顧鑫鑫，楊海峰，吳一萍

（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

0 引言

光電化學(xué)（PEC）傳感器通常由光源、識別元件、信號轉(zhuǎn)換系統(tǒng)和信號采集系統(tǒng)組成［1］.它的工作原理是光電材料，通常是半導(dǎo)體或量子點，吸收特定波長的光后被激發(fā)，電子由價帶（VB）躍遷至導(dǎo)帶（CB），產(chǎn)生電子-空穴對；電子-空穴對與外界環(huán)境中的物質(zhì)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，形成回路電流，由此確定光電信號與待測物之間的關(guān)系，實現(xiàn)光電檢測［2］.光電材料在PEC傳感器中至關(guān)重要，它不僅起到固定分子、產(chǎn)生和傳輸信號的作用，且決定著傳感器檢的檢測靈敏度.無機(jī)半導(dǎo)體材料是目前PEC研究中使用最廣泛的一類材料，主要包括金屬氧化物、量子點和無機(jī)半導(dǎo)體納米晶.這類半導(dǎo)體材料的優(yōu)點是制備簡便、形貌可控和化學(xué)穩(wěn)定性相對較好；不足之處是電子-空穴復(fù)合率高，某些半導(dǎo)體材料（如ZnO、CdS）具有光腐蝕特性［3-4］，且?guī)兜姆€(wěn)定性和可調(diào)諧性較差等缺點.

血尿素氮是目前體檢的必檢項目之一，也是臨床上最廣泛應(yīng)用于腎功能評估的血清標(biāo)志物之一，其對心功能等方面的評估也起到一定的參考價值.成人正常血尿素氮水平約為3.2～7.1 mmol·L-1，嬰兒及兒童約為1.8～6.5 mmol·L-1.慢性腎衰竭是指各種腎臟病導(dǎo)致腎臟功能漸進(jìn)性不可逆地減退，直至功能喪失所出現(xiàn)的一系列癥狀和代謝紊亂所反映出的臨床綜合征.慢性腎衰的終末期即為尿毒癥.美國國家健康和營養(yǎng)調(diào)查表明慢性腎臟病的患病率約為16%［5］.慢性腎臟病的主要后果之一是血液中代謝廢物的水平顯著增加，包括通常由腎臟排泄的尿素（urea）和肌酐（creatinine）［6］.在尿毒癥患者中，尿素水平可以達(dá)到健康者的10倍，尿素從1.7～8.1 mmol·L-1上升到50～70 mmol·L-1［7］，因此尿素被認(rèn)為是評估尿毒癥患者毒素水平的最佳指標(biāo).目前尿素的測定方法有比色法、熒光法、氣相色譜法、酶比色法/分光光度法和高效液相色譜法［8］.然而，這些方法存在樣品前期處理耗時長、成本高和分析時間長等不足［9］.電化學(xué)方法因其儀器設(shè)備簡單、響應(yīng)速度快速、檢測靈敏度高等優(yōu)勢，在生物化學(xué)分析中一直占據(jù)特殊的地位.電位法和安培生物傳感是兩種常見的尿素電化學(xué)測定方法［10］.這兩種方法中，電位法因為選擇性高，被認(rèn)為是可以替代傳統(tǒng)尿素測定方法的較好方案.在電位生物傳感方法中，尿素被固定化尿素酶水解成銨根離子（NH4

+）和碳酸氫根（HCO3-）離子，利用離子選擇性測定NH4+或HCO3-的濃度即可確定尿素的濃度.在尿素生物傳感器中，通常需要將尿素酶化學(xué)固定在不同的載體上.然而，酶的共價固定不可避免地會導(dǎo)致其生物活性部分喪失和穩(wěn)定性變差.還有一些工作涉及繁瑣的材料制備和修飾，這會大大提高傳感器的使用成本和實際可利用性.

