余婷婷，王 敏，文 穎，楊海峰

（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

0 引言

堿性磷酸酶（ALP）是一類可催化磷酸單酯水解為無機磷酸鹽的酶，可以特異性識別多種底物分子［1-3］.ALP幾乎存在于所有生物體，在骨骼、肝、腎、腸和胎盤［2，4］等各種組織中都可以發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)磷酸化相關(guān)的生化行為，并且ALP是常規(guī)臨床測試中最常檢測的酶之一［1］.研究證明ALP與乳腺癌、前列腺癌、肝功能不全、骨病和糖尿病等許多疾病密切相關(guān)，因此ALP可以作為診斷此類疾病的重要生物標(biāo)志物［5-6］.開發(fā)簡單且靈敏的方法來分析檢測ALP的活性至關(guān)重要.

近年來，已開發(fā)出多種方法來測定ALP的活性，包括熒光法［7］、電化學(xué)方法［8］、比色法［9］和表面增強共振拉曼散射法（SERRS）［10］等.例如，WANG等［11］開發(fā)了基于聚陽離子誘導(dǎo)的非共價苝探針自組裝的ALP活性測定的無標(biāo)記熒光開啟策略.ZHU等［12］設(shè)計了一種無標(biāo)記發(fā)夾型熒光生物傳感器，通過氧化石墨烯設(shè)計傳感器來檢測ALP活性.盡管上述檢測方法具有其自身的優(yōu)勢，但仍需要精密的光學(xué)儀器，這限制了它們在實際ALP活性測定中的應(yīng)用.相比于光學(xué)方法，電化學(xué)方法具有響應(yīng)速度快、靈敏度好、成本低，以及可微型化的顯著優(yōu)勢，并已被用于ALP活性的檢測［13］.例如，SERRA等［14］通過使用電流型石墨-特氟隆復(fù)合酪氨酸酶生物傳感器實現(xiàn)了ALP的快速監(jiān)測.然而，這種電化學(xué)方法需要固定化電極表面上的DNA探針或去磷酸化底物，以及其他用于構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器的繁瑣過程.因此，迫切需要開發(fā)更簡單、更快速的無固定化電化學(xué)方法來測定ALP活性.

貴金屬（特別是金）因為其獨特的光、電、催化等方面的優(yōu)勢，使貴金屬納米材料成為眾多領(lǐng)域的研究熱潮.金納米顆粒的低電阻率和化學(xué)惰性以及特殊的表面等離子共振（SPR）效應(yīng)讓一維的納米結(jié)構(gòu)備受研究者關(guān)注.近幾年，金納米線（AuNWs）在合成方法上的發(fā)展取得了重大突破，如經(jīng)常使用的模板法和濕化學(xué)方法.在模板法里又可以分類為硬模板法和軟模板法，例如有以DNA為模板［15］，還有以多孔陽極氧化鋁和介孔二氧化硅（SiO2）為模板［16］.雖然模板法的優(yōu)勢是操作簡單、產(chǎn)率高和低成本，但是制備的產(chǎn)物AuNWs如何與模板成功分離一直未得到很好的解決.在濕化學(xué)方法中有種子調(diào)控生長法［17］和有機溶劑合成法［18］.其中，種子調(diào)控法分為種子制備和生長溶液制備兩個過程，該方法被廣泛應(yīng)用于金納米棒的制備.

本文作者設(shè)計了一種無標(biāo)記的電化學(xué)傳感器間接檢測ALP，在金納米線/氧化銦錫（AuNWs/ITO）導(dǎo)電玻璃電極上組裝上銅離子（Cu2+），利用焦磷酸根陰離子（P2O74-，PPi）可以競爭性結(jié)合Cu2+，使其電化學(xué)信號降為穩(wěn)定值，由于PPi是ALP的底物，加入ALP后，PPi水解，Cu2+被釋放出來，使電極表面Cu2+信號上升，通過Cu2+的信號可間接定量ALP的活性.構(gòu)建的Cu2+-AuNWs/ITO傳感器可以用來選擇性定量檢測ALP活性.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

CHI660C電化學(xué)工作站（中國上海晨華儀器有限公司）；電化學(xué)檢測是標(biāo)準(zhǔn)的三電極系統(tǒng)：AuNWs/ITO作為工作電極，鉑（Pt）絲作為惰性輔助電極，飽和甘汞電極（SCE）作為參比電極；采用CHI660D在物質(zhì)的量濃度均為5.0 mmol·L-1的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀（K3［Fe（CN）6］/K4［Fe（CN）6］），包含0.1 μmol·L-1氯化鉀（KCl）的電解質(zhì)溶液中記錄不同電極的阻抗譜圖.場發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM，Hitachi S-4800）；能譜能量色散型X射線熒光光譜儀（EDX，JSM-6700F）；X射線衍射儀（XRD，D/Max-2000 VPC）.

