(jìn)行制劑化能夠延長(zhǎng)其貨架期并維持其對(duì)柑橘果實(shí)采后病害防治效果。

農(nóng)產(chǎn)品；采后病害；桔梅奇酵母；凍干制劑；采后；柑橘果實(shí)；生防作用

0 引 言

柑橘果實(shí)采后極易受到病原真菌的侵染而腐爛變質(zhì)，造成大量采后損失[1]。采后病害主要包括由指狀青霉（）引起的綠霉病，意大利青霉（）引起的青霉病，白地霉（）引起的酸腐病等[2]。利用拮抗微生物對(duì)采后病害進(jìn)行生物防治已成為一種前景廣闊的可替代化學(xué)殺菌劑的有效手段。拮抗酵母作為環(huán)境友好型生物防治劑，對(duì)人體相對(duì)安全，已被證明對(duì)采后病害具有一定的生防效力。本課題組篩選分離出的新種酵母—桔梅奇酵母（），前期研究結(jié)果表明可通過(guò)營(yíng)養(yǎng)與空間競(jìng)爭(zhēng)、產(chǎn)生生物被膜、產(chǎn)生栗色色素競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境中的鐵元素等方式抑制柑橘采后病害的發(fā)生。

在生物防治產(chǎn)品開(kāi)發(fā)過(guò)程中最困難的階段是商業(yè)化，該過(guò)程決定了產(chǎn)品的質(zhì)量，如何長(zhǎng)期保持生防制劑中微生物的活力和有效性是開(kāi)發(fā)生物防治產(chǎn)品的一大挑戰(zhàn)[3]。確保生防制劑的貯藏穩(wěn)定性是保證微生物種群數(shù)量和生物防治效果不受影響的關(guān)鍵因素[4]。

固體制劑是指有效成分經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥、流化床干燥、噴霧干燥等方式進(jìn)行干燥后制得的粉末狀固體。在食品領(lǐng)域中，常采用真空冷凍干燥技術(shù)生產(chǎn)微生物固體制劑，包括發(fā)酵劑[5-6]、生防制劑[7]、益生菌劑[8]等?？蓾裥苑蹌┦悄壳拔⑸镛r(nóng)藥的主要?jiǎng)┬椭?，主要成分包括微生物菌體、載體及其他助劑。Cheng等[9]對(duì)蠟樣芽孢桿菌（）可濕性粉劑進(jìn)行篩選后得到最佳配方質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為凍干菌粉60%、硅藻土28.9%、木質(zhì)素磺酸鈉4%、烷基磺酸鈉6%、K2HPO41%、-環(huán)狀糊精1%。張致軍等[10]篩選得到解淀粉芽孢桿菌（）可濕性粉劑的最佳配方為輕質(zhì)碳酸鈣83%、十二烷基硫酸鈉9%、聚乙烯醇8%。載體和助劑的加入除考慮對(duì)制劑理化性質(zhì)的影響外，還需考慮載體和助劑與微生物菌體的生物相容性。劉盼西等[11]在對(duì)比了5種助劑后發(fā)現(xiàn)，十二烷基硫酸鈉和木質(zhì)素磺酸鈉對(duì)海洋芽孢桿菌（）的生物相容性最好，兩者作為助劑加入制劑時(shí)可顯著提高懸浮率，縮短潤(rùn)濕時(shí)間。田媛媛[12]將原藥分別涂布于含有高嶺土、硅藻土和膨潤(rùn)土的固體培養(yǎng)基上以測(cè)定載體與機(jī)器及營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（）的生物相容性發(fā)現(xiàn)，高嶺土與的生物相容性最佳，芽孢存活率為78.25%。姚曉東[13]對(duì)比了白炭黑、蛭石粉、硅藻土等8種載體對(duì)抑菌活性的影響后發(fā)現(xiàn)，白炭黑和蛭石粉對(duì)的抑菌活性最小。目前的微生物農(nóng)藥主要針對(duì)細(xì)菌和霉菌等進(jìn)行研究和開(kāi)發(fā)，并應(yīng)用于采前病害防治，但大部分采后生物防治都是由酵母作為主要有效成分[14]，目前還沒(méi)有將酵母作為有效成分開(kāi)發(fā)為可濕性粉劑并應(yīng)用于果蔬采后貯藏的相關(guān)研究報(bào)道。前期研究表明生防酵母液體劑型能夠成功應(yīng)用于柑橘采后病害防治，但仍存在貯藏時(shí)間較短、受環(huán)境因素影響較大等問(wèn)題，而改變產(chǎn)品的應(yīng)用方式是拮抗微生物發(fā)揮其生防作用的有效途徑。

