郭建峰，黃建成，陳宏斌

寧德市閩東醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建福安 355000

乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球重大公共衛(wèi)生問題之一，人體感染HBV后可引起慢性乙型肝炎、肝硬化到肝細(xì)胞癌等一系列復(fù)雜的疾病譜[1-2]。2015年，全球約有88.7萬人死于HBV感染相關(guān)疾病。我國一般人群HBV表面抗原(HBsAg)流行率為5%～6%，以此估算我國慢性HBV感染者約7 000萬例[3]。人類白細(xì)胞抗原(HLA)復(fù)合體位于第6號(hào)染色體的短臂，是已知的人體最復(fù)雜的基因系統(tǒng)，具有高度的多態(tài)性[4-5]。HLA復(fù)合體主要包含Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類基因。其中，Ⅱ類其因包括HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ基因簇[6-7]。HLA-Ⅱ類分子在抗原識(shí)別和免疫應(yīng)答等一系列過程中發(fā)揮了極其重要的作用，與許多感染相關(guān)疾病或腫瘤存在重要的關(guān)系，也與抗HBV感染有著密切的關(guān)系[8-9]。目前國內(nèi)外學(xué)者對(duì)HLA-DRB1和HLA-DQ基因多態(tài)性與慢性HBV感染的研究較多[10-11]，而對(duì)HLA-DPA1基因多態(tài)性與慢性HBV感染的研究較少。本研究以寧德地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，探討HLA-DPA1基因第二外顯子多態(tài)性與慢性乙型肝炎風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，以期為慢性HBV感染的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 2017年1月至2020年12月共收集到符合要求的HBV自限性感染者238例(自限性感染組)和慢性乙型肝炎患者306例(慢性乙型肝炎組)作為研究對(duì)象。研究對(duì)象的臨床資料見表1。自限性感染組年齡顯著高于慢性乙型肝炎組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，慢性乙型肝炎組性別比例、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平顯著高于自限性感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。研究對(duì)象的選取參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)2019年版《慢性乙型肝炎防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：血清HBsAg陽性至少持續(xù)6個(gè)月且血清ALT持續(xù)或反復(fù)升高,或肝組織學(xué)檢查有肝炎病變。HBV自限性感染者必須為HBsAg陰性，HBV表面抗體、HBV核心抗體同時(shí)陽性，肝功能各項(xiàng)指標(biāo)均正常。以上研究對(duì)象均排除人類免疫缺陷病毒和(或)丙型肝炎病毒感染及其他原因?qū)е碌母闻K病變者。

1.2方法

1.2.1主要試劑 DNA標(biāo)志物、核酸染色劑、無水乙醇、瓊脂糖和MgCl2購自生工生物工程有限公司，PCR Mix購自TaKaRa公司。DNA提取試劑盒(吸附柱法)購自天根生物科技有限公司。

1.2.2DNA提取 采集靜脈血3 mL，乙二胺四乙酸抗凝，使用吸附柱法提取 DNA，過程嚴(yán)格按說明書操作。

1.2.3引物設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)采用PCR-SSP分型技術(shù)檢測(cè)HLA-DPA1第二外顯子基因型，引物序列參考文獻(xiàn)[12]，以人生長激素(HGH)為內(nèi)參引物，引物由生工生物工程有限公司合成，見表2。

1.2.4PCR反應(yīng)體系 分型引物上、下游(10 μmol/L)各1 μL、HGH 引物上、下游(2 μmol/L)各1 μL、MgCl2(25 mmol/mL)0.5 μL、DNA 模板(約50 μg/mL)2 μL、PCR Mix 10 μL，加去離子水至25 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，10個(gè)偱環(huán)； 95 ℃ 30 s，56 ℃ 60 s，20個(gè)偱環(huán)；72 ℃ 5 min。反應(yīng)結(jié)束后取20 μL產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電脈，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物片段。

表1 研究對(duì)象的一般資料

表2 HLA-DPA1基因第二外顯子等位基因擴(kuò)增引物序列

2 結(jié) 果

2.1基因分型 HLA-DPA1*0202等位基因擴(kuò)增結(jié)果 見圖1。

2.2HLA-DPA1基因第二外顯子等位基因檢測(cè)結(jié)果 從表3可見，自限性感染組HLA-DPA1*0103等位基因頻率為37.61%，高于慢性乙型肝炎組的29.41%，通過二元Logistic回歸分析校正性別和年齡因素后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，OR=0.63，95%CI：0.47～0.82)。自限性感染組HLA-DPA1*0202等位基因頻率為50.84%，低于慢性乙型肝炎組的60.29%，校正性別和年齡因素后，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001，OR=1.59，95%CI：1.22～2.08)。自限性感染組HLA-DPA1*0201、DPA1*0401等位基因分別為8.19%、3.36%，慢性乙型肝炎組分別為7.35%、2.94%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。自限性感染組和慢性乙型肝炎組均未發(fā)現(xiàn)HLA-DPA1*0301和HLA-DPA1*0104等位基因。

