張 鑫, 王軍燕, 魏玉婷, 劉鴻鑫, 朱田田, 嚴(yán)興科

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 針灸推拿學(xué)院, 甘肅 蘭州, 730000)

阿爾茨海默病(AD)是老年階段最常見的癡呆類型，以進(jìn)行性認(rèn)知功能減退為主要特征[1]。隨著人口老齡化的日趨嚴(yán)重, AD的發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)。作為全球難治性疾病, AD無法完全根治，當(dāng)前治療方法僅能緩解相關(guān)癥狀[2]。關(guān)于AD的確切病因及發(fā)病機(jī)制至今仍不明確，主要有β-淀粉樣蛋白(Aβ)級(jí)聯(lián)假說、tau蛋白磷酸化假說、膽堿能神經(jīng)元假說、氧化應(yīng)激假說、自由基損傷假說等[3]。研究[4-5]發(fā)現(xiàn), tau蛋白磷酸化與AD患者的癡呆程度相關(guān)性更高。tau蛋白磷酸化假說認(rèn)為, AD發(fā)病是由過度磷酸化tau蛋白(p-tau)聚集形成神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFTs)而造成神經(jīng)細(xì)胞大量損傷引起。因此tau蛋白被很多學(xué)者認(rèn)為是治療AD的潛在有效靶點(diǎn)[6]，而臨床前模擬以tau蛋白磷酸化為特征的 AD動(dòng)物模型至關(guān)重要。

目前，已建立的tau蛋白動(dòng)物模型有rTg4510、JNPL3、pR5等轉(zhuǎn)基因鼠模型[7-8]。但轉(zhuǎn)基因鼠價(jià)格較高，且存在基因突變可能，易導(dǎo)致模型鼠出現(xiàn)視覺、嗅覺或肌肉等缺陷，會(huì)對(duì)行為分析產(chǎn)生影響[9]。岡田酸(OA)是一種強(qiáng)聚醚海洋毒素，可以通過抑制抑制蛋白磷酸酯酶-1(PP1)、蛋白磷酸酯酶-2A(PP2A)活性達(dá)到調(diào)控tau蛋白磷酸化水平的目的[10]。根據(jù)該特性以及利用OA造模操作簡(jiǎn)單、成本低、造模周期較短等特點(diǎn), OA被廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)外tau蛋白磷酸化改變?yōu)樘卣鞯腁D模型制作中，但文獻(xiàn)報(bào)道中OA的具體應(yīng)用方法尚不統(tǒng)一。本文對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇、OA制備、注射部位、注射劑量、模型評(píng)價(jià)以及病理學(xué)機(jī)制進(jìn)行綜述，以期為該種模型應(yīng)用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇

文獻(xiàn)[11]報(bào)道，腦內(nèi)注射OA的動(dòng)物模型多為嚙齒類動(dòng)物，包括C57BL/6 J小鼠、ICR小鼠、昆明種小鼠以及SD、Wistar大鼠等。與小鼠比較, SD、Wistar大鼠具有行為、情緒變化特征，行為表現(xiàn)多樣，情緒敏感，能進(jìn)行高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)研究，且SD大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)與人類相似，更適用于獎(jiǎng)勵(lì)和懲罰實(shí)驗(yàn)、迷宮實(shí)驗(yàn)等方面的研究[12-13]。研究[14]表明，雌激素對(duì)AD有神經(jīng)保護(hù)作用，為降低實(shí)驗(yàn)誤差，實(shí)驗(yàn)鼠性別以雄性多見。鼠的體質(zhì)量不同，其大腦區(qū)域的立體定向坐標(biāo)也會(huì)不同，當(dāng)前各個(gè)研究中大鼠腦立體定位坐標(biāo)參考包新民等[15]的《大鼠腦立體定位圖譜》、GEORGE PAXINOS等[16]的《大鼠腦立體定位圖譜》，小鼠腦區(qū)定位多參考《小鼠腦圖譜》[17]。為更準(zhǔn)確進(jìn)行腦立體定位，本研究選用腦內(nèi)注射OA的大鼠體質(zhì)量(300±50) g, 小鼠體質(zhì)量(26±4) g。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，本文總結(jié)了OA動(dòng)物模型的具體制備方法、行為學(xué)表現(xiàn)和病理改變[18-34], 見表1。

2 實(shí)驗(yàn)方案及操作

2.1 OA的制備方法

OA是一種強(qiáng)聚醚海洋毒素，實(shí)驗(yàn)用OA主要從人工培養(yǎng)的甲藻、單細(xì)胞海洋微生物中提取，也可進(jìn)行化學(xué)合成[35]。高純度OA形態(tài)為無色晶體，分子式為C44H68O13，具有親脂性以及很強(qiáng)的穩(wěn)定性，不溶于水[36]。OA通常經(jīng)二甲基亞砜(DMSO)、無水乙醇或甲醇進(jìn)行溶解后使用[37]。有研究使用可直接溶于水的OA鈉鹽(分子式為C44H67NaO13)和OA銨鹽(分子式為C44H67KO13)進(jìn)行腦內(nèi)注射。