綜上所述，本文旨在篩選得到桔梅奇酵母凍干制劑的最佳配方，探究?jī)龈芍苿┑馁A藏穩(wěn)定性，并評(píng)價(jià)凍干制劑對(duì)柑橘果實(shí)采后主要病害的控制效果，從而為制備酵母生防制劑提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種與試劑

供試酵母菌：桔梅奇酵母（）由本實(shí)驗(yàn)室篩選和保存的桔梅奇酵母FL01株系，并保藏于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，保藏號(hào)為CICC NO.33213。

病原菌：青霉菌、綠霉菌、白地霉為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。上述病原菌分別在PDA培養(yǎng)基上、4℃條件下保藏，每?jī)蓚€(gè)月活化一次。

試驗(yàn)用果實(shí)為商業(yè)成熟期的錦橙果實(shí)447#[(L.) osbeck. cv. Jincheng 447#]，采摘自從重慶市北碚區(qū)雞公山果園（106.45°E，29.81°N）。采摘后的果實(shí)立即運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室，從中挑選表面無(wú)機(jī)械傷，無(wú)病害，大小形狀較為均勻的果實(shí)作為試驗(yàn)材料。

酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，YPD）配方：酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，瓊脂粉10 g，蒸餾水1 L。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（Potato Dextrose Medium，PDA）配方：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，1 L蒸餾水，121℃滅菌15 min。

谷氨酸鈉、脫脂奶粉（均為分析純），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；海藻糖、乳糖、十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉（均為分析純），購(gòu)自成都市科龍化工試劑廠；抗壞血酸鈉、硅藻土、羧甲基纖維素鈉、多聚磷酸鈉、聚乙二醇（均為分析純），購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；白炭黑、高嶺土（均為分析純），購(gòu)自西亞化學(xué)科技（山東）有限公司；皂角粉（工業(yè)級(jí)），購(gòu)自新沂市飛皇化工有限公司；木質(zhì)素磺酸鈉、亞甲基二萘磺酸鈉（均為分析純），購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BPC-500F生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器公司；SW-CJ-2F(D)超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰有限公司； Avanti J-30I高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Beckman公司；BXM-30R立式高壓滅菌鍋，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；SPH-200F恒溫震蕩培養(yǎng)搖床，上海世平試驗(yàn)設(shè)備有限公司；BX43光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司；VORTEX-5旋渦混勻儀，海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；Scan1200全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀，法國(guó)INTERSCIENCE公司；LGJ-10真空冷凍干燥機(jī)，北京松原華興科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 凍干保護(hù)劑篩選

參考Niu等[15]的方法，將保護(hù)劑懸浮液與酵母菌懸液（2×109CFU/mL）等體積混合后，在渦旋混合儀上震蕩混勻1 min，室溫下孵化1 h，在?20 ℃條件下預(yù)冷12 h，之后在冷阱溫度為?50 ℃、真空度為1～10 Pa條件下凍干。3種凍干保護(hù)劑配方如下：

A：蔗糖6.06%、谷氨酸鈉3.4%和脫脂奶粉5.43%[15]；

B：脫脂奶粉10%、抗壞血酸1%和海藻糖10%[16]；

C：脫脂奶粉28%、乳糖24%和抗壞血酸鈉4.8%[17]。

凍干前，將稀釋至適宜濃度的酵母懸浮液涂布在YPD平板上，測(cè)定初始活菌數(shù)0。凍干后，經(jīng)無(wú)菌水溶解，稀釋至適宜濃度，涂布在YPD平板上，將上述平板置于28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，計(jì)算凍干后的活菌數(shù)N。試驗(yàn)重復(fù)3次，通過(guò)以下公式計(jì)算存活率。

1.3.2 凍干母粉的制備

保護(hù)劑懸浮液與酵母菌懸液等體積混勻后得到酵母凍干母液，根據(jù)載體的吸附量，將母液與載體混合均勻得到樣品，混合過(guò)程不斷攪拌。在?20 ℃條件下預(yù)冷12 h后進(jìn)行凍干。凍干后經(jīng)研磨粉碎制得均勻的酵母凍干母粉。

