余益成，王珊珊，殷 敏，呂 敏

（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

0 引言

細(xì)菌菌膜是細(xì)菌附著在生物或非生物表面，生長為由自身產(chǎn)生的胞外聚合物基質(zhì)（EPS）包裹的多細(xì)菌群落［1］.其中，由多糖、蛋白質(zhì)和胞外DNA等生物大分子交聯(lián)形成的黏性EPS對細(xì)菌起著重要的保護(hù)作用.因此，菌膜被認(rèn)為是細(xì)菌抵御環(huán)境風(fēng)險和壓力的重要生存模式.這種生長方式極大地影響著人類的生活環(huán)境和健康安全，備受生物醫(yī)學(xué)、工業(yè)和地理環(huán)境等領(lǐng)域關(guān)注［2-3］.菌膜對環(huán)境和健康的影響有利有弊：一方面，致病細(xì)菌菌膜誘發(fā)的急慢性感染疾病，嚴(yán)重威脅著人類的健康和安全［4-6］；另一方面，有益的細(xì)菌菌膜在處理地球物質(zhì)循環(huán)、工廠廢水和降解有毒化合物生物等方面發(fā)揮著積極作用.細(xì)菌菌膜的生長與周圍環(huán)境條件密切相關(guān)，環(huán)境條件的改變會導(dǎo)致菌膜結(jié)構(gòu)和組成的改變［7-8］.因此，維持環(huán)境穩(wěn)態(tài)對于細(xì)菌菌膜實現(xiàn)環(huán)境物質(zhì)分解和循環(huán)起著至關(guān)重要的作用.

納米科技的興起和發(fā)展，涌現(xiàn)出大量具有優(yōu)異抗菌性和抗菌膜特性的納米材料，比如金屬納米顆粒、金屬氧化物納米顆粒以及碳族納米材料［9-12］.特別是多壁碳納米管（MWCNT）作為一種優(yōu)異的納米抗菌材料受到了廣泛關(guān)注.CHEN等［13］發(fā)現(xiàn)單壁碳納米管和MWCNT可以通過膜去極化抑制細(xì)菌生長.近年來，研究發(fā)現(xiàn)碳納米管對菌膜的生長也有顯著的影響.在菌膜形成的初始階段，單壁碳納米管與細(xì)菌相互作用并抑制其生長；但是，成熟菌膜對碳納米管具有高度抗性.這是因為在成熟的菌膜中，細(xì)菌分泌大量的胞外多聚物減輕了碳納米管的毒性［14-15］.由于碳納米管具有大的比表面積和豐富的官能團(tuán)，研究人員構(gòu)建了豐富多彩的功能化碳納米管［16］.其中，多聚物修飾碳納米管不僅改善了碳納米管在生理介質(zhì)中的分散性，而且因其兼具碳納米管和多聚物材料的特殊理化性質(zhì)，被廣泛用于涂料包裝、橡皮筋、垃圾袋等原材料［17-18］.這些塑料產(chǎn)品最終將隨著消費使用結(jié)束釋放到環(huán)境中，會與微生物群落發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，這種作用是否會導(dǎo)致細(xì)菌個體及群體生長的改變，成為納米毒理學(xué)和環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的焦點.

本文作者利用共價接枝的方法合成了MWCNT接枝聚乙烯亞胺（MWCNT-PEI）；選擇誘發(fā)呼吸道囊性纖維化疾病的銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）為模式菌株，系統(tǒng)研究了MWCNT-PEI與浮游細(xì)菌和菌膜的相互作用.結(jié)果顯示：MWCNT-PEI可以有效抑制銅綠假單胞菌生長，而且抗菌作用還呈現(xiàn)濃度依賴性.此外，MWCNT-PEI會影響菌膜的生長周期，導(dǎo)致菌膜成熟期提前；高濃度MWCNT-PEI促使菌膜分散期提前.另外，MWCNT-PEI會改變成熟菌膜的結(jié)構(gòu)組成，刺激細(xì)菌分泌大量的EPS.這些結(jié)果為深入理解納米材料與菌膜相互作用提供了新理論，也為評估碳納米材料對環(huán)境微生物的影響提供了科學(xué)指導(dǎo).

1 材料與方法

1.1 材 料

肉湯培養(yǎng)基（LB）和瓊脂粉（Agar），均采購于生工生物工程（上海）股份有限公司；濃硫酸、濃硝酸、MWCNT和支化聚乙烯亞胺（PEI），均采購于西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司（Sigma-Aldrich）；SYTO9綠色熒光核酸染料購自英濰捷基貿(mào)易有限公司（Invitrogen）；Alexa Fluor?594與刀豆蛋白A的偶聯(lián)物和結(jié)晶紫（CV）均采購于賽默飛世爾科技公司（Thermo Fisher Scientific）.

