彭 程，王 豐，楊海峰

（上海師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，上海 200234）

0 引言

過(guò)氧化氫（H2O2）是一種活性氧（ROS）物種，參與體內(nèi)重要的生理變化過(guò)程［1］，其生理水平過(guò)高與炎癥［2］、白癜風(fēng)［3］等疾病相關(guān).體內(nèi)H2O2原位直接檢測(cè)有望實(shí)現(xiàn)相關(guān)疾病的早期診斷.但由于H2O2的反應(yīng)性高和半衰期短［4-5］，發(fā)展高靈敏、無(wú)損（微創(chuàng)）的原位檢測(cè)技術(shù)仍面臨巨大挑戰(zhàn).迄今為止，對(duì)于H2O2的檢測(cè)包括分光光度法［6-7］、熒光法［8-9］、比色法［10］和電化學(xué)方法［11-12］，這些方法在體內(nèi)的原位檢測(cè)過(guò)程中，仍存在掩蔽劑的殘留和需要破壞生物組織結(jié)構(gòu)的問(wèn)題.同時(shí)H2O2衰減速度過(guò)快，導(dǎo)致這些方法的原位檢測(cè)仍然存在困難.

基于金納米粒子（Au NPs）和銀納米粒子的表面增強(qiáng)拉曼（SERS）技術(shù)因具有靈敏度高、可實(shí)時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，已在生物傳感器中獲得應(yīng)用［13］.但是在SERS的檢測(cè)過(guò)程中，納米粒子在生物組織中的不穩(wěn)定聚集會(huì)引起信號(hào)的差異，而納米粒子的殘留問(wèn)題仍難以解決［14］.同時(shí)，在生物組織深度信息檢測(cè)中，SERS還存在檢測(cè)深度不足的問(wèn)題［15］.

微針（MNs）是一種微創(chuàng)技術(shù)，最初的目的是用于透皮給藥.本研究利用了高機(jī)械強(qiáng)度和高透光率的聚甲基丙烯酸甲酯微針（PMMA-MNs），其高機(jī)械強(qiáng)度能夠穿透皮膚屏障；同時(shí)，高透光率解決了SERS檢測(cè)深度不足的問(wèn)題，能夠進(jìn)行原位檢測(cè)［16］.這種將MNs技術(shù)與SERS結(jié)合的思路也解決了納米粒子的殘留與信號(hào)不均勻的問(wèn)題.在PMMA-MNs上修飾聚多巴胺（PDA）層，利用PDA的黏附性，能夠在PMMA-MNs上修飾納米粒子，同時(shí)其與離心技術(shù)的結(jié)合大大縮短了納米金@聚多巴胺@微針（Au@PDA@MNs）基底的構(gòu)建時(shí)間.隨后，4-巰基苯硼酸（4-MPBA）被成功修飾在Au@PDA@MNs基底上，在H2O2的環(huán)境下，4-MPBA失去硼酸基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥基苯硫酚（4-HTP）［17］，從而引起SERS信號(hào)的變化，如圖1所示.1 000 cm-1和1 068 cm-1處拉曼信號(hào)強(qiáng)度比值（I1000/I1068）被用來(lái)檢測(cè)H2O2的濃度［18］.最后，以離體豬皮為檢測(cè)對(duì)象，通過(guò)加標(biāo)的方式成功在豬皮內(nèi)檢測(cè)出H2O2的濃度.這種原位檢測(cè)策略為臨床疾病的早期診斷提供了新平臺(tái)，同時(shí)也為SERS光譜在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用提供了新思路.

圖1 H2O2敏感探針檢測(cè)H2O2的示意圖.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

四水氯金酸（HAuCl4·4H2O）、檸檬酸三鈉（Na3Cit）、鹽酸多巴胺（DA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris·HCl）、30%H2O2、4-MBPA、4-HTP均購(gòu)于阿拉?。ㄉ虾＃┯邢薰?；葡萄糖、羅丹明6G（R6G）、唾液酸、次氯酸鈉（NaClO）、2，2-偶氮二（2-甲基丙脒）二鹽酸鹽（AAPH）均購(gòu)于麥克林生物科技.光可交聯(lián)的甲基丙烯酸甲酯（MMA）由Esun（中國(guó)深圳）公司提供.所有藥品均為分析純，實(shí)驗(yàn)過(guò)程所需水都是使用的超純水.