1.2 實驗試劑

四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O）、三水檸檬酸三鈉、硫酸（H2SO4）、雙氧水（H2O2）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、4-巰基苯甲酸（4-MBA，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和抗壞血酸（AA）均為分析純，購于Sigma-Aldrich公司.丙酮、異丙醇和乙醇均為分析純，購于Adamas公司.磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、硝酸銅、焦磷酸鈉、硫酸鎂、氯化鉀和氯化鈣均為分析純，購于Shanghai Richjoint Chemical Reagents公司.三磷酸腺苷（ATP）、ALP、血紅蛋白、牛血清蛋白和葡萄糖氧化酶均購于麥克萊恩生物技術(shù)公司.所有化學(xué)品都直接使用，沒有任何進一步純化.整個實驗所用溶液均用去離子水（電阻率為18.25 MΩ·cm）制備.

1.3 修飾電極的制備

1.3.1 金納米溶膠的制備

將裝有100 mL去離子水的錐形瓶置于磁力攪拌器上，然后量取0.1 mol·L-1HAuCl4于瓶中，加熱至微沸狀態(tài)，最后滴加2.0 mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的檸檬酸三鈉.幾分鐘后觀察到AuNPs的形成，溶液從淡黃色變?yōu)闊o色，再變成紅色［19］.

1.3.2 AuNWs/ITO電極的制備

依次使用丙酮、異丙醇和去離子水對ITO玻璃超聲10 min，再在80℃下烘干1 h.將ITO玻璃切成面積為1 cm×1 cm的小板.然后，將上述ITO板先用食人魚溶液（體積比為V（H2SO4）∶V（H2O2）=7∶3）處理30 min，以形成帶有羥基的親水表面.將處理過的ITO板浸入3-氨基丙基三乙氧基硅烷/乙醇（APTES/EtOH）溶液（體積比為V（APTES）∶V（EtOH）=5∶100）中2 h，以進行氨基的改性，用乙醇和水清洗ITO玻璃3遍及以上，以去除過量的APTES.將氨基改性的ITO板在含有金種子的溶液中浸泡1 h，用水洗滌以除去過量的金種子.最后，將組裝金種子的ITO放入乙醇/水溶液（體積比為V（EtOH）∶V（H2O）=3∶1），包含1.6 mol·L-1HAuCl4和0.01 mol/L 4-MBA溶液中，并加入0.1 mol·L-1AA溶液作為還原劑，以制備AuNWs.用乙醇沖洗最終產(chǎn)物，即獲得AuNWs/ITO，并用氮氣（N2）吹干.

1.3.3 制備Cu2+-AuNWs/ITO電極

將制備好的AuNWs/ITO電極放入一定濃度的Cu2+溶液進行自組裝1 h，然后用蒸餾水洗去結(jié)合不牢固的Cu2+，重復(fù)操作3次，并在N2吹干后置于室溫保存.

1.4 ALP電化學(xué)檢測機理

利用Pt絲電極、飽和甘汞電極、Cu2+-AuNWs/ITO電極作三電極系統(tǒng)完成ALP（30～60 units·mg-1）的電化學(xué)檢測.首先，將Cu2+-AuNWs/ITO電極置于一定濃度的PPi溶液中，此時Cu2+電化學(xué)信號會下降到穩(wěn)定；再向PPi溶液中加入分裝好的不同濃度的ALP時，由于ALP水解其底物PPi，并釋放出Cu2+，此時電化學(xué)信號又上升；最后，根據(jù)Cu2+的信號來間接檢測ALP的活性，如圖1所示.

圖1 Cu2+-AuNWs/ITO復(fù)合傳感器的檢測原理示意圖

2 結(jié)果與討論

2.1 Cu2+-AuNWs/ITO電極的形貌表征

組裝在AuNWs/ITO電極后仍能看到AuNWs均勻分布在電極表面，圖2是制備的Cu2+-AuNWs/ITO電極的SEM圖，可以看出當(dāng)Cu2+的組裝不影響AuNWs的形貌，組裝原理是Cu2+可以跟AuNWs/ITO電極上的4-MBA螯合.從圖2（d）～2（f）中可以看出Au、硫（S）和Cu元素均勻分布在電極表面，但Cu2+含量較少，原子含量低于0.1%.