1.2 實驗儀器

紫外分光光度儀（Shimadzu UV-18000）；超聲速離心機(jī)（Beckman Coulter DU 730）；透射電子顯微鏡（TEM，JEOL 2100）；動態(tài)光散射分析儀（DLS，Malvern Nano-ZS90）；酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan MK3）；離心機(jī)（Eppendorf Centrifuge 5424R）；超聲機(jī)（XM300UHP）；激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP8）；恒溫培養(yǎng)箱（LRH-70F）；恒溫震蕩培養(yǎng)箱（THZ-C-L）；垂直層流凈化工作臺（CA-920-2）.

1.3 實驗方法

1.3.1 MWCNT-COOH的制備

0.75 g MWCNT分散于60 mL濃硫酸和20 mL濃硝酸中，在60℃，460 r·min-1條件下反應(yīng)6 h.待反應(yīng)完，反應(yīng)體系靜置、冷卻至室溫.然后，真空抽濾，洗滌至中性pH=7，得到羧基化酸化的多壁碳納米管（MWCNT-COOH）.在冰面上超聲30 min，超聲探針尖端6 mm，振幅10%.測得500 nm處吸光度（按吸光系數(shù)39.92 mg·mL-1計算），計算MWCNT-COOH質(zhì)量濃度［19-20］.

1.3.2 MWCNT-PEI的制備

將MWCNT-COOH與PEI按質(zhì)量比為1∶10的比例在水溶液中混合，超聲10 min；在84℃，460 r·min-1條件下反應(yīng)16 h.待反應(yīng)停止，冷卻至室溫，用孔徑為0.45 μm的濾膜進(jìn)行真空抽濾，洗去未反應(yīng)的PEI，反復(fù)洗10次.將MWCNT-PEI冷卻至室溫，真空烘干.

1.3.3 銅綠假單胞菌的培養(yǎng)

取3 μL凍于-80℃的銅綠假單胞菌液接種于3 mL LB肉湯培養(yǎng)基，搖床（37℃，220 r·min-1）過夜培養(yǎng)，取對數(shù)期生長的菌液在瓊脂平板上劃線培養(yǎng)，長出單菌落，保存4℃冰箱中備用.

1.3.4 MWCNT-PEI對浮游銅綠假單胞菌生長的影響

挑取備用瓊脂平板的單菌落于3 mL的LB中，搖床（37℃，220 r·min-1）培養(yǎng)過夜.取1 mL對數(shù)期菌液離心（10 000 r·min-1，30 s），磷酸緩沖鹽溶液（PBS）清洗2次，去掉死細(xì)菌.稀釋后，用分光光度計測600 nm處的吸光度數(shù)值（OD600），確定細(xì)菌濃度（即每毫升的菌落數(shù)）.分散于PBS的細(xì)菌（終濃度約為107CFU·mL-1）與不同質(zhì)量濃度的MWCNT-PEI（5，10，20 μg·mL-1）作用60 min，用平板計數(shù)法數(shù)細(xì)菌數(shù)目，計算細(xì)菌存活率：

1.3.5 MWCNT-PEI對細(xì)菌菌膜生長動力學(xué)的影響

細(xì)菌濃度為105CFU·mL-1的50 μL菌懸浮液加入96孔板，然后加入50 μL MWCNT-PEI，使其最終質(zhì)量濃度為0，5，10，20 μg·mL-1，放置培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng).選取細(xì)菌菌膜生長過程中不同時間點（2，6，20，24，28，36和48 h）測定的細(xì)菌菌膜的生物量.

CV染色法可用于細(xì)菌菌膜生物量的測定.生長到一定時間點的菌膜，用PBS輕輕地洗3次，去除懸浮細(xì)菌，自然風(fēng)干3 min.然后，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的CV染液染色15 min，吸去CV染液后，用PBS洗3次，再加入體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇脫色15 min，酶標(biāo)儀測試595 nm處的吸光值.