1.2 主要儀器

S-4800型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（FE-SEM），上海日立公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-7504PC），上海欣茂儀器有限公司；離心機(jī)（H1650），湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Thermo DXR2xi，U.S.A.，激發(fā)光波長(zhǎng)633 nm，激光功率為4.0 mW，曝光時(shí)間為0.05 s，掃描次數(shù)為500次.

1.3 PMMA-MNs的制備

將MMA溶液倒入聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具中，真空脫氣，紫外光照射1.5 min后，將聚甲基丙烯酸甲酯-微針（PMMA-MNs）從PDMS模具中分離出來(lái).陣列中的每個(gè)MNs高度為450 μm，底部直徑為250 μm.

1.4 Au NPs的制備

Au NPs的制備參考LEE等［19］的方法：1 mL 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的HAuCl4·4H2O加入到100 mL超純水中，攪拌煮沸后加入1.5 mL 1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的Na3Cit.攪拌煮沸30 min后停止加熱，攪拌冷卻至室溫，最后4℃冷藏待用.

1.5 H2O2敏感探針的構(gòu)建

將PMMA-MNs用乙醇洗去未反應(yīng)的單體，0.02 g的多巴胺溶解在10 mL的Tris-HCl溶液中，隨后將洗凈后的PMMA-MNs浸泡在多巴胺溶液中，2 h后取出沖洗干凈備用.在包覆PDA的PMMA-MNs中加入1 mL的Au NPs，控制離心轉(zhuǎn)速4 000 r·min-1，離心時(shí)間5 min，最后將制備好的Au@PDA@MNs洗凈備用.

稱(chēng)取0.05 g的4-MPBA和0.05 g的4-HTP分別溶解在10 mL的乙醇溶液中備用，隨后取1 mL上述溶液加入到Au@PDA@MNs基底中，反應(yīng)30 min后取出用超純水洗凈備用.

1.6 離體豬皮內(nèi)的H2O2的檢測(cè)

取一塊1 cm×1 cm的離體豬皮樣品，將其浸入100 μmol·L-1的H2O2溶液中，30 min后取出，用超純水將表面的H2O2洗凈，干燥后備用.隨后將制備好的H2O2敏感探針插入豬皮中，讓其反應(yīng)5 min后獲得SERS光譜.原始SERS光譜被導(dǎo)入LabSpec5軟件，并使用Savitzky-Golay卷積算法進(jìn)行平滑.

2 結(jié)果與討論

2.1 Au@PDA@MNs的構(gòu)建和表征

合成的Au NPs的紫外吸收光譜如圖2（a）所示，在522 nm處表現(xiàn)強(qiáng)的吸收峰，表明合成的Au NPs的粒徑大約為40 nm［20］.Au@PDA@MNs的FE-SEM放大圖也證實(shí)了Au NPs的粒徑大小，如圖2（b）所示.利用PDA的黏附性和控制離心轉(zhuǎn)數(shù)、時(shí)間可以在MNs表面成功修飾Au NPs，并且可以避免Au NPs的團(tuán)聚，原因可能是這種離心力克服了Au NPs、PDA以及納米粒子之間的靜電斥力；同時(shí)，Au NPs和PDA的黏附力克服了Au NPs的重力.圖2（c）的能譜分析（EDS）圖也證實(shí)了Au@PDA@MNs的成功制備.隨后，以R6G為拉曼信號(hào)分子，研究了Au@PDA@MNs的SERS增強(qiáng)效果，證實(shí)了Au@PDA@MNs的SERS增強(qiáng)效果，如圖2（d）所示.

