盛竹君，楊滿琴，高玉菊，楊曉丹，胡 蝶，徐維平

（1.安徽省針灸醫(yī)院，安徽 合肥 230061；2.安徽省立醫(yī)院，安徽 合肥 230002）

烏頭桂枝湯出自《金匱要略》，由制川烏、桂枝、白芍、炙甘草、生姜和大棗組方。方中，川烏具有祛風除濕、鎮(zhèn)痛、抗炎、增強免疫等作用[1-3］；桂枝具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、擴血管、調節(jié)免疫等作用[4-6］；白芍具有抗炎、鎮(zhèn)痛、養(yǎng)血等藥理作用，用于調節(jié)免疫和治療風濕免疫疾病等[7-8］；炙甘草具有止痛、補脾益氣、調和諸藥等功效[9］。烏頭桂枝湯鎮(zhèn)痛抗炎作用明顯，是治療各種痹癥的代表方劑[10-11］。由于中藥湯劑成分復雜，有效成分較多，采用單一指標評價具有片面性。查閱文獻和《中國藥典》可確定湯劑中多個有效成分作為評價指標，通常由主觀賦權法或客觀賦權法獲得綜合評價指標，進而優(yōu)選中藥湯劑制備工藝。主觀賦權法是根據(jù)研究者主觀意愿賦予權重系數(shù)，受主觀意識影響較大，具有一定局限性；客觀賦權法是基于矩陣的方法，對多個有效指標數(shù)據(jù)進行整理，計算出權重系數(shù)（Wi）。熵起源于熱力學，是熱能的變化量與溫度的比值，廣泛應用于工程技術及經濟社會。信息熵（Hi）是信號集的平均信息量，度量系統(tǒng)的不確定性和無序性，廣泛用于多指標評價[12］。本研究中以芍藥苷、桂皮醛、甘草苷、甘草酸單銨鹽、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿含量為評價指標，采用信息熵賦權法將多項評價指標轉換成單一評價指標，并利用正交試驗優(yōu)選湯劑提取工藝?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司），配有2966型二極管陣列檢測器、Empower3色譜工作站；BSA124S型賽多利斯電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司，精度為萬分之一）。

1.2 試藥

芍藥苷對照品（批號為AF9030313），桂皮醛對照品（批號為20051753），甘草苷對照品（批號為AF20071952），甘草酸單銨鹽對照品（批號為AF20031131），苯甲酰新烏頭原堿對照品（批號為AF8052807），苯甲酰次烏頭原堿對照品（批號為AF9112602），苯甲酰烏頭原堿對照品（批號為AF20033001），均購于成都埃法生物科技有限公司，采用面積歸一化法檢測的純度均大于98%；乙腈（色譜純，成都市諾爾施科技有限責任公司）；三乙胺（分析純，上海易恩化學技術有限公司）；磷酸（分析純，科隆化學品有限公司）；水為怡寶純凈水；制川烏（批號為356391），桂枝（批號為357151），白芍（批號為357158），炙甘草（批號為357359），生姜（批號為357601），大棗（批號為356516），均購于亳州市滬譙藥業(yè)有限公司。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Ultimate LP-C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：流動相A為乙腈，流動相B為磷酸+三乙胺混合溶液（0.5 mL磷酸和0.5 mL三乙胺，pH 6.5），梯度洗脫（0～30 min時20%A→60%A，30～31 min時60%A→80%A，31～35 min時80%A，35～36 min時80%A→20%A，36～45 min時20%A）；檢測波長：230 nm（芍藥苷、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿），237 nm（甘草苷），290 nm（桂皮醛），254 nm（甘草酸單銨鹽）；柱溫：35℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

精密稱取芍藥苷13.5 mg，用甲醇溶解定量至25 mL，精密稱取桂皮醛15.5 mg，用甲醇溶解定量至25 mL，精密稱取甘草苷13 mg，用甲醇溶解定量至25 mL；精密稱取甘草酸單銨鹽10.8 mg，用甲醇溶解定量至10 mL；精密稱取苯甲酰新烏頭原堿8 mg，用甲醇溶解定量至200 mL，精密稱取苯甲酰次烏頭原堿9.2 mg，用甲醇溶解定量至200 mL，精密稱取苯甲酰烏頭原堿3.2 mg，用甲醇溶解定量至200 mL，分別配制終質量濃度為0.540，0.620，0.520，1.080，0.040，0.046，0.016 mg/mL的對照品溶液。

精密稱取芍藥苷1.1 mg，桂皮醛1.0 mg，甘草苷0.8 mg，甘草酸單銨鹽1.0 mg，苯甲酰新烏頭原堿0.9 mg，苯甲酰次烏頭原堿0.6 mg和苯甲酰烏頭原堿0.6 mg，用甲醇溶解定量至10 mL，配制成混合對照品溶液。

取制川烏20 g，桂枝12 g，白芍9 g，炙甘草6 g，生姜9 g，大棗9枚，置圓底燒瓶中，加水浸泡后煎煮，取煎煮液定容至1 000 mL。取樣品5 mL，45℃水浴超聲10 min，混勻，放冷，0.45μm針頭濾器濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.3 方法學考察