DMSO被稱為“萬能溶劑”，在常溫下為無色、無臭、呈微苦味的透明液體，體積分?jǐn)?shù)較高時(shí)具有細(xì)胞毒性[38]。研究[39]表明，低劑量DMSO (0.1%～2.0%)能造成大鼠和小鼠淋巴細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種體外細(xì)胞凋亡。甘津凡等[40]使用不同濃度DMSO對(duì)斑馬魚胚胎進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示, DMSO濃度僅在0.3%時(shí)能造成斑馬魚胚胎發(fā)育障礙，DMSO濃度越高，影響程度越大。

臨床開展研究使用無水乙醇、甲醇進(jìn)行OA溶解，并與生理鹽水或人工腦脊液進(jìn)行稀釋注入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦內(nèi)。研究[41-42]表明，無水乙醇、甲醇均具有刺激性，二者對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有抑制作用，也具有損害血細(xì)胞的作用。目前，對(duì)無水乙醇、甲醇的使用沒有明確的安全濃度。JIANG C等[43]發(fā)現(xiàn)，在乙醇處理的蛋白酶體亞單位中，蛋白酶體亞單位發(fā)生了過度磷酸化。YANG M等[44]采用甲醇喂養(yǎng)小鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠腦內(nèi)p-tau蛋白水平增高，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡，小鼠的認(rèn)知功能也下降。

DMSO、無水乙醇、甲醇對(duì)動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)均能產(chǎn)生損傷，因此在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，給予動(dòng)物單純進(jìn)行DMSO、乙醇、甲醇稀釋液腦內(nèi)注射，有助于明確OA溶解劑對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響。

2.2 注射部位和劑量

AD病理表現(xiàn)為腦體積縮小，腦溝加深、變寬，腦回萎縮，以海馬區(qū)萎縮最為明顯[45]。海馬是處理敘述性記憶的主要區(qū)域，參與空間訊息的儲(chǔ)存與處理，因此動(dòng)物海馬附近的側(cè)腦室及海馬(CA1、3區(qū))是注射OA的主要部位，為使OA有效吸收，需明確注射及留針時(shí)間。研究[46]認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行腦內(nèi)注射時(shí)，注射器針頭可引起大腦創(chuàng)傷，導(dǎo)致不必要的腦細(xì)胞死亡，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，因此在海馬區(qū)附近進(jìn)行注射或?qū)h(yuǎn)離注射處的海馬組織進(jìn)行結(jié)果分析能有效減少偏差。

研究[47]表明, OA對(duì)PP2A、PP1的半抑制濃度(IC50)為0.1～1.0 nmol/L和20～100 nmol/L。ARIAS C等[48]將不同劑量(25、50、150、300 ng)的OA分別注射入Wistar大鼠海馬區(qū)，結(jié)果顯示, OA注射劑量為50 ng、150 ng和300 ng均會(huì)對(duì)大鼠海馬區(qū)CA1產(chǎn)生損傷，以150 ng和300 ng的損傷最為明顯，注射劑量為25 ng則無明顯影響; 給予大鼠300 ng海馬區(qū)注射后，大鼠易出現(xiàn)頭部抖動(dòng)、咀嚼、顫抖等不良反應(yīng)。BROETTO N等[49]分別將100、200 ng OA注入大鼠腦內(nèi)，結(jié)果顯示，注射劑量為200 ng的大鼠認(rèn)知功能低于注射劑量為100 ng的大鼠, p-tau蛋白濃度高于100 ng的大鼠。在其他研究中，通常采用150 ng的OA劑量進(jìn)行腦內(nèi)注射(見表1)。多數(shù)研究通常將OA一次性注射進(jìn)動(dòng)物腦內(nèi)建立AD模型中，但也有使用側(cè)腦室導(dǎo)管埋置術(shù)[50-51]對(duì)動(dòng)物進(jìn)行多次OA腦內(nèi)注射，或間隔數(shù)天繼續(xù)進(jìn)行腦內(nèi)注射。

表1 OA腦內(nèi)注射動(dòng)物建模方法、學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)和機(jī)制

2.3 模型評(píng)價(jià)

