陳 彤，王志龍，劉 麗

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

0 引 言

淡水湖泊水體富營養(yǎng)化引發(fā)的藍(lán)藻水華及有毒藍(lán)藻產(chǎn)生的藻毒素，對水體生態(tài)、人類和動物的健康構(gòu)成了重大風(fēng)險[1-2].藍(lán)藻毒素是產(chǎn)毒藍(lán)藻的次級代謝產(chǎn)物，種類繁多，包括肝毒素、神經(jīng)毒素和皮膚毒素，其中肝毒素和神經(jīng)毒素對人類的健康危害最為嚴(yán)重[3].具有肝毒性的環(huán)肽類微囊藻毒素是分布最為廣泛，研究最為深入的藍(lán)藻毒素，主要由微囊藻屬(Microcystis)、魚腥藻屬(Anabaena)、念珠藻屬(Nostoc)、浮絲藻屬(Planktothrix)、費氏藻屬(Fischerella)等藍(lán)藻產(chǎn)生.魚腥藻毒素和麻痹性貝類毒素是兩種與動物急性中毒有關(guān)的淡水神經(jīng)毒素[4].魚腥藻毒素由魚腥藻屬、束絲藻屬(Aphanizomenon)、擬柱孢藻屬(Cylindrospermopsis)等藻類產(chǎn)生，主要包括魚腥藻毒素-a、同型魚腥藻毒素-a和魚腥藻毒素-a(s)三種類型.麻痹性貝類毒素由亞歷山大藻屬(Alexandrium)、魚腥藻屬等藻類產(chǎn)生，具有超過50種類似物，主要包括石房蛤毒素、新石房蛤毒素等.

常用的檢測藻毒素的方法有高效液相色譜的化學(xué)法[5]和酶聯(lián)免疫測定的生化法[6]，主要用于檢測已釋放至環(huán)境中的藍(lán)藻毒素種類及濃度.而基于藍(lán)藻的分子生物學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，不同藍(lán)藻毒素的生物合成受到不同藻毒素合成酶基因簇的調(diào)控，如：mcy(microcystin synthesis gene)基因簇參與微囊藻毒素的合成[7]、ana(anatoxin synthesis gene)基因簇參與魚腥藻毒素的合成[8]，sxt(saxitoxin synthesis gene)基因簇參與麻痹性貝類毒素的合成[9].產(chǎn)毒藍(lán)藻細(xì)胞基因組中含有的藻毒素合成酶基因可對毒素的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)控，無毒藻株中則不含有藻毒素合成酶基因，這為特異性地研究產(chǎn)毒藍(lán)藻提供了重要的方法手段[10].同時，通過藍(lán)藻毒素合成酶相關(guān)基因簇的分子檢測[11]可用于鑒別有毒與無毒藻株，具有快速簡便、特異性及靈敏度高的特點，對預(yù)測預(yù)警有毒藻華的發(fā)生具有重要作用.Lee等[12]基于已知的mcyA基因引物設(shè)計的新型引物探針可準(zhǔn)確捕捉且量化湖泊環(huán)境中的mcyA基因，并區(qū)分該基因的系統(tǒng)發(fā)育起源.Liu等[13]基于PCR技術(shù)將Cy5標(biāo)記的dCTPs引入反應(yīng)體系中以進(jìn)行熒光修飾，并利用特異性ssDNA探針實現(xiàn)了準(zhǔn)確并迅速地在混合樣品中檢測到產(chǎn)毒微囊藻.John等[14]運用巢式PCR技術(shù)，對澳大利亞維多利亞州67個地點的地表水進(jìn)行anaC基因的檢測，并通過系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)藍(lán)藻anaC基因與Cuspidothrix、顫藻屬(Oscillatoria)、長孢藻屬(Dolichospermum)、魚腥藻屬和束絲藻屬同源性較高(90%～100%).Grachev等[15]對流入貝加爾湖的伊爾庫茨克水庫及安加拉河流域的石房蛤毒素的研究發(fā)現(xiàn)，該流域內(nèi)sxtA基因與束絲藻屬、魚腥藻屬和長孢藻屬同源性較高(99%～100%).