線性關系考察：精密吸取2.1.2項下對照品溶液10μL，按2.1.1項下色譜條件進樣測定。以峰面積（Y）為縱坐標、質量濃度（X，μg/mL）為橫坐標進行線性回歸，結果見表1。以待測成分響應值分別為3倍和10倍信噪比（S/N）時的質量濃度為檢測限和定量限。結果見表1。

表1 線性關系考察與檢測限、定量限確定結果Tab.1 Results of the linear relation test，LOD and LOQ

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 正交試驗設計與結果

以藥物浸泡時間（A）、提取時間（B）、加水量（C）為影響因素，每個因素選取3個水平，以芍藥苷、甘草苷、甘草酸單銨鹽、單酯型生物堿、桂皮醛含量為評價指標，其中單酯型生物堿以苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿的總含量計，進行L9（34）正交試驗[13］。因素與水平見表2，試驗設計與結果見表3。

表2 因素與水平Tab.2 Factors and their levels

2.2.2 信息熵賦權法確定Wi

1）構建原始評價指標矩陣（Xij）mn

2）將（Xij）mn轉化為概率矩陣（Pij）mn

5）計算綜合評分（Mm）

由表3和公式計算結果可知，當Hi越小、Wi越大時，評價指標在綜合評價中作用力度越大；反之，越小。芍藥苷、甘草苷、單酯型生物堿、甘草酸單銨鹽與桂皮醛的Hi分別為0.991 7，0.998 5，0.968 3，0.986 1，0.963 8，Wi分別為0.090 6，0.016 4，0.346 1，0.151 7，0.395 2?？梢?，桂皮醛含量的Hi小、Wi大，在不同試驗條件下變化最顯著，在綜合評價中作用力度最大；甘草苷含量則相反。

2.2.3 方差分析

由表3可知，各因素對烏頭桂枝湯綜合評分的影響主次順序為提取時間＞浸泡時間＞加水量。烏頭桂枝湯提取最優(yōu)工藝為A2B2C2，即加10倍量水浸泡1.0 h，提取1.0 h。采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析，結果見表4?？梢姡崛r間有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），浸泡時間和加水量均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 L9（34）正交試驗設計與結果Tab.3 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表4 方差分析結果Tab.4 Results of the ANOVA

2.3 驗證試驗

按優(yōu)選最佳工藝提取3批烏頭桂枝湯進行驗證試驗，結果見表5?？梢姡崛」に?、數(shù)據(jù)評價方法具有可行性。

表5 驗證試驗結果Tab.5 Results of the verification test

3 討論

3.1 評價指標選擇

參考2020年版《中國藥典（一部）》，本研究中以白芍中芍藥苷，制川烏中苯甲酰新烏頭原堿，苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿，桂枝中桂皮醛[14］288，炙甘草中甘草苷[14］89和甘草酸單銨鹽[14］200為評價指標。制川烏毒性較大，煎煮后由毒性較高的雙酯型生物堿水解成毒性較低的單酯型生物堿[15］。苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿是制川烏中的單酯型生物堿，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等作用[16-17］。芍藥苷具有抗炎、增強免疫力、抗氧化等藥理作用[18］。桂皮醛具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗炎等藥理作用[19］。甘草苷具有抗凋亡、抗炎、降糖、調脂等藥理作用[20］。甘草酸單銨鹽具有良好的抗炎與抗腫瘤等藥理作用[21］。本研究中并未評價烏頭桂枝湯在基礎研究中的其他活性物質，所選評價指標不能全面優(yōu)選提取工藝。

3.2 檢測波長選擇

芍藥苷、桂皮醛、甘草苷、甘草酸單銨鹽、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿的混合對照品溶液在200～800 nm范圍內進行全波長掃描，檢測波長為各有效成分的最大吸收波長，可確保檢測方法的正確性。

3.3 正交試驗設計

正交試驗利用“均勻分散”挑選在考察范圍內的少量試驗點，以及應用“整齊可比”更方便分析試驗結果，找出最佳制備工藝。為了保證試驗結果的“整齊可比”，需要較多的試驗點。運用正交試驗[22-23］優(yōu)化烏頭桂枝湯提取工藝，考察浸泡時間、提取時間、加水量三因素三水平。在烏頭桂枝湯的優(yōu)化工藝中，需兼顧多個有效成分作為評價指標，具有復雜性和難度性。

3.4 信息熵賦權法

Hi是不確定性和無序性的一種量度，熵權法以Hi為理論依據(jù)，對多種指標評價賦權，得出綜合評分，可作為多指標數(shù)據(jù)評價的理論依據(jù)[24］。在藥物多個效應評價的試驗中，將多個效應評價指標通過信息熵理論進行客觀賦權，建立綜合效應評價指標，綜合效應評價指標可清晰反映藥物劑量對多個效應評價指標的整體影響，避免各個效應評價指標的互相影響，提升了試驗多評價指標數(shù)據(jù)處理的科學性和嚴謹性[25］。

3.5 評價指標處理

中藥湯劑成分復雜，有效成分較多，本研究中通過查閱文獻和藥典確定湯劑中多個有效成分為評價指標，Wi是湯劑優(yōu)選工藝多指標評價的關鍵。采用信息熵賦權法計算各指標含量的Wi，將多項評價指標轉換成單一評價指標。但單純使用客觀賦權法也有一定局限性，可能會造成中藥復方的主要成分權重過低或次要成分權重過高。故在實際操作中還應根據(jù)具體研究確定是否和主觀賦權法聯(lián)用。