模型復(fù)制結(jié)束后，通過學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)評(píng)價(jià)模型是否成功。本文對(duì)學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)方法進(jìn)行總結(jié)，包括Morris水迷宮(MWM)、新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(ORT)、巴恩斯(Barnes)迷宮、Y迷宮(YM)。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[52]利用動(dòng)物(大鼠、小鼠)會(huì)游泳但不喜水的特點(diǎn)，將其放于水中尋找隱藏在水中的平臺(tái)。該實(shí)驗(yàn)主要用于測(cè)試動(dòng)物對(duì)空間位置感的學(xué)習(xí)記憶能力。水池是MWM最主要的附件之一，大、小鼠所需游泳池尺寸不一，小鼠約為大鼠的50%, 平臺(tái)直徑也較小(7.5 cm)。實(shí)驗(yàn)中水溫和水的渾濁度是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，水溫一般要求20 ℃左右，為避免實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在水中觀察到平臺(tái)，通常使用二氧化鈦、牛奶使水池中的水變渾濁。該實(shí)驗(yàn)指標(biāo)是將以鼠每日4次訓(xùn)練潛伏期的平均值作為鼠當(dāng)日的學(xué)習(xí)成績(jī); 在空間探索實(shí)驗(yàn)時(shí)，對(duì)規(guī)定時(shí)間內(nèi)鼠穿過平臺(tái)所在位置的次數(shù)、所在目標(biāo)象限停留時(shí)間等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以評(píng)估鼠的空間記憶能力。

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)[53]是利用嚙齒類動(dòng)物對(duì)新奇物體喜探究的習(xí)性建立的評(píng)定其記憶識(shí)別能力的檢測(cè)方法。該實(shí)驗(yàn)不需要任何獎(jiǎng)勵(lì)或懲罰，是通過記錄和計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)熟悉物和新物體的探索時(shí)間進(jìn)行記憶力評(píng)估。為更好地模擬人類學(xué)習(xí)記憶行為，在進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)時(shí)，需保持外界環(huán)境安靜，保證動(dòng)物在自由活動(dòng)狀態(tài)下進(jìn)行新舊事物探索。該實(shí)驗(yàn)由3個(gè)階段構(gòu)成: 適應(yīng)期、熟悉期和測(cè)試期。實(shí)驗(yàn)指標(biāo)包括實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)物體的辨別指數(shù)(DI)和識(shí)別指數(shù)(RI)。DI=(探索新物體時(shí)間-探索舊物體時(shí)間)/(探索新物體時(shí)間+探索舊物體時(shí)間)，正分表示在新物體上花費(fèi)的時(shí)間更多，負(fù)分表示在舊物體上花費(fèi)時(shí)間更多，零分表示無效偏好。RI=探索新物體時(shí)間/(探索新物體時(shí)間+探索舊物體時(shí)間)×100%, >50%表示對(duì)新物體偏好, <50%對(duì)舊物體偏好, 50%表示無偏好。

巴恩斯迷宮[54]是利用嚙齒類動(dòng)物避光喜暗、喜探索的特性建立的，用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)室嚙齒類動(dòng)物的空間學(xué)習(xí)記憶、導(dǎo)航能力，較Morris水迷宮應(yīng)激性小。實(shí)驗(yàn)時(shí)將動(dòng)物放置在迷宮中央，通過適當(dāng)刺激，如強(qiáng)風(fēng)、燈光、噪音等，強(qiáng)制動(dòng)物躲藏，同時(shí)記錄動(dòng)物找到正確洞口的時(shí)間、進(jìn)入錯(cuò)誤洞口的次數(shù)、重復(fù)進(jìn)入錯(cuò)誤的洞口數(shù)。Barnes迷宮的構(gòu)建和測(cè)試方法根據(jù)實(shí)驗(yàn)對(duì)象不同有所不同，如一些迷宮外線索對(duì)大鼠有效，對(duì)小鼠可能需要迷宮內(nèi)線索進(jìn)行指引，并需要遮擋迷宮外視野。該方法需要4～7次的測(cè)試來檢測(cè)嚙齒類動(dòng)物學(xué)習(xí)和記憶能力。

Y迷宮[55]由3個(gè)臂組成，各個(gè)臂夾角120°，該實(shí)驗(yàn)包括食物獎(jiǎng)賞測(cè)試和電刺激測(cè)試。食物獎(jiǎng)賞測(cè)試是利用嚙齒動(dòng)物對(duì)新環(huán)境的探究習(xí)性來進(jìn)行，動(dòng)物不需要學(xué)習(xí)任何規(guī)則; 電刺激測(cè)試是利用嚙齒動(dòng)物避光喜暗習(xí)性設(shè)計(jì)，通過電刺激促使處在陰暗區(qū)的動(dòng)物逃離至光亮區(qū)。YM將動(dòng)物在各個(gè)臂停留的時(shí)間作為評(píng)價(jià)其空間識(shí)別記憶能力的指標(biāo)，以動(dòng)物在各個(gè)臂的穿梭次數(shù)作為其活動(dòng)能力的指標(biāo)。