1.3.3凍干制劑物理性狀的測(cè)定

潤(rùn)濕時(shí)間參照農(nóng)藥可濕性粉劑潤(rùn)濕性測(cè)定方法GB 5451-2001[18]；懸浮率參照農(nóng)藥懸浮率的測(cè)定方法GB/T 14825-2006[19]。載體的吸附容量參照江帆的方法[20]。試驗(yàn)以不加助劑的凍干粉為空白對(duì)照，下同。

1.3.4 載體篩選

選擇白炭黑、高嶺土和硅藻土作為備選載體，比較不同載體的吸附容量、潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率及對(duì)酵母活菌量的影響，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.5與助劑生物相容性的測(cè)定

各備選助劑按0.2%的加入量添加至YPD固體培養(yǎng)基中，將菌懸液稀釋至適宜濃度后均勻涂布在YPD平板上，測(cè)定活菌數(shù)，不加助劑的YPD平板作為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 助劑篩選

潤(rùn)濕劑包括十二烷基硫酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉和皂角粉，分散劑包括羧甲基纖維素鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、亞甲基二萘磺酸鈉、聚乙二醇PEG6000和多聚磷酸鈉。按5%的添加比例分別將潤(rùn)濕劑和分散劑與凍干母粉充分混勻，測(cè)定制劑的潤(rùn)濕時(shí)間和懸浮率。

1.3.7 凍干制劑配方優(yōu)化

將助劑分別按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%、10%和15%的比例與原粉混合，測(cè)定潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率和活菌量。助劑單因素試驗(yàn)后，采用極端頂點(diǎn)設(shè)計(jì)法進(jìn)行混料設(shè)計(jì)優(yōu)化，設(shè)定酵母母粉、潤(rùn)濕劑和分散劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)和為1，其中制劑各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)上限根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定。分別測(cè)定不同配方條件下制劑的潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率及活菌量等理化指標(biāo)。通過(guò)Minitab 18軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得到酵母凍干制劑的最佳配方。其試驗(yàn)次數(shù)及對(duì)應(yīng)比例如圖1所示。

注：圖中數(shù)字為各助劑含量占制劑總量的比例。

1.3.8 凍干制劑加速貯藏穩(wěn)定性試驗(yàn)

參照Guo等[21]的方法，并稍作修改。分別將凍干制劑進(jìn)行熱塑密封包裝后置于25、30、35、40 ℃恒溫箱中，定期取樣測(cè)定在不同溫度下制劑活菌量。根據(jù)以下公式估算制劑在4 ℃條件下貯藏后的活菌量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程：

阿侖尼烏斯方程：

1.3.9 凍干制劑對(duì)柑橘果實(shí)采后主要病害的控制效果

參照Parafati等[22]的方法，略有修改。取10L 1×108cells/mL新鮮酵母菌懸液、1×108CFU/mL凍干制劑稀釋液，均勻涂布在PDA平板的中軸線上，涂布范圍為60 mm×2.6 mm，靜置10 min后，在距中軸線30 mm處接種5L 5×105spores/mL，孢子懸浮液或生長(zhǎng)5 d的的菌餅（直徑為5 mm，取自菌落邊緣處），以只接種病原菌的平板作為對(duì)照，25 ℃培養(yǎng)8 d后記錄病原菌菌絲生長(zhǎng)情況，以及色素圈大小。每個(gè)處理包含5個(gè)平板，重復(fù)3次。

參考Wang等[23]的方法，略有修改。用滅菌打孔器在果實(shí)赤道部位等距打兩個(gè)孔（3 mm直徑、3 mm深）。每個(gè)孔接種20L如下處理液：無(wú)菌水（Control）；新鮮酵母（FY）；固體制劑最優(yōu)保護(hù)劑配方（P）；凍干制劑稀釋液（DY）。4 h后，再在每個(gè)孔接種10L、1×105spores/mL的或，或10L、1×106spores/mL的。待菌液吸收后，用聚乙烯薄膜袋（170 mm×140 mm）單果包裝，貯藏在25 ℃、相對(duì)濕度85%～90%的環(huán)境下，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率和病斑直徑。每組10個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上指標(biāo)均取3個(gè)平行樣品，重復(fù)測(cè)定3次。運(yùn)用EXCEL2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)分析采用SPSS（SPSS Inc., Chicago, IL, USA）軟件，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示。方差分析采用ANOVA分析，利用Duncan’s多重比較進(jìn)行顯著性分析。圖表繪制采用Origin 9.0（OriginLab, Northampton, MA, USA）軟件?；炝显囼?yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用應(yīng)用Minitab 18.1（Inc., Pennsylvania, USA）軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)劑的單因素篩選試驗(yàn)