地處中國西南部云貴高原的撫仙湖，是中國第二深的湖泊，其淡水儲量占全國湖泊總儲量的9%，綜合水質(zhì)達(dá)到Ⅰ類，是最重要的一級飲用水源之一.緊鄰撫仙湖的星云湖，因其獨特的地理位置在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中起到重要作用，但因污染嚴(yán)重,其水質(zhì)為劣(Ⅴ類)[16]，并且自2000年起，星云湖中每年夏秋季節(jié)會爆發(fā)以微囊藻為主的大規(guī)模藍(lán)藻水華.在不同富營養(yǎng)化湖泊中藍(lán)藻種群、產(chǎn)毒藍(lán)藻種類均存在差異，并且藻毒素種類與產(chǎn)毒藍(lán)藻種類直接相關(guān).目前，對于兩個湖泊中產(chǎn)毒藍(lán)藻的種類及藻毒素基因的多樣性研究尚未見研究報道，因此，本研究基于常規(guī)PCR技術(shù)檢測不同富營養(yǎng)化湖泊中產(chǎn)毒藍(lán)藻藻毒素基因的多樣性，目的在于研究不同富營養(yǎng)化湖泊中產(chǎn)毒藍(lán)藻的多樣性，建立有毒藍(lán)藻水華預(yù)警方法，降低其危害，補充中國淡水湖泊在產(chǎn)毒藍(lán)藻及藻毒素方面的相關(guān)研究，保護(hù)湖泊水質(zhì)健康和生態(tài)安全.

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

分別于2019年豐水期(7月)、平水期 (10月)、2020年枯水期 (1月)的每月中旬在星云湖XY-1(102°48′21″E，24°23′6″N)、XY-2(102°46′43″E，24°22′43″N)、XY-3(102°45′55″E，24°21′17″N)、XY-4(102°45′28″E，24°18′42″N)、XY-5(102°47′57″E，24°18′58″N)、XY-6(102°48′11″E，24°20′37″N)這6個采樣點和撫仙湖FX-1(102°50′29″E，24°33′29″N)、FX-2(102°51′41″E，24°27′16″N)、FX-3(102°49′26″E，24°23′35″N)、FX-4(102°52′51″E，24°22′48″N)、FX-5(102°56′18″E，24°31′11″N)、FX-6(102°56′49″E，24°36′43″N)這6個采樣點分別采集 0.5 m 處表層水和 2 m 處底層水樣各 2 L，各采樣點位置如圖1所示.為全面探究湖泊中產(chǎn)毒藍(lán)藻藻毒素基因多樣性，將采集到的表層水與底層水混合均勻后經(jīng) 0.45 μm 和 0.22 μm 孔徑的纖維濾膜過濾以收集藻細(xì)胞，濾膜存于 -80 ℃ 以備后續(xù)實驗.

(a) 星云湖 (b) 撫仙湖圖1 星云湖和撫仙湖采樣點位置圖Fig.1 Location of sampling sites in Xingyun Lake and Fuxian Lake

使用活塞式底泥采樣器進(jìn)行各采樣點表層沉積物(0～20 cm)樣本采集，重復(fù)采集3次，混勻后迅速低溫避光保存，運送至實驗室后，置于 -80 ℃ 冰箱保存.