1.3.6 MWCNT-PEI對細(xì)菌菌膜結(jié)構(gòu)的影響

使用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）研究菌膜的結(jié)構(gòu)，終濃度為107CFU·mL-1的菌液加入24孔板，然后分別加入質(zhì)量濃度為0，5，10，20 μg·mL-1的MWCNT-PEI，進(jìn)行培養(yǎng).培養(yǎng)24 h后，PBS洗1次，熒光染料SYTO9（激發(fā)光/發(fā)射光為488/500 nm）染色15 min，洗去多余染料；再用Alexa Fluor?594（激發(fā)光/發(fā)射光為561/590 nm）與刀豆蛋白A的偶聯(lián)物染色20 min；最后，用CLSM進(jìn)行觀察，以z軸步長為1 μm掃描菌膜獲取3D菌膜圖，所得3D圖像通過LAS AF軟件進(jìn)行分析，確定MWCNT-PEI對細(xì)菌菌膜的結(jié)構(gòu)的影響.

2 結(jié)果與討論

2.1 MWCNT-PEI的合成與表征

MWCNT羧基化后，通過共價接枝的方法制備MWCNT-PEI，如圖1（a）所示［21］.使用TEM觀察碳納米管的形貌，如圖1（a）和1（c）所示，結(jié)果顯示：混酸處理的MWCNT-COOH和MWCNT-PEI結(jié)構(gòu)完整，呈管狀結(jié)構(gòu)；MWCNT和MWCNT-PEI的直徑分別約為11 nm和13 nm，說明MWCNT-COOH表面接枝了PEI.Zeta電位測試佐證了MWCNT-PEI的成功合成.如圖1（d）所示，MWCNT-COOH帶負(fù)電，電位為-55.4 mV；當(dāng)接枝帶正電的PEI后，MWCNT-PEI的Zeta電位上升到47.7 mV.碳納米材料的分散性與生物效應(yīng)密切相關(guān)［22］.因此，評估了MWCNT在不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性.如圖1（e）所示，MWCNT-PEI在多種介質(zhì)中都能保持良好的穩(wěn)定性和分散性.

圖1 MWCNT-PEI的合成及表征.（a）MWCNT的TEM圖；（b）MWCNT的粒徑分析圖；（c）MWCNT-PEI的TEM圖；（d）MWCNT-PEI的粒徑分析圖；（e）Zeta電位圖；（f）不同介質(zhì)中的穩(wěn)定性

2.2 MWCNT-PEI抑制浮游細(xì)菌生長

碳家族納米材料包括零維富勒烯、一維碳納米管、二維石墨烯等碳納米材料及其衍生物，它們作為一類新型納米抗菌材料在納米生物學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注［23-25］.大量報道證實，MWCNT有優(yōu)良的抗菌性能［13］，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等革蘭氏陽性菌和陰性菌都有很好的抑制和殺滅效果.采用平板計數(shù)法評估了MWCNT接枝多聚物后對銅綠假單胞菌活力的影響.結(jié)果如圖2所示，與對照組相比，銅綠假單胞菌在不同濃度MWCNT-PEI（5，10，20 μg·mL-1）暴露60 min后，細(xì)菌數(shù)量隨MWCNT-PEI質(zhì)量濃度的增加而減少.MWCNT-PEI為5 μg·mL-1時，超過50%的細(xì)菌失活；MWCNT-PEI的質(zhì)量濃度增加到20 μg·mL-1時，幾乎沒有細(xì)菌存活，殺菌率高達(dá)96%.以上結(jié)果表明：MWCNT-PEI具有優(yōu)異的抗菌性能，可以有效抑制銅綠假單胞菌生長，而且這種抗菌能力還呈現(xiàn)濃度依賴性.

圖2 MWCNT-PEI的抗菌性.

2.3 MWCNT-PEI對菌膜形成的影響

菌膜是細(xì)菌在自然界的主要生存方式.研究發(fā)現(xiàn)：菌膜形成是一個動態(tài)過程，主要包括4個階段：1）細(xì)菌不可逆地附著在生長基底表面上；2）黏附的細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖，形成細(xì)菌團(tuán)，同時產(chǎn)生大量的胞外多聚物基質(zhì)（EPS）；3）形成成熟細(xì)菌菌膜；4）菌膜分散，即菌膜內(nèi)的細(xì)菌分散逃逸，形成新的聚集體，開始新一輪菌膜形成［6］.環(huán)境因素（例如抗菌劑［26］、機(jī)械壓力［27］或滲透壓［28］等）顯著影響菌膜的形成和結(jié)構(gòu).多聚物修飾MWCNT的廣泛研究和應(yīng)用使其在環(huán)境中的釋放量不斷增加［18］.在浮游細(xì)菌中加入MWCNT-PEI，模擬碳納米管釋放到環(huán)境中與細(xì)菌相互作用，觀察其對菌膜形成的影響.