表3 自限性感染組和慢性乙型肝炎組等位基因分布[n(%)]

3 討 論

HBV通過肝細(xì)胞膜上的鈉離子-?；悄懰?協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為受體進(jìn)入肝細(xì)胞[13]。HBV感染慢性化及發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌的機(jī)制至今仍不清楚。多數(shù)研究認(rèn)為病毒本身及環(huán)境因素不能完全解釋這些差異[14-16]。LIN等[17]報(bào)道其研究人群的同卵雙生子慢性HBV感染率較異卵雙生子高。慢性HBV感染還具有明顯的家族聚集性[18-19]，存在血緣關(guān)系的親屬較不具有血緣關(guān)系的親屬發(fā)生慢性 HBV 感染的傾向性更高[20]，上述數(shù)據(jù)提示，遺傳因素是慢性 HBV 感染的重要影響原因。HLA-Ⅱ類分子具有穩(wěn)定和促進(jìn)免疫細(xì)胞相互結(jié)合增強(qiáng)免疫應(yīng)答的啟動(dòng)和效應(yīng)的功能。HLA的作用是將內(nèi)源性或外源性抗原以HLA-肽復(fù)合物的形式，通過T細(xì)胞表面的TCR，傳遞給CD4+和CD8+T細(xì)胞，以激活T細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答。2009年，KAMATANI等[21]學(xué)者通過全基因組關(guān)聯(lián)分析首次報(bào)道了HLA-DPA1和HLA-DPB1基因3′端非翻譯區(qū)的rs3077和rs9277535多態(tài)性與慢性乙型肝炎風(fēng)險(xiǎn)存在關(guān)聯(lián)，他們進(jìn)一步通過連鎖分析發(fā)現(xiàn)，rs3077A與HLA-DPA1*0103，rs3077C與HLA-DPA1*0202存在高度連鎖不平衡。在后繼研究中，如YAN等[22]、WANG等[23]研究中，除了廣西壯族人群研究結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他研究人群均與KAMATANI等[21]學(xué)者的研究結(jié)果相一致。由于不同地區(qū)漢族人群遺傳異質(zhì)性、病毒基因型等因素的存在，我國的HBV基因型主要是B型和C型，其中南方以B型為主，北方以C型為主[3]。以上原因可能造成不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果無法重復(fù)。因此，研究者認(rèn)為有必要研究HLA-DPA1基因遺傳變異與寧德地區(qū)漢族人群慢性乙型肝炎風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

本研究通過二元Logistic回歸分析顯示，HLA-DPA1*0103等位基因具有抵抗HBV感染的能力(OR=0.63)，HLA-DPA1*0202等位基因則是慢性乙型肝炎風(fēng)險(xiǎn)的危險(xiǎn)因子(OR=1.59)。本研究與OU等[24]學(xué)者的研究結(jié)果相似。OU等[24]還發(fā)現(xiàn)攜帶rs3077 AA+GA基因型的HBV感染者其總HLA-DPA1 mRNA表達(dá)水平顯著低于健康人群，同時(shí)HBV感染者HLA-DPA1*0103 mRNA的表達(dá)水平也顯著低于健康人群。O′BRIEN等[25]學(xué)者發(fā)現(xiàn)rs3077G等位基因能降低HLA-DPA1 mRNA的表達(dá)。以上研究研究結(jié)果提示，較低的 HLA-DPA1 mRNA表達(dá)可能影響抗原肽的提呈進(jìn)而降低宿主對(duì) HBV 感染的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致HBV感染慢性化。

本研究還顯示自限性感染組和慢性乙型肝炎組HLA-DPA1*DPA1*0103等位基因頻率分別為37.61%和29.41%，與KAMATANI等[21]報(bào)道的日本健康人群和慢性乙型肝炎人群的結(jié)果(38.3%和26.8%)較為接近；本研究自限性感染組和慢性乙型肝炎組HLA-DPA1*DPA1*0202等位基因頻率分別為50.84%、60.29%，均高于KAMATANI等[21]報(bào)道的日本健康人群和慢性乙型肝炎人群的結(jié)果(42.7%和53.1%)。本研究和KAMATANI等[21]研究均未發(fā)現(xiàn)HLA-DPA1*DPA1*0301和HLA-DPA1*DPA1*0104等位基因。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示HLA-DPA1基因第二外顯子多態(tài)性與慢性乙型肝炎風(fēng)險(xiǎn)存在相關(guān)性，為尋找HBV感染慢性化的分子機(jī)制提供了參考。