圖2可知，添加保護(hù)劑的酵母凍干制劑與對(duì)照存活率（9.63%±0.60%）相比，其酵母存活率均有顯著提高（<0.05），說(shuō)明添加保護(hù)劑可有效降低凍干過(guò)程對(duì)菌體的損傷。其中保護(hù)劑A對(duì)酵母的保護(hù)效果最好，存活率可達(dá)82.05%±6.09%，其次分別是保護(hù)劑C（73.14%±4.10%）和保護(hù)劑B（59.08%±5.31%）。因此，選擇保護(hù)劑A（蔗糖6.06%、谷氨酸鈉3.4%和脫脂奶粉5.43%）作為酵母凍干保護(hù)劑進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

注：A為脫脂奶粉5.43%、蔗糖6.06%和谷氨酸鈉3.4%；B為脫脂奶粉10%、抗環(huán)血酸1%和海藻糖10%；C為脫脂奶粉28%、乳糖24%和抗壞血酸鈉4.8%。不同小寫(xiě)字母代表不同處理間差異顯著（P＜0.05），下同。

2.2 載體對(duì)M. citriensis凍干制劑理化性質(zhì)的影響

表1所示，載體的潤(rùn)濕性和分散性之間具有顯著差異，白炭黑的潤(rùn)濕時(shí)間遠(yuǎn)高于高嶺土和硅藻土。載體吸附容量大小決定了制劑中酵母初始活菌量的多少，載體的吸附容量由大到小分別為白炭黑、硅藻土、高嶺土，其中白炭黑吸附容量是硅藻土吸附容量的約兩倍左右。但比較凍干后制劑中酵母活菌量發(fā)現(xiàn)，白炭黑和硅藻土制劑中活菌量無(wú)顯著差異。因此可選擇硅藻土作為酵母制劑中的載體進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表1 載體種類(lèi)對(duì)桔梅奇酵母凍干制劑理化性質(zhì)的影響

注：表中同一列有相同字母表示試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著（>0.05）。下同。

Note: The same letter in the same column indicates that the difference of results is not significant (>0.05). The same below.

2.3 潤(rùn)濕劑對(duì)M.citriensis凍干制劑理化性質(zhì)的影響

表2所示，潤(rùn)濕時(shí)間越短，制劑的潤(rùn)濕性越好。十二烷基苯磺酸鈉的潤(rùn)濕時(shí)間最短，皂角粉與十二烷基硫酸鈉無(wú)顯著差異?；罹孔罡叩氖窃斫欠?，其次是十二烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉，且皂角粉加入后高于其余兩者一個(gè)數(shù)量級(jí)。懸浮率最高的是十二烷基苯磺酸鈉，其次是十二烷基硫酸鈉，皂角粉的懸浮率最低。因此可選擇皂角粉作為潤(rùn)濕劑進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

表2 潤(rùn)濕劑對(duì)桔梅奇酵母凍干制劑理化性質(zhì)的影響

2.4 分散劑對(duì)M.citriensis凍干制劑理化性質(zhì)的影響

懸浮率越高，制劑的懸浮性和分散性越好。表3所示，與母粉相比，分散劑加入后均可以不同程度提高菌粉的懸浮率。在備選的分散劑中懸浮性和分散性最好的依次是亞甲基二萘磺酸鈉、聚乙二醇、木質(zhì)素磺酸鈉、羧甲基纖維素鈉、多聚磷酸鈉。因此可選擇亞甲基二萘磺酸鈉作為分散劑進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 助劑添加量對(duì)M.citriensis固體制劑理化性質(zhì)的影響