導(dǎo)電聚合物中聚苯胺（PANI）、聚噻吩和聚吡咯是一種具有類似于半導(dǎo)體和金屬等無機(jī)材料電性能的有機(jī)高分子材料，其制造成本低、加工性能好、機(jī)械柔性高和可功能化范圍廣，因此是無機(jī)材料理想的替代品.PANI導(dǎo)電性良好，且是所有導(dǎo)電聚合物中制造成本最低、熱穩(wěn)定性最好的［11］.與其他共軛聚合物相比，PANI還具有獨特的氧化還原狀態(tài)和摻雜機(jī)理.可以向PANI祖母綠堿中摻雜酸，得到導(dǎo)電祖母綠鹽的結(jié)構(gòu)，這兩種狀態(tài)下PANI的電導(dǎo)率會發(fā)生顯著變化，且該過程可逆.PANI的這種可逆特性可用于檢測許多酸性和堿性蒸汽［12］.此外，科研工作者還利用PANI可逆的氧化還原特性構(gòu)建信號放大策略，實現(xiàn)對小分子、蛋白質(zhì)和DNA的靈敏測定［13-15］.與傳統(tǒng)的致密薄膜相比，納米纖維形式的PANI具有更高的比表面積，生物兼容性也更好.它們可以通過共價等方式與各種有機(jī)和無機(jī)材料連接，以實現(xiàn)材料間的協(xié)同效應(yīng).例如，可以將單鏈DNA連接到附著在PANI納米纖維上的金納米顆粒上，以實現(xiàn)對金黃色葡萄球菌的檢測［15］.

為了探究PANI在PEC傳感器中的應(yīng)用，通過旋涂法將PANI固定在氧化銦錫（ITO）電極表面，形成半導(dǎo)體膜，記為聚苯胺/氧化銦錫（PANI/ITO）.然后，在電極表面修飾聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA），通過靜電吸附的方式將脲酶（urease）固定在PANI/ITO上.PANI可質(zhì)子化，在與尿素分解產(chǎn)物NH4+結(jié)合后，其導(dǎo)電狀態(tài)發(fā)生變化，從而引起自身光電流的改變.基于這一特性，構(gòu)建了可以檢測尿素的PEC傳感器.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

無水乙醇、丙酮、異丙醇、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、PANI（翠綠亞胺基）、尿素、磷酸緩沖液（pH值為7.2～7.6）均購自Sigma公司；脲酶購自阿拉丁試劑公司；ITO導(dǎo)電玻璃購于深圳偉光公司南玻有限公司.實驗過程中用的水均由電阻率為18.25 MΩ·cm的超純水配制而成，所有的試劑和化學(xué)品均直接使用，未經(jīng)進(jìn)一步分離提純.

1.2 實驗儀器

PEC反應(yīng)儀（PEAC 200A型，天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司）；X射線衍射儀（XRD，Rigku XRD MiniFlex，日本理學(xué)公司）；電化學(xué)工作站（CHI 440C，上海辰華儀器有限公司）；臺式勻膠機(jī)（KW-4A型，中國科學(xué)院微電子研究所）；透射電子顯微鏡（TEM，S-4800型，日本日立儀器有限公司）；紫外-可見分光光度計（UV-7504PC型，上海欣茂儀器有限公司）；干燥箱（DZF-6000，上?；厶﹥x器制造有限公司）；純水儀（Milli-Q，上海淼康實業(yè)有限公司）.

1.3 制備Urease/PANI/ITO復(fù)合電極

配置8 mg·mL-1的PANI前驅(qū)液：利用電子天平稱量一定質(zhì)量的PANI黑色固體粉末，加入合適體積的N-甲基吡咯烷酮，即得到8 mg·mL-1的PANI溶液；將所配置的溶液加入超聲儀中室溫超聲1 h，制得深藍(lán)色的PANI分散液.

制備PANI/ITO電極：將制備的PANI前驅(qū)液（70 μL）旋涂在預(yù)先洗凈并烘干的導(dǎo)電ITO玻璃表面（5 cm×5 cm）；將電極放入烘箱于45℃烘干30 min；將干燥后的電極進(jìn)行第二次旋涂，并再次進(jìn)行烘干處理.最后得到的電極表面有一層深藍(lán)色的透明薄膜.