圖2 Cu2+-AuNWs/ITO的形貌和元素含量表征.

2.2 不同修飾電極的電化學(xué)表征

為了驗證傳感器成功組裝上Cu2+，分別獲得了裸ITO，AuNWs/ITO和Cu2+-AuNWs/ITO在0.1 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷鹽鹽酸（Tris-HCl）（pH=6.0）中的循環(huán)伏安圖，掃描速率為50 mV·s-1，如圖3所示.裸ITO和AuNWs/ITO電極在Tris-HCl中無顯著的氧化還原峰，而Cu2+-AuNWs/ITO電極可以觀察到在0.3 V左右的氧化峰和0.1 V左右的還原峰，這是因為Cu2+在電極表面發(fā)生了氧化還原，證明Cu2+組裝成功.

圖3 裸ITO，AuNWs/ITO和Cu2+-AuNWs/ITO在0.1 mol·L-1 Tris-HCl（pH=6.0）中的循環(huán)伏安圖（掃描速率為50 mV·s-1）

2.3 實驗條件的優(yōu)化

為了提高Cu2+-AuNWs/ITO傳感的檢測選擇性和靈敏度，對AuNWs的生長時間、Cu2+的物質(zhì)的量濃度、PPi的物質(zhì)的量濃度、Cu2+與PPi的反應(yīng)時間和pH進行了優(yōu)化.

考察了該體系中AuNWs生長時間和不同Cu2+物質(zhì)的量濃度（10，75，250，500和750 μmol·L-1）的影響，如圖4（a）所示.結(jié)果表明：在生長時間為70 min時，制備的Cu2+-AuNWs/ITO電極在Tris溶液中響應(yīng)最好，所以選擇70 min作為最優(yōu)時間.當(dāng)組裝時Cu2+濃度增加，電極電流響應(yīng)逐漸變大，但當(dāng)增加到一定程度時保持不變，這是因為AuNWs/ITO電極上修飾的4-MBA達到飽和，所以其可以與一定濃度Cu2+螯合.最終選擇組裝Cu2+的物質(zhì)的量濃度為500 μmol·L-1，如圖4（b）所示.

圖4（c）和（d）顯示了在不同物質(zhì)的量濃度（0，1，5，10，25和50 μmol·L-1）PPi溶液中制備的Cu2+-AuNWs/ITO電極的電化學(xué)響應(yīng).從圖4（c）的微分脈沖伏安法（DPV）圖可以清晰地看出隨著PPi物質(zhì)的量濃度的變化，峰值也隨之變化.而圖4（d）中可以觀察到隨著PPi溶液物質(zhì)的量濃度的增加，Cu2+的電化學(xué)響應(yīng)逐漸減小，這是因為PPi可以競爭性結(jié)合Cu2+導(dǎo)致電化學(xué)信號下降，考慮到后續(xù)實驗，選用最優(yōu)條件為50 μmol·L-1.

進一步考察了Cu2+與PPi溶液孵育時間，結(jié)果顯示時間在0～20 min內(nèi)信號一直處于下降趨勢，到30 min以后基本保持不變，證明Cu2+-AuNWs/ITO電極上的Cu2+被PPi競爭下來需要一定時間，如圖4（e）所示.最后選擇30 min為最佳孵育時間.考察了制備的Cu2+-AuNWs/ITO電極在pH為4.0～8.0區(qū)間內(nèi)的峰值電流變化，如圖4（f）所示.隨著pH逐漸增加，Cu2+峰電流先增加后下降.因此，選擇6.0選為最優(yōu)pH.加入一定濃度ALP水解PPi后，隨著孵育時間的延長峰電流也增加，說明ALP水解程度也在增加，40 min達到最大值.

