馬志剛，孟雪斐，張鴻娟，單 斌△

1．昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，云南昆明 650032；2．云南省醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)臨床研究中心，云南昆明 650032；3．云南省檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650032；4．昭通市中醫(yī)醫(yī)院，云南昭通 657000

碳青霉烯類抗菌藥物具有對(duì)β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定、抗菌譜廣、殺菌活性強(qiáng)、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，被認(rèn)為是臨床上控制革蘭陽性菌、陰性菌及厭氧菌感染最有效的抗菌藥物。近年來，隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛使用及不合理使用，對(duì)碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的菌株不斷被檢出，其中耐碳青霉烯類腸桿菌目細(xì)菌(CRE)因增長速度快、導(dǎo)致的感染病死率高、敏感抗菌藥物極少被認(rèn)為是一個(gè)緊急的全球公共衛(wèi)生安全問題[1]。CRE在胃腸道定植是繼發(fā)CRE感染的高危因素，本研究通過對(duì)高危人群進(jìn)行CRE的主動(dòng)篩查，對(duì)主動(dòng)篩查CRE定植陽性的患者進(jìn)行臨床資料和耐藥情況分析，同時(shí)跟蹤其最終的感染情況，為預(yù)防CRE感染提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2021年1—11月昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(簡稱本院)3 116例中主動(dòng)篩查CRE定植陽性患者的直腸拭子和對(duì)應(yīng)患者感染標(biāo)本中分離出的CRE菌株73株。納入標(biāo)準(zhǔn)：入院48 h內(nèi)采集直腸拭子進(jìn)行CRE主動(dòng)篩查陽性患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)對(duì)于多次住院，僅統(tǒng)計(jì)第1次篩查陽性結(jié)果；(2)對(duì)于住院期間同一患者多次篩查有兩次及以上陽性結(jié)果時(shí)僅統(tǒng)計(jì)第1次篩查結(jié)果。根據(jù)美國疾病控制與預(yù)防中心(CDC)發(fā)布指南，患者入院48 h內(nèi)、第7天及之后每隔1周采集患者直腸拭子采用碳青霉烯紙片法進(jìn)行篩查，至患者出院或者死亡。CRE判斷標(biāo)準(zhǔn)：參考美國CDC對(duì)CRE的定義，對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南或多利培南任一種碳青霉烯類耐藥，以及針對(duì)天生或?qū)啺放嗄厦舾卸冉档偷木?如摩根菌屬、變形桿菌屬和普羅威登菌屬等)，則需根據(jù)對(duì)除亞胺培南以外的任何碳青霉烯類抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果判斷，去除同一個(gè)患者所進(jìn)行相似部位的重疊菌株。73株CRE分別來自73例不同感染情況的患者，73株CRE中有63株為耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌。根據(jù)文獻(xiàn)[2]中醫(yī)院感染診斷標(biāo)準(zhǔn)，將CRE主動(dòng)篩查陽性患者73例分為發(fā)生CRE腸道外感染者31例(病例組)和未發(fā)生CRE直腸外感染者42例(對(duì)照組)。63株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌中病例組30株、對(duì)照組33株。

1.2儀器與試劑 Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥物敏感性試驗(yàn)分析儀購買于法國生物梅里埃公司，細(xì)菌鑒定卡、AST GN13型抗菌藥物敏感性試驗(yàn)卡片均為法國生物梅里埃公司配套試劑，MH瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板購買于鄭州安圖生物工程股份有限公司，美羅培南、亞胺培南、厄他培南藥敏實(shí)驗(yàn)紙片均購自英國Oxoid公司，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間(MALDI-TOF)質(zhì)譜儀(德國布魯克公司)，CO2培養(yǎng)箱(美國賽默飛公司)，Genesy 96TPCR擴(kuò)增儀(西安天隆公司)，DYCP-31DN型電泳儀(北京六一公司)，iBright CL750凝膠成像分析儀(美國賽默飛公司)。

1.3質(zhì)量控制 藥物敏感性試驗(yàn)嚴(yán)格按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)要求實(shí)施質(zhì)量管理，各種技術(shù)操作按照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行，質(zhì)控菌種主要采用了大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、陰溝腸桿菌ATCC700323。