制備Urease/PANI/ITO電極：配置質(zhì)量濃度為3 mg·mL-1的PDDA，取70 μL均勻的滴涂在ITO表面（面積為1 cm×2 cm），于保濕盒中孵育12 h后取出，用去超純水清洗2遍，氮氣（N2）吹干.再將70 μL的脲酶（125 g·mL-1）滴涂在電極表面，孵育4 h后于搖床上用去超純水清洗3 min，N2吹干備用.

1.4 電化學(xué)阻抗（EIS）表征

在CHI 440C電化學(xué)工作站上對電極進(jìn)行EIS表征，以驗證電極表面修飾是否成功.實驗條件為：三電極體系，包括Urease/PANI/ITO為工作電極，銀/氯化銀（Ag/AgCl）為參比電極，鉑（Pt）絲為輔助電極；阻抗液為5.0 mmol·L-1［Fe（CN）6］3-/4-溶液，其中含0.1 mol·L-1KCl；振幅設(shè)置20 mV，低頻設(shè)置0.1 Hz，高頻設(shè)置100 000 Hz；整個EIS實驗在安靜的環(huán)境下完成.

1.5 PEC測試

檢測系統(tǒng)為CHI 440C電化學(xué)工作站，激發(fā)光源為465 nm藍(lán)光，光照時間設(shè)置10 s，停滯時間設(shè)置10 s，實驗過程光源的啟動和關(guān)閉全自動化進(jìn)行；采用計時電流技術(shù)進(jìn)行光電檢測，Ag/AgCl為參比電極，Pt絲電極為對電極，電解液為0.01 mol·L-1Tris-HCl（pH=7.2），偏壓設(shè)置為-0.4 V.

2 結(jié)果討論

2.1 PANI膜形貌表征

圖1（a）是PANI粉末的TEM圖，可以看到本征態(tài)PANI以無定形納米顆粒的狀態(tài)存在.圖1（b）是PANI粉末XRD圖，結(jié)果顯示PANI粉末沒有特定的衍射峰，而是在25.5°附近出現(xiàn)了一個寬峰，這與TEM下觀察到的PANI呈無定形性納米顆粒相一致［16-18］.圖1（c）是PANI粉末的紫外可見光譜，結(jié)果顯示PANI出現(xiàn)2處特征吸收，分別位于340 nm和635 nm處，分別由苯環(huán)的p-p*躍遷和電子向醌環(huán)的躍遷導(dǎo)致［19-20］.圖1（d）是所制備的PANI/ITO電極的宏觀圖，可以看到涂敷在ITO基底表面的PANI薄膜呈透明深藍(lán)色.

圖1 PANI粉末的形貌表征.

2.2 Urease/PANI/ITO電極電化學(xué)表征

EIS譜可以有效表征電極表面的修飾過程.圖2（a）顯示了PEC傳感器構(gòu)建過程中涉及的阻抗變化.阻抗圖中半圓直徑的大小可以反映電極內(nèi)阻（Ret）的變化，半圓直徑越大，代表Ret越大.因為PANI為有機(jī)半導(dǎo)體材料，ITO基底表面涂敷上該有機(jī)半導(dǎo)體膜后Ret增大；脲酶為生物大分子材料，導(dǎo)電性差，隨著其在電極表面的固定，Ret進(jìn)一步增大，電子傳輸能力再次下降.根據(jù)圖2（a）可以觀察到不斷增大的Ret，表明PANI和脲酶在ITO基底表面固定成功.圖2（b）是不同電極的光電響應(yīng)，可以看到PANI膜在-0.4 V的偏壓下光電響應(yīng)強(qiáng)，約為5 μA.該光電流為陰極光電流，代表PANI為P型半導(dǎo)體，光激發(fā)空穴在介帶富集，電子由外電路流入電極.另外，當(dāng)PANI/ITO電極表面組裝脲酶之后，光電流顯著下降，這可能是由于脲酶的固定阻礙了部分激發(fā)光的透過，Ret增大而導(dǎo)致的.