圖2 Au@PDA@MNs的表征.（a）Au NPs的紫外吸收光譜圖（最大吸收峰在522 nm）；（b）Au@PDA@MNs的FE-SEM圖；（c）Au@PDA@MNs的EDS圖；（d）Au@PDA@MNs的拉曼光譜圖（10-5 mol·L-1的R6G作為拉曼信號(hào)分子）

2.2 Au@PDA@MNs的條件優(yōu)化

分別控制加入的Au NPs的量、離心的轉(zhuǎn)速和離心的時(shí)間，研究Au@PDA@MNs的SERS增強(qiáng)效果，3種條件優(yōu)化的拉曼光譜圖如圖3（a）～3（c）所示.當(dāng)Au NPs加入量為1 mL時(shí)，SERS信號(hào)最好，如圖3（d）所示.離心的時(shí)間為5 min時(shí)的SERS信號(hào)最佳，如圖3（e）所示.圖3（f）表明當(dāng)離心轉(zhuǎn)數(shù)為4 000 r·min-1時(shí)，SERS信號(hào)最佳.其原因可能是隨著加入Au NPs量過(guò)多、轉(zhuǎn)速過(guò)快或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)引起更多納米粒子的團(tuán)聚，納米粒子之間的距離過(guò)近，導(dǎo)致有效熱點(diǎn)數(shù)目降低；加入的Au NPs量過(guò)少、轉(zhuǎn)速過(guò)慢和離心時(shí)間過(guò)短，納米粒子間的距離變遠(yuǎn)，有效熱點(diǎn)數(shù)目不足［21］.結(jié)果表明：Au@PDA@MNs的制備過(guò)程中控制Au NPs加入量為1 mL、離心轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1、離心時(shí)間為5 min時(shí)的SERS信號(hào)最佳.

圖3 不同（a）Au NPs的加入量、（b）離心的時(shí)間和（c）離心的轉(zhuǎn)速的拉曼光譜圖（10-5 mol·L-1的R6G作為拉曼信號(hào)分子），以及不同（d）Au NPs的量、（e）離心時(shí)間和（f）離心轉(zhuǎn)速對(duì)1 510 cm-1處SERS的影響

2.3 Au@PDA@MNs的SERS性能考察

由于Au@PDA@MNs的SERS性能影響著檢測(cè)的靈敏度，因此考察優(yōu)化后的Au@PDA@MNs的SERS性能很有必要.如圖4所示，以不同物質(zhì)的量濃度的R6G作為拉曼信號(hào)分子，研究了Au@PDA@MNs的靈敏度，結(jié)果表明：Au@PDA@MNs在10-4～10-8mol·L-1的范圍內(nèi)有良好的線性響應(yīng)，其檢測(cè)限（LOD）為3.1×10-10mol·L-1.

圖4 Au@PDA@MNs在不同物質(zhì)（CR6G）的量濃度的R6G下的（a）拉曼光譜圖和（b）校準(zhǔn)曲線

2.4 H2O2敏感探針的構(gòu)建

通過(guò)將4-MPBA修飾在Au@PDA@MNs上，成功構(gòu)建了H2O2敏感探針.如圖1所示，其在997 cm-1和1 011 cm-1處的2個(gè)峰歸因于B—O的對(duì)稱(chēng)伸縮和B—O—H在硼酸上的變形振動(dòng)［18］.在1 068 cm-1和1 562 cm-1處的另外2個(gè)峰被指定為苯環(huán)上C—H的平面變形和苯環(huán)上C＝C的伸縮振動(dòng)［17］.隨后，將4-HTP也修飾在Au@PDA@MNs上，研究了4-MPBA與4-HTP的變化情況，其1 000 cm-1歸因于C—C和C—C—C的拉伸振動(dòng)［22］.在H2O2的環(huán)境下，4-MPBA會(huì)失去硼酸基團(tuán)，轉(zhuǎn)變?yōu)榱u基基團(tuán)，從而引起997，1 011和1 000 cm-1拉曼峰位和峰強(qiáng)的變化，因此，1 000 cm-1和1 068 cm-1處拉曼信號(hào)強(qiáng)度比（I1000/I1068）的變化可用于定量檢測(cè)H2O2的濃度.