1.2 藻細(xì)胞基因組DNA提取及PCR擴增測定

將 0.45 μm 與 0.22 μm 濾膜四等分后，使用E.Z.N.A.R ? Water DNA Kit試劑盒(OMEGA)提取水體樣品藻類總DNA；將新鮮沉積物樣品稱取 0.25 g 分裝到 1.5 mL 無酶離心管中，使用DNeasy Power Soil Kit試劑盒(QIAGEN)提取沉積物中的基因組DNA.采用微囊藻毒素合成酶基因mcyA、魚腥藻毒素合成基因anaC.以及麻痹性貝類毒素合成酶基因sxtA,對提取的DNA進(jìn)行PCR檢測，引物序列以及退火溫度見表1.PCR反應(yīng)體系為Premix Taq(2×)(TaKaRa) 10.0 μL，正、反向引物各 1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 5.0 μL，模板DNA 3.0 μL，總體積 20 μL.反應(yīng)條件為 95 ℃ 預(yù)變性 5 min，95 ℃ 變性 30 s，退火 30 s，72 ℃ 延伸 60 s，40個循環(huán)，72 ℃ 延伸 7 min.使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳測定目的片段.

表1 藻毒素合成酶基因引物序列

1.3 膠回收、TA克隆及測定序列

使用TIANgel Purification Kit膠回收試劑盒(TIANGEN)純化擴增后的目的片段，采用pEASYR-T1 Cloning Kit(TransGen Biotech)將載體與目的片段連接并轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞中，于LB平板上隔夜培養(yǎng)后挑取單克隆菌落震蕩培養(yǎng)，并對菌液進(jìn)行PCR陽性重組子菌落鑒定，將陽性菌液送至昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測序.

1.4 系統(tǒng)進(jìn)化分析

將測序得到的序列經(jīng)NCBI BLAST比對后，使用Mega 6.0軟件中的ClastalW分別對得到的mcyA、anaC、sxtA基因序列以及各自的參考序列進(jìn)行比對，運用NJ法構(gòu)建mcyA、anaC、sxtA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳多樣性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增及克隆測序星云湖和撫仙湖藻毒素基因

從星云湖和撫仙湖水體及沉積物樣品中提取藻細(xì)胞DNA進(jìn)行普通PCR擴增.圖2為水體樣品中的各藻毒素基因的凝膠電泳，mcyA、anaC和sxtA基因分別在 200 bp、366 bp 和 200 bp 處有單一且明亮的條帶，與目的基因片段大小相符.兩個湖泊不同采樣點均能成功擴增出藻毒素合成酶基因，表明mcyA、anaC和sxtA基因廣泛存在于星云湖及撫仙湖水體中.對湖泊沉積物樣品的檢測發(fā)現(xiàn)，三種藻毒素基因在撫仙湖沉積物樣品中均未被檢出，在星云湖沉積物樣品中僅檢測到的mcyA基因(圖3).在撫仙湖和星云湖水體樣品中分別獲得mcyA、anaC和sxtA基因有效序列各18條，星云湖沉積物樣品中共獲得18條mcyA基因有效序列.

圖2 水體中各類藻毒素基因瓊脂糖凝膠電泳圖 Fig.2 Agarose gel electrophoresis of cyanobacteria toxin genes for water samples

圖3 沉積物樣品中mcyA基因瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of mcyA gene for sediment samples

2.2 星云湖和撫仙湖藻毒素基因多樣性分析

撫仙湖以FX為標(biāo)記，星云湖以XY為標(biāo)記，豐水期、平水期和枯水期的水體樣品以W07、W10和W01作為標(biāo)記，沉積物以S07、S10和S01作為標(biāo)記.