1.4方法

1.4.1CRE篩選方法 將直腸拭子標(biāo)本均勻密涂在麥康凱平板,在平板上依次粘貼10 μg美羅培南、亞胺培南及厄他培南藥敏實(shí)驗(yàn)紙片，經(jīng)35 ℃培養(yǎng)18～24 h，其中任意一個(gè)紙片抑菌環(huán)直徑≤18 mm初步判斷為CRE，再利用MALDI-TOF質(zhì)譜儀法對(duì)平板上的菌株進(jìn)行識(shí)別鑒定，最后利用Vitek 2 Compact儀器法對(duì)菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。用AST GN13型抗菌藥物敏感性試驗(yàn)卡片檢測(cè)菌株亞胺培南和厄他培南的最低抑菌濃度(MIC)，并用紙片擴(kuò)散法貼于MH平板上，對(duì)厄他培南耐藥細(xì)菌和美羅培南抑菌圈直徑進(jìn)行復(fù)核。藥物敏感性試驗(yàn)研究結(jié)果，按照文獻(xiàn)[3]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判讀。藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果包括了敏感 (S)、中介(I)和耐藥(R)，中介并未在結(jié)果中顯示。

1.4.2多位點(diǎn)序列分型(MLST)檢測(cè)方法 根據(jù)肺炎克雷伯菌MLST 數(shù)據(jù)庫(http://bigsdb.web.pasteur.fr/klebsiella/primer _used.html)提供的引物序列和反應(yīng)條件，采用PCR法擴(kuò)增7對(duì)管家基因(gapA、mdh、phoE、tonB、infB、pgi、rpoB)，將擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序結(jié)果與MLST數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，得出ST分型結(jié)果。

1.4.3臨床資料收集 根據(jù)患者住院編號(hào)從醫(yī)院病歷系統(tǒng)中查詢并記錄其性別、年齡、住院時(shí)間、合并的基礎(chǔ)疾病情況，留置胃管、留置尿管、機(jī)械通氣、中心靜脈導(dǎo)管，使用激素藥物、質(zhì)子泵抑制藥物、利尿劑、精神類藥物、抗真菌藥物情況，是否長期臥床、腹腔引流，是否合并腫瘤，臨床轉(zhuǎn)歸、住院次數(shù)，白細(xì)胞、血小板、清蛋白、血清肌酐水平，CRE培養(yǎng)及藥物敏感性試驗(yàn)報(bào)告，非CRE多重耐藥菌感染是否檢出等資料，按病例組和對(duì)照組進(jìn)行歸類匯總。

2 結(jié) 果

2.1主動(dòng)篩查CRE的結(jié)果 3 116例主動(dòng)篩查CRE定植患者檢出CRE 73株，檢測(cè)陽性率為2.34%，其中耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌63株(30株CRE定植后感染；33株僅有CRE腸道定植)，占86.30%；耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌定植后感染率為47.6%；耐碳青霉烯大腸埃希菌8株(1株CRE定植后感染；7株僅CRE腸道定植)，占10.96%；耐碳青霉烯陰溝腸桿菌2株僅CRE腸道定植，占2.74%。CRE腸道定植后共出現(xiàn)病例組31株，其中14株只發(fā)生下呼吸道感染，15株同時(shí)發(fā)生下呼吸道、血液或尿路感染，2株同時(shí)下呼吸道和顱內(nèi)感染；對(duì)照組42株，其中只有下呼吸道感染23株，下呼吸道合并1個(gè)或兩個(gè)部位感染16株，2株無感染，1株腹腔和血液感染；兩組的感染部位均以下呼吸道感染為主，其次為血液、尿路。

2.2兩組一般資料比較 73例患者中男54例、女19例，年齡4～96歲、中位年齡為75.0(57.5，88.0)歲。兩組中男性患者居多，病例組與對(duì)照組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。兩組患者科室分布情況：重癥監(jiān)護(hù)室(ICU)35例、老年呼吸二科14例、神經(jīng)外科二病區(qū)8例，其他科室16例。