圖4 氧化電流隨制備Cu2+-AuNWs/ITO的條件變化圖.（a）不同AuNWs生長時間和（b）不同物質(zhì)的量濃度（10，75，250，500和750 μmol·L-1）Cu2+的電化學(xué)響應(yīng)；（c），（d）不同物質(zhì)的量濃度（0，1，5，10，25和50 μmol·L-1）PPi溶液的電化學(xué)響應(yīng)；（e）不同的Cu2+和PPi孵育時間制備的傳感器的性能；（f）不同pH值下Cu2+-AuNWs/ITO的峰電流值響應(yīng)圖

2.4 對ALP活性的線性考察

在最佳檢測條件下，通過DPV研究了Cu2+-AuNWs/ITO電極對ALP活性檢測的分析性能.如圖5（a）所示，當(dāng)逐漸增大ALP的單位濃度，DPV電流響應(yīng)值逐漸增大.圖5（b）為相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)線性圖，可以看出基于Cu2+-AuNWs/ITO的傳感器，在ALP單位濃度為60～180 U·L-1范圍內(nèi)線性響應(yīng)良好，線性回歸方程可以表示為：I=0.37CALP（其中，I表示不同ALP的單位濃度下的電流密度，單位為μA；CALP表示ALP的單位濃度，單位為U·L-1；相關(guān)系數(shù)R2=0.998），檢測限為12.75 U·L-1.與其他文獻中利用熒光法［20］測定的線性范圍（1～50 U·L-1）相比，該傳感器線性范圍更寬，說明基于Cu2+-AuNWs/ITO的ALP傳感器具有優(yōu)異的性能.

圖5 Cu2+-AuNWs/ITO電極對ALP活性檢測的分析性能圖.（a）Cu2+-AuNWs/ITO電極在不同單位濃度的ALP的DPV響應(yīng)圖（從黑色到綠色的曲線分別為0，60，80，100，120，140，160，180和200 U·L-1）；（b）DPV峰值電流與ALP單位濃度的校準(zhǔn)曲線圖（I0表示空白對照的電流密度）

2.5 傳感器的抗干擾性考察

由于在實際樣品的檢測過程中常存在其他活性物質(zhì)的干擾，因此需要對制備的傳感器進行抗干擾能力的實驗.在0.1 mol·L-1Tris-HCl溶液中分別加入50 μmol·L-1PPi，以及物質(zhì)的量濃度均為500 μmol·L-1的磷酸一氫根（H2PO4

-）、磷酸二氫根（HPO4

2-）和磷酸根（PO43-），電化學(xué)響應(yīng)圖如圖6（a）所示.可以看出，H2PO4-，HPO42-和PO43-的存在不會明顯競爭Cu2+，所以同類磷酸鹽干擾較小，其原因可能是Cu2+可以與焦磷酸根離子形成螯合物且結(jié)合常數(shù)大（結(jié)合常數(shù)為12.45）.在特定底物為PPi的條件下，不同類的干擾物質(zhì)的影響如圖6（b）所示，干擾物分別為葡萄糖氧化酶（GOx，500 U·L-1）、血紅蛋白（Hb，1 μmol·L-1）、牛血清蛋白（BSA，1 μmol·L-1）、ATP（1 μmol·L-1）、鎂離子（Mg2+，0.1 mmol·L-1）、鈣離子（Ca2+，0.1 mmol·L-1）和鉀離子（K+，0.1 mmol·L-1），結(jié)果顯示干擾物的信號遠低于ALP（200 U·L-1），證明ALP對PPi的催化作用是有專一性的.

圖6 抗干擾實驗圖（.a）PPi和磷酸鹽相關(guān)陰離子（H2PO4-，HPO42-和PO43-）在Cu2+-AuNWs/ITO上的電化學(xué)響應(yīng)；（b）其他干擾物（GOx，Hb，BSA，ATP，Mg2+，Ca2+和K+）的影響

2.6 實際樣品的分析檢測

為了考察基于Cu2+-AuNWs/ITO的傳感器在血清樣檢測中的可靠性，通過測定加標(biāo)回收率對稀釋后血樣中的ALP活性進行檢測，回收率在100.9%～101.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.3%～4.8%.結(jié)果表明制備的傳感器可成功分析樣品中ALP活性.

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了一種基于Cu2+-AuNWs/ITO的傳感器用于間接無標(biāo)記定量測定ALP.利用PPi競爭性結(jié)合Cu2+使其電化學(xué)信號降為穩(wěn)定值，通過ALP對底物PPi的水解釋放Cu2+恢復(fù)電化學(xué)信號，既利用了酶的專一性又實現(xiàn)了無標(biāo)記檢測酶的活性.制備的Cu2+-AuNWs/ITO無標(biāo)記傳感器抗干擾性良好，對ALP活性檢測范圍為60～180 U·L-1，可用于實際血清樣品中ALP加標(biāo)檢測，并能獲得較好的回收率.