2.2.1 產(chǎn)微囊藻毒素mcyA基因多樣性分析

將獲得的樣品mcyA基因序列與代表性mcyA基因參考序列在核苷酸水平上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4).所有序列可劃分為2個進(jìn)化簇(Cluster Ⅰ和Cluster Ⅱ).包括微囊藻屬的mcyA基因參考序列(序列號為:MG573265.1、 AB110104.1、 KU867770.1、 KU867767.1 KU867672.1、 JF799859.1、 JF799858.1和AF139343.1),以及本研究所獲得的mcyA基因序列均聚集在Cluster Ⅰ.Cluster Ⅱ包括的mcyA基因參考序列有念珠藻屬(序列號為:AJ515475.1和JX644441.1)、魚腥藻屬(序列號為:AJ515463.1、AJ515466.1、GQ466581.1和GQ466582.1)、席藻屬(Phormidium)(序列號為:JQ771633.1和JQ771633.1)和浮絲藻屬(序列號為:AJ515474.1和AJ515468.1)，但不包含樣本序列.推測撫仙湖和星云湖水體及沉積物中mcyA基因多樣性較為單一，主要由微囊藻屬產(chǎn)毒藍(lán)藻產(chǎn)生，且在豐水期、平水期和枯水期三個時期普遍存在.

圖4 產(chǎn)毒藍(lán)藻mcyA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 The phylogenetic tree of mcyA gene in toxic cyanobacteria

2.2.2 產(chǎn)魚腥藻毒素anaC基因多樣性分析

將獲得的樣品anaC基因序列與代表性anaC基因參考序列在核苷酸水平上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5).所有序列可劃分為2個進(jìn)化簇(Cluster Ⅰ和Cluster Ⅱ)和4個亞簇(A、B、C和D).撫仙湖的水體樣本以及星云湖XY2水體樣本中的anaC基因序列與顫藻屬參考序列(序列號為:JF803654.1)聚集在Cluster Ⅰ的A亞簇中，星云湖其他采樣點水體樣本的anaC基因序列與束絲藻屬(序列號為:JF803655.1)以及未培養(yǎng)的藍(lán)藻屬(Unculturedcyanobacterium)參考序列(序列號為:KR813877.1、KR813879.1和KR813869.1)聚集在Cluster Ⅱ的D亞簇中.B亞簇和C亞簇分別包含顫藻屬(序列號為:F803651.1和JF803656.1)、席藻屬(序列號為:KX016041.1和KX016040.1)、束絲藻屬(序列號為:KP718897.1和KP718896.1.)和魚腥藻屬(序列號為:JF803657.1 、JF803646.1和JF803647.1)的anaC基因參考序列.推測撫仙湖中的anaC基因主要由顫藻屬藍(lán)藻產(chǎn)生，星云湖中的anaC基因則主要由束絲藻屬及顫藻屬產(chǎn)生，且在豐水期、平水期和枯水期三個時期普遍存在.

2.2.3 產(chǎn)麻痹性貝類毒素sxtA基因多樣性分析

將獲得的樣品sxtA基因序列與代表性sxtA基因參考序列在核苷酸水平上構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6).所有序列可劃分為4個進(jìn)化簇(Cluster Ⅰ-Ⅳ).撫仙湖和星云湖水樣中的sxtA基因序列與魚腥藻屬(序列號:EU629178.1和EU629176.1)、束絲藻屬(序列號:MH113429.1、HQ157715.1、HQ157716.1、MH113429.1和JN837673.1)、長孢藻屬(序列號:HQ157701.1和MH464587.1)的參考序列聚集在Cluster Ⅰ中，Cluster Ⅱ中包括擬柱胞藻屬的sxtA基因參考序列(序列號:EU629178.1和MN417330.1)，Cluster Ⅲ包括偽枝藻屬(Scytonema)(序列號:JQ182302.1)和Heteroscytonema(序列號:MG976919.1)的sxtA基因參考序列，Cluster Ⅳ包括鞘絲藻屬(Lyngbya)的sxtA基因參考序列(序列號:EU603711.1和EU629174.1).本研究的樣本序列未分布在Cluster Ⅱ-Ⅳ中，推測撫仙湖和星云湖中的sxtA基因主要由魚腥藻屬、束絲藻屬、長孢藻屬產(chǎn)生，且在豐水期、平水期和枯水期三個時期普遍存在.