如表4所示為皂角粉和亞甲基二萘磺酸鈉添加濃度的單因素試驗(yàn)篩選結(jié)果，隨著皂角粉添加量的增加，制劑懸浮率呈逐漸增加的趨勢(shì)，同時(shí)皂角粉濃度過(guò)高，可能會(huì)影響制劑中活菌量。亞甲基二萘磺酸鈉的加入，可以顯著改善制劑的懸浮效果，同時(shí)也能夠降低制劑的潤(rùn)濕時(shí)間，改善潤(rùn)濕性。較高濃度的亞甲基二萘磺酸鈉加入后，不僅會(huì)降低母粉添加比例，造成制劑中酵母活菌量較低（2.12×108CFU/g），因此選擇適宜濃度的助劑添加量仍需進(jìn)一步確定。

表3 分散劑對(duì)桔梅奇酵母凍干制劑理化性質(zhì)的影響

表4 潤(rùn)濕劑和分散劑的添加量對(duì)桔梅奇酵母凍干制劑理化性質(zhì)的影響

2.6 混料設(shè)計(jì)優(yōu)化M. citriensis固體制劑配方

混料設(shè)計(jì)具體方案及理化性質(zhì)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5所示。

表5 極端頂點(diǎn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

模型回歸方程的建立如表6所示，3個(gè)模型回歸均表示顯著（<0.05），且失擬項(xiàng)不顯著（>0.05）。設(shè)定制劑的潤(rùn)濕時(shí)間、懸浮率和活菌量的期望值范圍分別為7～10 s、70%～75%和4.5×108～5×108CFU/g進(jìn)行多指標(biāo)優(yōu)化，得到如圖3所示區(qū)域，在圖中白色域內(nèi)選擇最佳配方為皂角粉為5.69%、亞甲基二萘磺酸鈉為8.74%、母粉為85.57%?；诖伺浞剑炝虾笏弥苿┑膶?shí)測(cè)值與各項(xiàng)指標(biāo)的預(yù)測(cè)值比較接近（如表7所示），表明在該優(yōu)化區(qū)域中所得的制劑配方是可行的，可以將其作為可濕性粉劑的配方。

表6 各指標(biāo)的預(yù)測(cè)模型

注：1、2、3分別代表配方中皂角粉、亞甲基二萘磺酸鈉和母粉在制劑中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

Note:1,2,3represent the mass fraction of honeylocust powder, NNO and Freeze-dried powder in the formulation, respectively.

圖3 桔梅奇酵母凍干制劑多指標(biāo)配方優(yōu)化區(qū)域

表7 優(yōu)化制劑配方的試驗(yàn)驗(yàn)證

2.7 M. citriensis凍干制劑的貯藏穩(wěn)定性

凍干制劑在不同溫度下的失活速率方程如表8所示，隨著貯藏時(shí)間的增加，lg(N/0)不斷下降，說(shuō)明酵母的存活率在貯藏期間不斷下降。通過(guò)各擬合方程的斜率可以確定在不同溫度下酵母的失活速率，即25為0.014 4（2=0.995 7），30為0.056 3（2=0.995 8），35為0.191 2（2=0.992 2），40為0.332 5（R=0.995 9），溫度的升高失活速率越快。

表8 不同溫度下的失活速率方程

注：表示貯藏時(shí)間，d；表示貯藏后活菌數(shù)與初始活菌數(shù)比值的對(duì)數(shù)值。

Note:represent the storage time, d;represent logarithmic value of the ratio of storage viable count to initial viable count.

阿倫尼烏斯方程的擬合結(jié)果如圖4所示，由擬合方程=?8 623.4+27.150（2=0.960 5）可通過(guò)計(jì)算得到，在4 ℃貯藏條件下，凍干制劑的失活速率常數(shù)為1.044×10-4d-1，該溫度下貯藏1年后制劑中酵母活菌數(shù)約為4.6×108CFU/g。由此說(shuō)明，在低溫下保存凍干制劑更有利于酵母存活，能夠延長(zhǎng)制劑的貨架期。