2.3CRE耐藥情況 病例組和對(duì)照組耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌、耐碳青霉烯大腸埃希菌、耐碳青霉烯陰溝腸桿菌對(duì)多黏菌素和替加環(huán)素的敏感率均為100.0%；耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和CRE對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率比較見表2。病例組和對(duì)照組耐碳青霉烯肺炎克雷伯桿菌對(duì)阿米卡星的敏感率分別為23.3%、9.1%，對(duì)慶大霉素敏感率分別為20.0%、3.0%，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑敏感率分別為40.0%、18.0%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)照組耐碳青霉烯大腸埃希菌(僅7株，未在表2中列出)對(duì)阿米卡星、慶大霉素、復(fù)方磺胺甲噁唑敏感率分別為37.5%、12.5%、12.5%，病例組耐碳青霉烯大腸埃希菌僅1株；對(duì)照組耐碳青霉烯陰溝腸桿菌僅2株，且未發(fā)生感染。兩組耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和耐碳青霉烯大腸埃希菌對(duì)其余的頭孢菌素、β-內(nèi)酰胺類藥物、β-內(nèi)酰胺類酶抑制劑、喹諾酮類藥物、碳青霉烯類抗菌藥物幾乎100.0%耐藥。

2.4同源性分析 MLST結(jié)果顯示，病例組CRE定植后感染的30株耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌與定植感染患者的菌株配對(duì)分型，共分出ST11(23/30)和ST231(7/30)兩種型，且相對(duì)應(yīng)患者感染前后菌株的型別是同一型，說明兩者具有高度的同源性。

表1 兩組一般資料比較

2.5CRE感染危險(xiǎn)因素分析 在病例組與對(duì)照組中，留置胃管、中心靜脈導(dǎo)管、使用質(zhì)子泵抑制藥物、有多重耐藥菌感染史、長期臥床、住院次數(shù)的占比比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表2 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和CRE對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率比較[n(%)]

續(xù)表2 耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌和CRE對(duì)臨床常用抗菌藥物的耐藥率比較[n(%)]

表3 CRE感染的單因素分析

2.6CRE感染的多因素分析 以CRE定植陽性患者是否感染了CRE為因變量，將在CRE感染單因素分析中顯著差異的協(xié)變量帶入多因素Logistic回歸模型，結(jié)果顯示中心靜脈置管、使用質(zhì)子泵抑制劑、有多重耐藥菌感染史是CRE感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(均P<0.05)，見表4。

表4 CRE感染多因素分析

3 討 論

近些年來，CRE引起的感染形勢(shì)嚴(yán)峻，臨床治療中其感染持續(xù)增多，分離出菌株的標(biāo)本越來越多[4]。本研究中主動(dòng)篩查出的CRE腸道定植以耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌為主，其次分別為耐碳青霉烯大腸埃希菌、耐碳青霉烯陰溝腸桿菌，與文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道結(jié)果相符。病例組中細(xì)菌檢出情況同腸道定植情況都以耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌為主，標(biāo)本來源和感染部位以下呼吸道感染為主，其次為血液、尿路，與多中心研究結(jié)果一致[7]。對(duì)照組感染其他細(xì)菌的標(biāo)本來源和感染部位與文獻(xiàn)[8]報(bào)道相符。但本研究中耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌占比明顯高于耐碳青霉烯大腸埃希菌和耐碳青霉烯陰溝腸桿菌，可能與大部患者都有肺部感染有關(guān)，痰液中CRE檢出以耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌為主[9]。也有研究報(bào)道提示痰液中分離出高毒力肺炎克雷伯菌的占比明顯高于其他標(biāo)本類型，其感染者年齡絕大部分在60歲以上[10-11]。因此，此次研究對(duì)象中是否有抗耐藥高毒力肺炎克雷伯菌流行，有待進(jìn)一步研究。

病例組和對(duì)照組感染部位均以下呼吸道感染為主，男性患者占比明顯高于女性，男性是呼吸道感染易感人群，與文獻(xiàn)[12]報(bào)道一致；本研究中CRE主動(dòng)篩查陽性患者中位年齡為75歲，老年人明顯占多數(shù)。隨著人口老齡化壽命延長，老年人群體抵抗力差，基礎(chǔ)疾病多，更容易引起CRE定植與感染[13]。CRE主動(dòng)篩查陽性科室主要分布于ICU，陽性率明顯高于其他科室，這與國內(nèi)相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[14]。文獻(xiàn)[15]報(bào)道住院患者同時(shí)發(fā)生多部位感染情況，ICU 是高于非ICU，感染率為35.00%，ICU患者如果發(fā)生CRE定植或感染，其他部位感染的概率也將增大。針對(duì)CRE主動(dòng)篩查陽性率高的科室，易感人群應(yīng)嚴(yán)格遵循各種操作規(guī)范診療，減少或杜絕易導(dǎo)致CRE傳播的相關(guān)治療。