2.5 H2O2敏感探針原位檢測(cè)

分別配制10，100，500，1 000和2 000 μmol·L-1的H2O2溶液，研究了H2O2敏感探針的檢測(cè)性能.如圖5所示，H2O2敏感探針的校準(zhǔn)曲線為y=0.000 06x+0.113，范圍在10～2 000 μmol·L-1內(nèi)有響應(yīng)，其LOD為0.93 μmol·L-1.隨后，分別研究了1 000 μmol·L-1的ClO-、NO、·OH、葡萄糖、葡萄糖酸和谷胱甘肽對(duì)H2O2敏感探針檢測(cè)的干擾.圖6表明這些物質(zhì)對(duì)H2O2檢測(cè)干擾較小，原因可能ClO-、NO、葡萄糖酸和谷胱甘肽具有還原性，無(wú)法與硼酸基團(tuán)發(fā)生反應(yīng).相比于H2O2，葡萄糖的氧化性較弱，正如文獻(xiàn)報(bào)道一樣［17］，氧化性較強(qiáng)的·OH干擾也較小.最后，以離體豬皮作為檢測(cè)對(duì)象，將H2O2敏感探針小心插入豬皮，反應(yīng)5 min后采取SERS數(shù)據(jù).如圖7所示，加標(biāo)后H2O2敏感探針的SERS比值為0.12，由校準(zhǔn)曲線可知，檢測(cè)的H2O2的物質(zhì)的量濃度為117 μmol·L-1，結(jié)果基本準(zhǔn)確，說(shuō)明H2O2敏感探針可以很好地用于H2O2的原位檢測(cè).不僅如此，通過(guò)修飾其他拉曼活性反應(yīng)物，這種MNs型SERS基底可以作為原位檢測(cè)平臺(tái)，用于其他生物標(biāo)志物和生理生化指標(biāo)的原位微創(chuàng)檢測(cè).

圖5 H2O2敏感探針檢測(cè)不同濃度的H2O2.

圖6 各種干擾物質(zhì)（1 000 μmol·L-1）對(duì)H2O2敏感探針的SERS響應(yīng)的（a）影響及（b）干擾程度

圖7 加標(biāo)100 μmol·L-1的H2O2溶液后（a）空白和加標(biāo)離體豬皮的拉曼光譜圖；（b）空白和加標(biāo)離體豬皮的I1 000/I1 068的值（***表示p＜0.001，有顯著差異）

3 結(jié)論

基于高透光率和高機(jī)械強(qiáng)度的PMMA-MNs，利用PDA的黏附性在MNs表面修飾Au NPs，成功構(gòu)建了Au@PDA@MNs SERS基底，離心技術(shù)的結(jié)合大大縮短了Au@PDA@MNs SERS基底的構(gòu)建時(shí)間.研究發(fā)現(xiàn)，在加入的Au NPs量為1 mL、離心轉(zhuǎn)速為4 000 r·min-1和離心時(shí)間為5 min時(shí)，SERS增強(qiáng)效果最佳.以R6G為拉曼信號(hào)分子，Au@PDA@MNs的檢測(cè)線性范圍為10-4～10-8mol·L-1，LOD為3.1×10-10mol·L-1.在Au@PDA@MNs基底上修飾4-MPBA后成功構(gòu)建了H2O2敏感探針，用I1000/I1068的SERS強(qiáng)度比值可定量檢測(cè)H2O2的物質(zhì)的量濃度.其線性范圍為10～2 000 μmol·L-1，LOD為0.9 μmol·L-1.最后，以離體豬皮作為檢測(cè)對(duì)象，加入100 μmol·L-1的H2O2溶液，通過(guò)將H2O2敏感探針插入豬皮中，反應(yīng)5 min后測(cè)定SERS光譜圖，其I1000/I1068的比值表明其物質(zhì)的量濃度為117 μmol·L-1，檢測(cè)結(jié)果與加標(biāo)濃度基本一致.這種將激光透明的MNs和SERS技術(shù)結(jié)合的思路，為將來(lái)體內(nèi)生理和病理變化的原位檢測(cè)提供新平臺(tái)，也為未來(lái)的臨床疾病的早期診斷提供新的思路.