注：T為熱力學(xué)溫度，K；k為失活速率常數(shù)，d-1。

2.8 M. citriensis凍干制劑對(duì)柑橘果實(shí)采后主要病原菌體外抑菌試驗(yàn)

如圖5a所示，凍干制劑與新鮮酵母對(duì)病原菌的菌絲生長(zhǎng)均存在不同程度的抑制效果，能夠產(chǎn)生較明顯的抑菌圈，且抑菌圈大小大于9 mm，三種病原菌的菌絲均不能越過(guò)酵母細(xì)胞生長(zhǎng)，其中，酵母對(duì)產(chǎn)生的抑菌圈最大，其次分別是和。新鮮酵母與凍干制劑相比，對(duì)三種病原菌產(chǎn)生的抑菌圈大小均無(wú)顯著性差異，說(shuō)明在凍干制劑中酵母仍能夠保持較高的活性。當(dāng)酵母分別與三種病原菌共培養(yǎng)時(shí)，酵母均可產(chǎn)生紅色色素帶，即酵母仍可產(chǎn)生普切明酸與培養(yǎng)基中的鐵離子進(jìn)行結(jié)合產(chǎn)生紅色色素，其寬度如圖5b所示，其中，新鮮酵母與病原菌共培養(yǎng)時(shí)，與同時(shí)存在的色素圈最大，為18.33mm，其次分別是（17.25 mm）和（15.93 mm），其中，與共培養(yǎng)時(shí)凍干制劑產(chǎn)生的色素圈顯著低于新鮮酵母（<0.05）。由此說(shuō)明酵母經(jīng)凍干、復(fù)配等過(guò)程后活力大多無(wú)顯著改變，均可保持對(duì)病原菌的生防效力。

注：圖中相同字母表示試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著（P>0.05）。FY為新鮮酵母；DY為凍干制劑，下同。

2.9 M.citriensis凍干制劑對(duì)柑橘果實(shí)采后主要病害的控病效果

如圖6所示，在貯藏過(guò)程中，新鮮酵母對(duì)柑橘果實(shí)采后綠霉病、青霉病和酸腐病均有顯著控制效果，可有效降低果實(shí)發(fā)病率（如圖6a、6c和6e）和病斑直徑（如圖6b、6d和6f），與接種無(wú)菌水相比，均有顯著性差異（<0.05）。接種酵母凍干制劑的處理組與新鮮酵母的處理組相比，三種病害的發(fā)病率和病斑直徑在貯藏初期均無(wú)顯著性差異，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，酵母凍干制劑處理后柑橘果實(shí)綠霉病和青霉病的顯著高于新鮮酵母處理組（<0.05）（如圖6a和6c），而酸腐病的發(fā)病率顯著低于新鮮酵母處理組（<0.05）（如圖6e）。由此說(shuō)明，新鮮酵母和酵母凍干制劑對(duì)柑橘果實(shí)采后主要病害均有顯著控制效果，與對(duì)照組相比，在貯藏6 d后，可有效降低果實(shí)綠霉病和青霉病發(fā)病率40%左右，降低果實(shí)酸腐病發(fā)病率70%左右。與新鮮酵母相比，酵母凍干制劑可提高對(duì)酸腐病的控制。

注：Control為無(wú)菌水；P為助劑及保護(hù)劑配方。

3 討 論

獲得最大的存活率對(duì)工業(yè)生產(chǎn)的微生物活菌制劑來(lái)說(shuō)是關(guān)鍵因素。微生物菌體的真空冷凍干燥是在低溫低壓條件下利用水分子的升華性能，使菌體低溫脫水實(shí)現(xiàn)干燥的一種方式。在凍干過(guò)程中菌體喪失活力的主要原因是滲透壓改變和細(xì)胞膜損傷。而凍干保護(hù)劑的加入會(huì)影響冷凍干燥后菌體的活性。因此，筆者考察了3種不同保護(hù)劑配方對(duì)凍干后酵母存活率的影響，其中添加保護(hù)劑A可使凍干存活率達(dá)到82.05%±6.09%，顯著高于其他兩種配方（<0.05），Niu等[15]使用該配方對(duì)進(jìn)行冷凍干燥后，酵母存活率為76.90%，說(shuō)明在凍干過(guò)程中，該保護(hù)劑配方能夠有效降低干燥過(guò)程對(duì)微生物菌體的傷害。