2.4 相關(guān)病理學(xué)機(jī)制

Tau蛋白過度磷酸化引起的NFTs是AD發(fā)病的關(guān)鍵，tau蛋白磷酸化程度受蛋白激酶與磷酸酶調(diào)節(jié)。GSK-3β[56]、MAPK[57]和CDK5等[58]蛋白激酶能促進(jìn)tau蛋白在多個(gè)與AD發(fā)生相關(guān)的位點(diǎn)磷酸化。磷酸化后的tau蛋白可由PP2A等磷酸酶去磷酸化。蛋白激酶與蛋白激酶，蛋白激酶與磷酸酶，被證實(shí)存在協(xié)同作用，相互影響[59]。

炎癥是AD的一個(gè)重要特征，越來越多的證據(jù)表明，炎癥會(huì)影響tau蛋白磷酸化。如TNF-α、IL-1β、白細(xì)胞介素-18(IL-18)等被證明與tau蛋白磷酸化有關(guān)[60]。IL-1β能夠調(diào)控p38MAPK、GSK-3β, 進(jìn)而影響tau磷酸化[61-62]。IL-18能調(diào)節(jié)N-甲基-D-天門冬氨酸水平，影響蛋白激酶引起tau蛋白磷酸化，并提高體內(nèi)神經(jīng)元tau蛋白的釋放[63]。

研究[64-65]表明, Aβ能與腦內(nèi)氧化氫酶相互作用，促使神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡加快，而tau蛋白能擴(kuò)大Aβ引起的微管丟失，導(dǎo)致神經(jīng)炎癥等。膽堿能神經(jīng)元活性異常也能導(dǎo)致Aβ的沉積和tau蛋白過度磷酸化[66]。新神經(jīng)元和突觸的形成以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的分化、成熟和存活在與神經(jīng)生長(zhǎng)因子有關(guān)，同時(shí)也與tau蛋白磷酸化存在密切聯(lián)系[67]。

因此, OA腦內(nèi)注射的動(dòng)物模型，不僅能將與tau蛋白磷酸化有關(guān)的蛋白活性作為干預(yù)AD的療效評(píng)價(jià)指標(biāo)，也可針對(duì)不同AD假說進(jìn)行相關(guān)蛋白濃度檢測(cè)。

3 小 結(jié)

OA種類多樣，常規(guī)OA不溶于水，需在DMSO、甲醇、乙醇中溶解才能使用，也有OA鈉鹽、OA銨鹽能直接溶于水。當(dāng)前研究的OA腦內(nèi)注射的鼠種多為SD大鼠，按照腦立體定位圖譜標(biāo)準(zhǔn)，模型鼠體質(zhì)量需嚴(yán)格控制，因受雌激素對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的影響，雄性鼠是首選模型復(fù)制對(duì)象。OA腦內(nèi)注射部位多選雙側(cè)或單側(cè)腦內(nèi)海馬、側(cè)腦室; OA的注射劑量與濃度需根據(jù)動(dòng)物耐受程度進(jìn)行制備; 經(jīng)OA腦內(nèi)注射頻次、手術(shù)后的行為學(xué)檢測(cè)時(shí)間尚不統(tǒng)一; AD模型檢測(cè)方法種類繁多，其中以Morris水迷宮應(yīng)用最為廣泛; OA腦內(nèi)注射動(dòng)物模型相關(guān)病理學(xué)檢測(cè)應(yīng)圍繞tau蛋白磷酸展開。

綜上所述，利用OA腦內(nèi)注射建立的AD模型在行為學(xué)和形態(tài)學(xué)上與AD臨床癥狀相似，且符合tau蛋白磷酸化改變的AD發(fā)病機(jī)制。本文將相關(guān)實(shí)驗(yàn)的造模條件進(jìn)行總結(jié)，為今后tau蛋白磷酸化為特征的AD模型建立和機(jī)制的研究、干預(yù)手段等提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)參考。但OA腦內(nèi)注射建模方法仍存在相應(yīng)問題，不同的實(shí)驗(yàn)室在OA的使用劑量、給藥部位、時(shí)間以及頻次等方面存在差異，多次注射OA和一次性O(shè)A注射產(chǎn)生的模型結(jié)果是否存在差異，需進(jìn)一步研究。為更貼近臨床AD患者病理特征，研究采用OA聯(lián)合其他AD造模方法建立AD動(dòng)物模型，除研究機(jī)制存在一定差異外，認(rèn)知功能無明顯差異。臨床上相關(guān)研究仍然較少，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。