圖2 Urease/PANI/ITO制備的電化學(xué)表征.（a）ITO，PANI/ITO和Urease/PANI/ITO在磷酸緩沖溶液（PB）里的光電響應(yīng)（光電檢測條件為：偏壓-0.4 V，光源為450 nm左右的藍(lán)光，光照時間為10 s）；（b）不同電極的阻抗圖（阻抗液為5.0 mmol·L-1［Fe（CN）6］3-/4-溶液，其中含有0.1 mol·L-1 KCl）

2.3 檢測條件優(yōu)化

為了使傳感器達(dá)到最佳性能，實驗過程中，對光源和PANI膜的厚度進(jìn)行了優(yōu)化.光電測定在10 mmol·L-1PB緩沖液（pH=7.2）中進(jìn)行，圖1（c）的紫外可見光譜表明PANI膜在400～700 nm波段都有吸收，所以在此波段內(nèi)選擇了相同功率下3種不同的光源進(jìn)行優(yōu)化.結(jié)果如圖3（a）所示，PANI對光源為450 nm左右的藍(lán)光響應(yīng)最強(qiáng).圖3（b）是不同質(zhì)量濃度PANI溶液制備的PANI膜的電流-電壓（I-V）曲線，掃描電極的電壓從-0.4 V～0.2 V.在藍(lán)光的激發(fā)下，不同厚度PANI膜顯示出整流特性，當(dāng)PANI溶液為8 mg·mL-1時，對應(yīng)的半導(dǎo)體膜光電流響應(yīng)趨于穩(wěn)定.

圖3 PANI/ITO電極激發(fā)光源和PANI質(zhì)量濃度的選擇.（a）2 mg·mL-1 PANI溶液制備的PANI膜在不同光源照射下的I-V曲線圖；（b）不同質(zhì)量濃度PANI下制備的PANI/ITO電極的光電響應(yīng)

圖4顯示不同質(zhì)量濃度尿酶以及孵育時間對光電流的影響.由圖4（a）可知，隨著尿酶質(zhì)量濃度的增加，光電流出現(xiàn)先增大后減小的現(xiàn)象.這可能是由于125 mg·mL-1的脲酶足以將所有尿素完全分解，使光電流的響應(yīng)達(dá)到最大.進(jìn)一步增加脲酶反而會使電極導(dǎo)電性變差，阻礙電子在電極表面的傳輸，引起光電流的下降.因此，在接下來的檢測過程中，脲酶的質(zhì)量濃度固定為125 mg·mL-1.圖4（b）是脲酶和尿素孵育時間的優(yōu)化，可以觀察到40 min后光電流達(dá)到穩(wěn)定，表明尿素完全分解.因此，尿素的最佳孵育時間為40 min.

圖4 Urease/PANI/ITO電極在（a）不同尿酶質(zhì)量濃度和（b）尿素和脲酶不同孵育時間下的光電響應(yīng)（光電檢測條件為，偏壓-0.4 V，光源為450 nm左右的藍(lán)光，光照時間為10 s）

2.4 尿素檢測

確定好最優(yōu)檢測條件后，利用Urease/PANI/ITO電極對不同質(zhì)量濃度的尿素進(jìn)行了測定.由于PANI的自然可逆去質(zhì)子化過程，PANI的導(dǎo)電翠綠鹽（ES）形式會轉(zhuǎn)化為半導(dǎo)體翠綠堿（EB）形式，在這個過程中PANI由于本身狀態(tài)的改變從而帶來導(dǎo)電性的變化.檢測過程中尿素會在脲酶的作用下分解產(chǎn)生NH4+，通過反應(yīng)方程式（1）可以推測得到，產(chǎn)生的NH4+會將PANI中EB形式質(zhì)子化為ES形式.根據(jù)上述分析可知，光電流響應(yīng)與尿素的濃度呈正相關(guān)性，尿素濃度越高在脲酶作用下會產(chǎn)生的NH4+也越多，那么釋放的質(zhì)子將PANI的亞胺質(zhì)子化，更多轉(zhuǎn)換為ES形式，帶來較強(qiáng)的光電流信號［21］.