CV染色觀察和分析（圖3）顯示，正常菌膜和不同質(zhì)量濃度MWCNT-PEI處理的菌膜都經(jīng)歷了相似的生長階段和生長趨勢.它們都是從最初的黏附到逐漸成熟的生物膜，生物量不斷增大，最終達(dá)到峰值；成熟菌膜因為營養(yǎng)匱乏和氧氣壓力等原因［6］，開始彌散形成新的細(xì)胞團(tuán)，生物量開始顯著減少.但是，MWCNT-PEI促使菌膜提前到達(dá)成熟期，正常菌膜在20 h后到達(dá)成熟期，MWCNT-PEI處理后的菌膜12 h后已趨于成熟.這種現(xiàn)象可能是因為低濃度的碳納米管不足以殺死所有的細(xì)菌，而且碳納米管大的比表面積使其能夠吸附生物大分子，為細(xì)菌生長提供支點［29］.高濃度MWCNT-PEI（20 μg·mL-1）還會導(dǎo)致菌膜的分散時間提前到36 h.這可能是在菌膜的形成過程中，由于氧氣和營養(yǎng)物的減少，導(dǎo)致菌膜提前進(jìn)入分散期.然而，MWCNT-PEI對成熟菌膜的最大生物量幾乎沒有影響.

圖3 MWCNT-PEI對銅綠假單胞菌菌膜生長的影響.（a）菌膜的CV染色圖；（b）將細(xì)菌分別與不同質(zhì)量濃度的MWCNT-PEI（0，5，10和20 μg·mL-1）作用48 h的菌膜生長曲線

2.4 MWCNT-PEI對成熟菌膜結(jié)構(gòu)的影響

為了深入分析成熟菌膜的結(jié)構(gòu)，用SYTO9和Alexa Fluor?594與刀豆蛋白A的偶聯(lián)物分別標(biāo)記菌膜中的細(xì)菌和EPS，使用CLSM進(jìn)行熒光成像和定量分析.如圖4（a）所示，與對照組相比，MWCNT-PEI的加入導(dǎo)致成熟菌膜中綠色熒光的強(qiáng)度減弱，紅色熒光增強(qiáng)，這說明MWCNT-PEI會導(dǎo)致成熟菌膜中的細(xì)菌數(shù)目減少，EPS分泌量提高.細(xì)菌抵御抗菌劑時，會啟動應(yīng)激保護(hù)機(jī)制，即分泌大量EPS包裹自身，阻擋或隔絕抗菌劑的直接作用.圖4（b）為熒光圖量化數(shù)據(jù)，與對照組相比，MWCNT-PEI顯著降低了菌膜厚度，這與材料具有抗菌性相關(guān).而質(zhì)量濃度為10 μg·mL-1的MWCNT-PEI刺激細(xì)菌分泌大量EPS，這說明亞致死量的抗菌劑誘發(fā)細(xì)菌啟動了應(yīng)激機(jī)制.盡管MWCNT-PEI對成熟菌膜的總生物量幾乎沒有影響，但是會影響菌膜的結(jié)構(gòu)組成（細(xì)菌數(shù)目降低，EPS分泌增加），這對于菌膜處理工廠的污水有著非常重要的應(yīng)用價值.

圖4 菌膜熒光染色圖像.（a）銅綠假單胞菌菌膜的3D-CLSM圖；（b）不同質(zhì)量濃度下（0，5，10和20 μg·mL-1）菌膜中的細(xì)菌、EPS生物量的高度分布圖

3 結(jié)論

綜上所述，本工作探究了環(huán)境變化（碳納米材料的釋放）對細(xì)菌及菌膜的影響.利用羧基化和共價接枝方法制備了一種具有良好水分散性和穩(wěn)定性的MWCNT-PEI，這種碳納米材料具有優(yōu)異的抗菌性，質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1時，在1 h內(nèi)幾乎可以殺死所有的銅綠假單胞菌.同時，MWCNT-PEI會影響菌膜生長，導(dǎo)致菌膜成熟期提前，以及成熟菌膜結(jié)構(gòu)和組分發(fā)生改變（細(xì)菌數(shù)目降低，EPS分泌提高）；高濃度MWCNT-PEI會誘發(fā)菌膜的分散期提前.這些結(jié)果說明釋放于環(huán)境中的碳納米材料會對生態(tài)環(huán)境造成壓力，破壞環(huán)境微生物的生存和穩(wěn)態(tài).因此，未來大規(guī)模投產(chǎn)和應(yīng)用納米材料前，除了分析其潛在的生物毒性，還需要系統(tǒng)評估其產(chǎn)生的環(huán)境風(fēng)險.