為增加凍干制劑的流動(dòng)性、分散性，常加入載體、潤(rùn)濕劑和分散劑等成分[24]。載體在制劑中所占比例較大，因此其潤(rùn)濕性和分散性對(duì)制劑的理化性質(zhì)有較大影響[25]。李慧等[26]關(guān)于制備熒光假單胞菌（）可濕性粉劑的研究表明硅藻土與滑石粉復(fù)配聯(lián)用后載體的吸附作用和菌體釋放率均較高。在本研究中，硅藻土作為載體時(shí)制劑的懸浮率最高、潤(rùn)濕時(shí)間最短且活菌數(shù)最高。生防制劑在果蔬表面有效定殖和保持較高的種群數(shù)量被認(rèn)為是控制采后病害的重要因素[27]。表面活性劑可以通過(guò)降低表面張力來(lái)改善液體介質(zhì)在表面的潤(rùn)濕性質(zhì)，不僅能夠改善制劑的理化性能，還有助于微生物在果蔬表面分散定殖[28]。在本研究中，選擇皂角粉和亞甲基二萘磺酸鈉作為凍干制劑的潤(rùn)濕劑和分散劑。

微生物經(jīng)冷凍干燥后不會(huì)完全變成惰性狀態(tài)，其呼吸作用也不會(huì)完全停止[29]，而在低溫條件下，可維持低水平的代謝活動(dòng)，防止有毒代謝物在載體中積累，此外，低溫可有效減少水分過(guò)度流失，有利于微生物的長(zhǎng)期儲(chǔ)藏[30]。而Xue等[31]的研究發(fā)現(xiàn)過(guò)低的貯藏溫度同樣不利于菌體的存活，蠕蟲(chóng)埃斯特菌（）凍干粉在?20 ℃條件下貯藏1個(gè)月后其菌體幾乎全部失活，而在4 ℃下其生存力仍保持良好。唐飛[32]將海洋酵母（）凍干制劑儲(chǔ)藏3個(gè)月發(fā)現(xiàn)4 ℃條件下更適合凍干粉的貯藏，其活菌數(shù)比25 ℃條件下貯藏時(shí)高4個(gè)數(shù)量級(jí)。在加速貯藏試驗(yàn)中，降低溫度可使菌體失活速率常數(shù)減?。▓D4），因此適當(dāng)降低溫度可以延長(zhǎng)制劑貨架期。

有研究表明，菌株在凍干后無(wú)法完全保持生防活性，為此，我們比較了新鮮酵母與凍干制劑對(duì)柑橘果實(shí)主要病害的防治效果。如圖6所示，在離體條件下新鮮酵母和凍干制劑對(duì)病原菌的拮抗作用無(wú)顯著性差異，凍干過(guò)程并沒(méi)有對(duì)酵母的生防作用造成不良影響，這與Niu等[15]的研究結(jié)果一致。圖7所示，凍干制劑對(duì)柑橘果實(shí)采后主要病害具有較好的控制效果，病斑直徑與對(duì)照組相比顯著減小，表明在接種酵母后，一定程度上抑制了病原菌的生長(zhǎng)，進(jìn)一步證實(shí)桔梅奇酵母通過(guò)營(yíng)養(yǎng)和空間的競(jìng)爭(zhēng)來(lái)達(dá)到控制病害的作用，且在貯藏前期與新鮮酵母相比生防作用無(wú)顯著性差異。這與本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果一致[33-34]。

圖7 桔梅奇酵母同孔接種處理柑橘采后綠霉病、青霉病和酸腐病的發(fā)病癥狀

4 結(jié) 論

本研究將酵母作為可濕性粉劑的有效成分進(jìn)行研究開(kāi)發(fā)，研制出一種以為主要活性成分的凍干制劑，通過(guò)助劑的單因素篩選試驗(yàn)和混料試驗(yàn)，得到其配方為：皂角粉5.69%、亞甲基二萘磺酸鈉8.74%、母粉85.57%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。在該配方條件下凍干制劑中酵母活菌數(shù)可達(dá)到4.72×108CFU/g。

將上述凍干制劑最優(yōu)配方進(jìn)行密封真空包裝后，分別在25、30、35和40 ℃條件下進(jìn)行加速試驗(yàn)預(yù)測(cè)凍干制劑的貯藏穩(wěn)定性。通過(guò)擬合方程計(jì)算得到，在4 ℃貯藏條件下，凍干制劑的失活速率常數(shù)為1.044×10-4d-1。說(shuō)明制劑配方的優(yōu)化可大大提高其貯藏穩(wěn)定性。與新鮮酵母相比，凍干制劑在離體條件下和柑橘果實(shí)上均可有效控制其采后病害的發(fā)生。與對(duì)照組相比，在貯藏6 d后，可有效降低果實(shí)綠霉病和青霉病發(fā)病率40%左右，降低果實(shí)酸腐病發(fā)病率70%左右。