圖6 產(chǎn)毒藍(lán)藻sxtA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 The phylogenetic tree of sxtA gene in toxic cyanobacteria

3 討 論

運用常規(guī)PCR技術(shù)以mcyA、anaC、sxtA藍(lán)藻毒素合成酶基因為靶基因，對兩個不同營養(yǎng)型湖泊水體和沉積物進(jìn)行產(chǎn)毒藍(lán)藻多樣性分析.結(jié)果表明，在貧營養(yǎng)的撫仙湖和富營養(yǎng)化的星云湖水體樣品中均可檢測到這三種藍(lán)藻毒素合成酶基因，僅在星云湖的沉積物樣品中檢測到產(chǎn)微囊藻毒素mcyA基因.撫仙湖水體中葉綠素含量低，藻類生物豐度低，且由于藍(lán)藻具有趨光性且可使用IV型菌毛直接向光源移動[17]，致使在貧營養(yǎng)化湖泊撫仙湖的沉積物中藍(lán)藻生物吸附及含量低，故在沉積物樣品中未檢測到藍(lán)藻毒素合成酶基因.富營養(yǎng)化湖泊中，水體表面水華可以阻止光線到達(dá)湖泊底層，從而影響底棲的初級生產(chǎn)者，并且在以微囊藻為優(yōu)勢藍(lán)藻的水體中，微囊藻會吸附到懸浮顆粒物上[18]并沉降至水體底部.富營養(yǎng)化的星云湖中常年爆發(fā)以微囊藻為優(yōu)勢藻種的藍(lán)藻水華[19]，微囊藻通過吸附等作用沉降于沉積物中，故在星云湖的沉積物樣品中檢測到了mcyA基因.通過構(gòu)建mcyA基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，兩個湖泊中的mcyA基因序列均與微囊藻屬的基因參考序列相似度較高.Li等[20]對太湖和陽澄湖中的微囊藻毒素mcyA基因的多樣性研究發(fā)現(xiàn)同一區(qū)域的兩個湖泊中mcyA基因序列較為相似且存在高度保守性.Bukowska等[21]對波蘭東北部的8個湖泊中mcyA基因多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，在該區(qū)域內(nèi)mcyA基因多樣性較為單一，這與本研究結(jié)果一致，因此推測在同一地區(qū)的湖泊內(nèi)，mcyA基因同源性較高.

目前對藻毒素的研究主要集中于微囊藻毒素，加強對其他藻毒素的研究是大勢所趨.魚腥藻毒素和麻痹性貝類毒素都屬于神經(jīng)毒素類，對人類的生產(chǎn)生活有較大的負(fù)面影響.截止2020年已經(jīng)確定了有41種藻類物種可產(chǎn)生魚腥藻毒素以及15種藻類物種可產(chǎn)生麻痹性貝類毒素[4].將兩個湖泊中獲得的魚腥藻毒素anaC基因序列與參考序列構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，撫仙湖anaC序列和星云湖XY2采樣點獲得的anaC序列與顫藻屬的基因參考序列相似度較高，而星云湖其他采樣點的anaC序列則與束絲藻屬的基因參考序列相似度較高.John等人[14]對澳大利亞維多利亞州地表水中檢測得到的23條anaC序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一區(qū)域內(nèi)不同水體樣本的anaC序列同源性具有一定差異，這與本研究結(jié)果一致.推測同一地區(qū)不同湖泊中anaC基因序列會存在差異是與湖泊本身的理化性質(zhì)、藍(lán)藻群落組成等因素相關(guān).sxtA基因編碼麻痹性貝類毒素生物合成的第一步驟，并且高度保守[22]，本研究中的sxtA基因與魚腥藻屬、束絲藻屬、長孢藻屬的sxtA基因序列同源性較高，表明在撫仙湖和星云湖中sxtA基因由上述藻屬的藍(lán)藻產(chǎn)生.本研究對于藻毒素合成酶基因的定性檢測發(fā)現(xiàn)，在星云湖和撫仙湖中均存在著不同的產(chǎn)毒藍(lán)藻藻種.劉玉珊等[23]對同處于云貴高原滇池中產(chǎn)毒藍(lán)藻產(chǎn)毒基因的多樣性研究表明在滇池海埂水域中藍(lán)藻產(chǎn)毒基因多樣性較為單一，mcyE基因主要由微囊藻屬藻類產(chǎn)生，anaC和sxtA基因主要由束絲藻屬藻類產(chǎn)生，這與本研究中對于星云湖樣品的研究結(jié)果類似，推測在云南省富營養(yǎng)化程度嚴(yán)重的湖泊中，藍(lán)藻毒素基因多樣性受到湖泊中優(yōu)勢藍(lán)藻的影響.在氮、磷元素含量豐富的富營養(yǎng)化水體中，藍(lán)藻以及產(chǎn)毒藍(lán)藻會過量繁殖并產(chǎn)生藻毒素，從而形成有毒藍(lán)藻水華，藍(lán)藻毒素合成酶基因豐度會受到湖泊內(nèi)產(chǎn)毒藍(lán)藻含量的影響.本研究組基于三種藻毒素基因的定量檢測結(jié)果表明，雖在貧營養(yǎng)化的撫仙湖和富營養(yǎng)化的星云湖水體中均檢測到mcyA、anaC、sxtA藍(lán)藻毒素合成酶基因，但其豐度在兩個湖泊中存在顯著差異，由于富營養(yǎng)化的星云湖中存在較高的藍(lán)藻生物量，各類藻毒素基因豐度顯著高于貧營養(yǎng)化的撫仙湖，并且在藍(lán)藻水華爆發(fā)的豐水期，星云湖中藻毒素基因豐度會達(dá)到峰值.