本研究結(jié)果顯示，CRE對(duì)臨床上的常見抗菌藥物呈高度耐藥，對(duì)復(fù)方磺胺甲噁唑、慶大霉素、阿米卡星的耐藥率稍低，與許多地區(qū)相關(guān)研究結(jié)果相似[16-17]。本研究中耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌對(duì)各種抗菌藥物的耐藥情況與73株CRE基本一致,對(duì)頭孢類藥物100.0%耐藥，可能與臨床長期、廣泛使用碳青霉烯類藥物有關(guān)。通過MLST分型結(jié)果可知定植與感染菌株具有高度同源性，主要以ST11型為主，占76.7%(23/30)，與有關(guān)研究報(bào)道的我國耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的主要流行ST型別相符[18]。本院患者耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌定植后發(fā)生的感染率為47.6%，在院內(nèi)感染監(jiān)測(cè)中需高度重視由耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌引起的感染，避免院內(nèi)發(fā)生集中流行情況。目前，CRE耐藥機(jī)制主要包括碳青霉烯酶的產(chǎn)生、外膜蛋白的缺失或改變、ESBLs酶或 AmpC酶的表達(dá)、主動(dòng)外排泵等，碳青霉烯酶的產(chǎn)生是CRE最主要的耐藥機(jī)制[19]。盡管73株CRE對(duì)多黏菌素、替加環(huán)素100.0%敏感，但是由于替加環(huán)素血藥濃度低，治療某些院內(nèi)獲得性肺部感染療效不確定，多黏菌素對(duì)腎臟和神經(jīng)具有毒性作用，單一用藥還會(huì)誘導(dǎo)耐藥細(xì)菌產(chǎn)生，這些問題的存在限制了它們的使用，聯(lián)合其他抗菌藥物使用可以降低不良反應(yīng)，降低耐藥產(chǎn)生[20]。

臨床治療中，抗菌藥物的廣泛使用甚至濫用造成了許多耐藥細(xì)菌和超級(jí)細(xì)菌不斷產(chǎn)生[21]。廣譜抗菌藥物的長期應(yīng)用易產(chǎn)生菌群失調(diào)，從而改變機(jī)體的正常菌群，并提高了CRE等耐藥菌株定植概率。CRE定植陽性作為CRE感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，在ICU中大約有50%的CRE定植患者在30 d內(nèi)發(fā)展為CRE感染，與非定植患者比較，其感染率提高了10.8倍，并且CRE定植者也是潛在播散者[22]。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道，第3代頭孢菌素或氨基糖苷類治療患者亦可能會(huì)導(dǎo)致CRE定植或感染[23]。因此，抗感染治療前進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥物敏感試驗(yàn)，正確合理使用抗菌藥物抗感染治療顯得尤為重要。中心靜脈導(dǎo)管、留置胃管等侵襲性操是感染CRE的危險(xiǎn)因素，其中中心靜脈導(dǎo)管為本院獨(dú)立危險(xiǎn)因素。侵襲性操作破壞了患者生理防護(hù)屏障，利于致病病原體的侵入，提高了CRE醫(yī)院傳播感染的風(fēng)險(xiǎn)性。盡管中心靜脈導(dǎo)管有好處，但它們也可能成為局部和全身血流感染的潛在入口，導(dǎo)致醫(yī)療系統(tǒng)的成本增加[24]。本研究中大部分CRE感染者有使用質(zhì)子泵抑制劑的情況。有研究報(bào)道，質(zhì)子泵抑制劑的使用具有導(dǎo)致胃腸道和肺部感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)，包括艱難梭菌引起的感染，以及社區(qū)和醫(yī)院性肺炎[25]。在CRE主動(dòng)篩查陽性患者病情允許的情況下，盡量減少或縮短有創(chuàng)和侵入性操作，合理使用質(zhì)子泵抑制劑可以有效降低CRE感染風(fēng)險(xiǎn)。

CRE定植后感染對(duì)臨床常用抗菌藥物產(chǎn)生了高度耐藥性，因此治療難度大。針對(duì)高危人群及時(shí)開展定植篩查，并積極實(shí)施綜合性的感染防控措施，對(duì)于各種容易導(dǎo)致感染的危險(xiǎn)因素，應(yīng)盡量減少和避免，通過合理規(guī)范應(yīng)用抗菌藥物，才能有效防止和遏制易感群體的CRE感染和傳播。