本試驗(yàn)結(jié)果可為后期將拮抗酵母進(jìn)行商業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)。如果期望菌株在凍干后完全保持生防活性，可以進(jìn)一步加入相關(guān)助劑以提高制劑的生防效果，但需考察助劑與酵母活性的兼容性。

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Preparation of wettable powder and its application on citrus fruits based onfreeze-dried powder

Chen Liwei1, Zhang Hongyan1, Zeng Kaifang1,2,3※

(1.,400715,;2.,,400715,;400712)

Microbial preparation refers to the living microorganism as the main component, including inert carrier materials, nutrients, and other accessory ingredients. It is necessary to maintain the vitality and effectiveness of microorganisms in the biocontrol preparations for a long time, particularly in the development of biocontrol products. The storage stability of biocontrol agents can be a key factor to ensure the number of microorganisms and the biological control.can be expected to efficiently control the postharvest green mold and sour rot caused byandon the citrus fruit, indicating its great application and development value. This study aims to develop antagonistic yeast biocontrol agents with a long shelf life and stable biocontrol effect. The wettable powder was also prepared with theas the main active ingredient. The single factor and mixing tests were carried out to optimize the accessory ingredient for the wettable powder. Then, the wettable powder was applied to the citrus fruits. An accelerated storage test was conducted to predict the storage stability of the preparation, and evaluate the control effect of the preparation on the main postharvest diseases of citrus under in vitro and in vivo conditions. The results showed that the carriers, wetting powder, and suspending agent were screened by the single factor test with the mixing test. An optimal combination of the preparation was achieved with the honeylocust powder of 5.69%, dispersing agent NNO of 8.74%, and freeze-dried powder of 85.57%. The number of viable yeast in the freeze-dried preparation reached 4.72×108CFU/g, and the wetting time was (7.82±1.02) s, while the suspensibility was up to 71.56%±0.06%. The accelerated storage test demonstrated that better storage performance was achieved in the freeze-dried bioformulation. Among them, the wettable powder was stored at four temperatures. The deactivation rate constant of yeast gradually increased in the wettable powder, whereas, the death rate of yeast accelerated with the increase in storage temperature. The viable yeast population in the preparation was estimated to be 4.6×108CFU/g, when the storage at 4℃ for one year. Therefore, there was an appropriate reduction of storage temperature for better storage ability. In vitro tests and fruit tests were carried out to learn the application effect of the preparation. The experiments showed that the wettable powder effectively controlled the occurrence of postharvest citrus fruit diseases. It was found that there was no significant change in the inhibitory effect of wettable powder on the postharvest pathogen and pigment production capacity of, compared with fresh yeast. Specifically, the inhibition zone reached more than 9 mm. Fresh yeast presented a remarkable control effect on the blue and green mold, and sour rot on the citrus fruits. The formulation reduced the incidence of three citrus postharvest diseases by 40%-70%. To sum up, the preparation treatment ofcan be expected to effectively retain cell viability and biocontrol efficacy. The wettable powder with theas the main active ingredient indicated a significant decrease in the incidence of postharvest disease on the citrus fruits. The finding can provide the theoretical and practical basis for the application ofin the biological control of postharvest citrus diseases.

agricultural products; postharvest disease;; freeze-dried preparation; postharvest; citrus fruits; biological control

10.11975/j.issn.1002-6819.2022.15.033

TS255.3

A

1002-6819(2022)-15-0305-09

陳力維，張鴻雁，曾凱芳. 基于桔梅奇酵母凍干粉制備可濕性粉劑及其在柑橘上的應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2022，38(15)：305-313.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.15.033 http://www.tcsae.org

Chen Liwei, Zhang Hongyan, Zeng Kaifang. Preparation of wettable powder and its application on citrus fruits based onfreeze-dried powder[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2022, 38(15): 305-313. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2022.15.033 http://www.tcsae.org

2022-04-07

2022-07-11

重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（cstc2021jscx-cylhX0015）；四川省科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2021YFQ0071）

陳力維，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏。Email：chenliwei013211@163.com

曾凱芳，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楣哔A藏與物流保鮮。Email：zengkaifang@163.com