圖5（a）為最優(yōu)實驗條件下此生物傳感器對不同物質(zhì)的量濃度尿素的光電響應(yīng).可以看到隨著尿素物質(zhì)的量濃度的增加，光電流逐漸升高.圖5（b）是尿素物質(zhì)的量濃度（c）與光電流強(qiáng)度變化（ΔI）的擬合圖，可以發(fā)現(xiàn)兩者在10-3～10-8mol·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為ΔI=2 166+2 52lgc，相關(guān)系數(shù)的平方（R2）=0.981，最低檢測限為1.8×10-9mol·mL-1.

圖5 Urease/PANI/ITO電極在（a）不同物質(zhì)的量濃度尿素的光電響應(yīng)（A→G分別為：0，10-8，10-7，10-6，10-5，10-4，10-3 mol·L-1），以及（b）光電流變化與尿素濃度間的線性關(guān)系（光電檢測條件為，偏壓-0.4 V，光源為450 nm左右的藍(lán)光，光照時間為10 s）

2.5 傳感器重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性考察

此外，還對傳感器的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性進(jìn)行了考察.圖6（a）是不同批次制得的PANI/ITO和Urease/PANI/ITO電極的光電響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)不同批次之間光電流強(qiáng)度差異不大，表明該傳感器重現(xiàn)性良好.另外，通過連續(xù)開/關(guān)燈約400 s，得到如圖6（b）所示的光電響應(yīng)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過20多個循環(huán)之后，無論是PANI/ITO還是Urease/PANI/ITO電極，光電流仍然保持平穩(wěn)狀態(tài)，該生物傳感器展現(xiàn)了優(yōu)異的光穩(wěn)定性.此外，對該傳感器的特異性也進(jìn)行了考察，選擇了4種可能會對尿素測定帶來干擾的物質(zhì)，包括抗壞血酸（ascorbic acid）、肌酐、胱氨酸（cystamine）和葡萄糖（glucose），考察了傳感器對它們的響應(yīng)，結(jié)果如圖6（c）所示，發(fā)現(xiàn)雖然這些干擾物的濃度高達(dá)0.01 mol·L-1，但它們在電極表面的響應(yīng)與背景接近，表明傳感器選擇性良好.脲酶對尿素特異性催化降解，保證了該傳感器的特異性.

圖6 傳感器重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性考察.（a）不同批次的PANI/ITO和Urease/PANI/ITO電極在PB緩沖溶液（pH=7.2）中的光電響應(yīng)；（b）Urease/PANI/ITO電極穩(wěn)定性考察；（c）Urease/PANI/ITO電極對尿素（10-7 mol·L-1）、抗壞血酸（0.01 mol·L-1）、肌酐（0.01 mol·L-1）、胱氨酸（0.01 mol·L-1）、葡萄糖（0.01 mol·L-1）的響應(yīng).

3 結(jié)論

基于制備的Urease/PANI/ITO復(fù)合電極，利用PANI的半導(dǎo)體屬性和可質(zhì)子化特性，發(fā)展了可選擇性檢測尿素的PEC法.該傳感器以脲酶為識別元件，利用脲酶可以特異性降解尿素產(chǎn)生NH4+導(dǎo)致PANI質(zhì)子化，從而改變其導(dǎo)電狀態(tài)，最終引起光電流的變化，建立尿素濃度和光電流強(qiáng)間的相關(guān)性，從而實現(xiàn)對尿素的快速、靈敏和特異性的檢測.與其他方法比，該傳感器成本低效益高，且具有操作簡單的優(yōu)勢.