陳暢，楊淑雅，劉寶怡，李冕，魯艷芹，2

［1.山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）生物醫(yī)學(xué)科學(xué)學(xué)院（省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心），山東 濟(jì)南 250117；2.山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 內(nèi)分泌科，山東 濟(jì)南250014］

SLC39A13基因位于11p11.2 染色體處，編碼ZIP13 蛋白，在維持細(xì)胞內(nèi)外鋅離子平衡中起重要作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)ZIP13 在結(jié)締組織發(fā)育中有關(guān)鍵作用，SLC39A13的異常突變會(huì)引起一種結(jié)締組織病脊柱發(fā)育不良埃勒斯-丹洛斯綜合征3 型（spondylo-dysplastic ehlers-danlos syndrome type 3）［1-2］。ZIP 家族作為重要的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。目前已有文獻(xiàn)證實(shí)ZIP 家族相關(guān)基因與癌癥有關(guān)，例如ZIP4 的高表達(dá)與胃癌和胰腺癌的惡化有關(guān)［3］；胰腺癌早期發(fā)生RREB1/ZIP3 的下調(diào)導(dǎo)致鋅的減少［4］。但目前僅有1 篇文章指出SLC39A13/ZIP13 的高表達(dá)與卵巢癌的轉(zhuǎn)移、預(yù)后差有關(guān)［1］。尚未有SLC39A13的泛癌研究，因此本文首次對(duì)TCGA 和GEO 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行深入挖掘，研究SLC39A13在不同癌癥發(fā)病機(jī)制中的分子機(jī)制或臨床預(yù)后中的作用。

1 材料與方法

1.1 基因表達(dá)分析

在TIMER2.0 網(wǎng)站（http：//timer.cistrome.org/）中輸入“SLC39A13”，比較SLC39A13在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中不同腫瘤（或特定腫瘤亞型）和相鄰正常組織中的表達(dá)差異。對(duì)于某些正常組織缺乏的腫瘤，利用GEPIA2（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）的“表達(dá)分析-框圖”模塊分析，來(lái)獲得這些腫瘤組織與GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)的正常組織表達(dá)差異的數(shù)據(jù)，設(shè)置“P值＜0.01，log2FC＜1”和“輸入缺少正常組織對(duì)照的腫瘤”。此外，通過(guò)GEPIA2 網(wǎng)站的Stage Plot 模塊可以得到SLC39A13在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中腫瘤不同病理階段的表達(dá)情況，用log2（TPM+1）轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)作出“小提琴圖譜”。

1.2 生存預(yù)后分析

使用GEPIA2 的“生存分析”模塊獲得所有TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中涉及SLC39A13基因的腫瘤總生存期（OS）和無(wú)病生存期（DFS）的顯著差異性圖，設(shè)置參數(shù)“Cutoff-high（50%），Cutoff-low（50%）”來(lái)區(qū)分高表達(dá)組和低表達(dá)組。假設(shè)檢驗(yàn)采用對(duì)數(shù)秩和檢驗(yàn)，通過(guò)GEPIA2 的“生存分析”模塊繪制生存圖。

1.3 基因變異分析

利用cBioPortal 網(wǎng)站（http：//www.cbioportal.org/），在“快速選擇”區(qū)選擇“TGCA 泛癌圖譜”研究，查詢SLC39A13基因的遺傳變異情況。在“癌癥類(lèi)型匯總”模塊中觀察所有TCGA 腫瘤的突變頻率、突變類(lèi)型和拷貝數(shù)的改變值（copy number alteration,CNA）。SLC39A13的突變位點(diǎn)信息可以通過(guò)“突變”模塊顯示在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)示意圖或3D 結(jié)構(gòu)中。利用“比較”模塊來(lái)獲得TCGA癌癥病例在有或沒(méi)有SLC39A13基因突變時(shí)的總生存、無(wú)疾病、無(wú)進(jìn)展和無(wú)疾病生存差異的數(shù)據(jù)，同時(shí)生成P 值為log-rank 的Kaplan-Meier圖。

1.4 免疫浸潤(rùn)分析

使用TIMER2.0 數(shù)據(jù)庫(kù)的“免疫基因”模塊來(lái)探索所有TCGA 腫瘤中SLC39A13表達(dá)與免疫浸潤(rùn)之間的關(guān)系。選擇CD8+T 細(xì)胞作為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞的免疫細(xì)胞。應(yīng)用 CIBERSOR-ABS、QUANTISEO、EXCEL、MCPCOUNTER 和EPIC 算法進(jìn)行免疫浸潤(rùn)評(píng)估。根據(jù)純度調(diào)整后的Spearman's 等級(jí)相關(guān)實(shí)驗(yàn)獲得P值和偏相關(guān)系數(shù)（COR）。數(shù)據(jù)被可視化為熱圖和散點(diǎn)圖。