4 結(jié) 論

有毒藍(lán)藻水華嚴(yán)重威脅水生生態(tài)環(huán)境甚至影響人類健康，對于產(chǎn)毒藍(lán)藻藻毒素基因的分子檢測有利于預(yù)警有毒藍(lán)藻水華的發(fā)生，為建立準(zhǔn)確、快速、有效的預(yù)測有毒藍(lán)藻水華及產(chǎn)毒藻種的方法，需分析不同富營養(yǎng)型湖泊中產(chǎn)毒藍(lán)藻種類以及藻毒素類型.本研究發(fā)現(xiàn):

1) 同處于云南省玉溪市的撫仙湖和星云湖富營養(yǎng)化狀態(tài)具有顯著差異，僅在富營養(yǎng)化程度高的星云湖沉積物樣本中檢測到mcyA基因，而在兩個湖泊的水體樣本中均能檢測到mcyA、anaC、sxtA基因，但各類藻毒素合成酶基因豐度存在差異.

2) 不同湖泊中藻毒素合成酶基因分屬于不同的產(chǎn)毒藍(lán)藻，mcyA基因在兩個湖泊中的主要生產(chǎn)者是微囊藻屬，anaC基因在貧營養(yǎng)化的撫仙湖中主要由顫藻屬產(chǎn)生，在富營養(yǎng)化的星云湖中主要由束絲藻屬產(chǎn)生，sxtA基因主要由魚腥藻屬、束絲藻屬、長孢藻屬產(chǎn)生.

3) 貧營養(yǎng)化湖泊中同樣存在產(chǎn)毒藍(lán)藻并具有生產(chǎn)藻毒素的潛力.

本研究綜合分析了不同富營養(yǎng)化湖泊中存在的產(chǎn)毒藍(lán)藻及潛在的產(chǎn)毒能力，對建立快速檢測湖泊中產(chǎn)毒藍(lán)藻的方法及預(yù)警有毒藍(lán)藻水華的發(fā)生具有重要意義，在實際應(yīng)用中可通過結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等具體毒素含量測定方法來了解產(chǎn)毒藍(lán)藻產(chǎn)生藻毒素機理，分析產(chǎn)毒機制，為水生生態(tài)環(huán)境治理提供技術(shù)支撐.