1.5 SLC39A13 編碼蛋白ZIP13 的相互作用蛋白富集分析

首先使用STRING 網(wǎng)站（https：//string-db.org/），查詢單一蛋白質(zhì)名稱（SLC39A13/ZIP13）和物種（人類(lèi)），隨后設(shè)置以下主要參數(shù)：所需的最低交互分?jǐn)?shù)（低信度0.150）；線條顏色表示交互證據(jù)的類(lèi)型；最大交互的數(shù)量（不超過(guò)50）和來(lái)源（實(shí)驗(yàn)證實(shí)）。最后篩選出10 個(gè)經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的與ZIP13 結(jié)合的蛋白。使用GEPIA2 的“相似基因檢測(cè)”模塊，基于所有TCGA 腫瘤和正常組織的數(shù)據(jù)集，獲得了前100 個(gè)SLC39A13相關(guān)的靶向基因。應(yīng)用GEPIA2 的“相關(guān)分析”模塊進(jìn)行相似基因與SLC39A13基因的相關(guān)性分析。應(yīng)用log2TPM 方塊圖，得到P 值和相關(guān)系數(shù)R。此外，使用TIMER2 的“基因相關(guān)”模塊作出所用基因的數(shù)據(jù)熱圖。使用Venn 網(wǎng)站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）來(lái)進(jìn)行交叉分析從而比較SLC39A13結(jié)合基因和相似基因。結(jié)合這兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG 路徑分析。將基因列表上傳到David 網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/）并選擇“OFFICIAL_GENE_SYMBOL” 和“Homo Spaiens”分別作為基因標(biāo)識(shí)符和物種，獲得了功能注釋圖的數(shù)據(jù)。最后將P＜0.05 的結(jié)果帶入R 包進(jìn)行GO 富集分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基因表達(dá)數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用TIMER2.0 方法分析了TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)的多種癌癥類(lèi)型中SLC39A13的表達(dá)狀態(tài)。在乳腺癌（BRCA），結(jié)腸癌（COAD），頭頸鱗狀細(xì)胞癌（HNSC），肝癌（LIHC），胃癌（STAD）組織中SLC39A13的表達(dá)水平高于相應(yīng)的正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）；宮頸癌（CESC）組織中SLC39A13的表達(dá)水平低于相應(yīng)的正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖1A。

圖1 SLC39A13 在不同腫瘤及腫瘤分期中的基因表達(dá)分析

將GTEx 數(shù)據(jù)集的正常組織作為對(duì)照，進(jìn)一步評(píng)估SLC39A13在正常組織和腫瘤組織之間的表達(dá)差異，在彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（DLBC），胸腺癌（THYM）組織中，SLC39A13表達(dá)高于相應(yīng)正常組織。在卵巢癌（OV），睪丸癌（TGCT），甲狀腺癌（THCA），子宮肉瘤（UCS）組織中，SLC39A13表達(dá)低于相應(yīng)正常組織，見(jiàn)圖1B。使用GEPIA2 的“病理階段”模塊觀察SLC39A13的表達(dá)與癌癥病理階段的相關(guān)性，包括乳腺癌，結(jié)腸癌，肝癌和皮膚黑色素瘤（SKCM），在這些腫瘤組織中SLC39A13表達(dá)普遍呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見(jiàn)圖1C。

2.2 生存數(shù)據(jù)分析

根據(jù)SLC39A13的表達(dá)水平，將癌癥病例分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，研究了SLC39A13的表達(dá)與不同腫瘤患者預(yù)后的相關(guān)性。高表達(dá)的SLC39A13與宮頸癌（P=0.027），結(jié)腸癌（P=0.023），多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）（P=0.002），腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤（LGG）（P=0.003），間皮瘤（MESO）（P=0.009）總體預(yù)后不良有關(guān)。SLC39A13低表達(dá)與胰腺癌（PAAD）（P=0.015）總體預(yù)后不良有關(guān)，見(jiàn)圖2A。無(wú)病生存率分析數(shù)據(jù)顯示SLC39A13的高表達(dá)與頭頸鱗狀細(xì)胞癌（P=0.044）、腦低級(jí)別膠質(zhì)瘤（P=0.009）、肝癌（P=0.021）、肺鱗狀細(xì)胞癌（LUSC）（P=0.011）、間皮瘤（P=0.040）、前列腺癌（PRAD）（P＜0.001）患者預(yù)后差有關(guān)，見(jiàn)圖2B。以上數(shù)據(jù)表明SLC39A13的表達(dá)高低與不同類(lèi)型腫瘤的預(yù)后存在差異。

圖2 SLC39A13 基因與腫瘤生存預(yù)后的關(guān)系

2.3 基因變異分析

以SLC39A13突變?yōu)橹饕儺愵?lèi)型的子宮內(nèi)膜癌（UCEC）患者SLC39A13基因變異頻率最高（＞3%）。皮膚黑色素瘤患者僅發(fā)生SLC39A13突變，其變異頻率＞2%。SLC39A13擴(kuò)增是腎上腺皮質(zhì)癌（ACC）和頭頸鱗狀細(xì)胞癌患者的唯一類(lèi)型，變異頻率分別為1.1%和0.96%，見(jiàn)圖3A。進(jìn)一步顯示SLC39A13遺傳變異的類(lèi)型和位點(diǎn)，見(jiàn)圖3B，發(fā)現(xiàn)SLC39A13錯(cuò)義突變是遺傳變異的主要類(lèi)型。此外，還探討了SLC39A13的基因突變與不同類(lèi)型癌癥患者臨床預(yù)后之間在潛在聯(lián)系，見(jiàn)圖3C。與無(wú)SLC39A13基因突變的病例相比，SLC39A13突變后與子宮內(nèi)膜癌患者的OS（P=0.252）、DFS（P=0.267）、疾病特異性生存期（DSS）（P=0.164）無(wú)明顯相關(guān)，與無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）（P=0.044）有關(guān)，見(jiàn)圖3C。

圖3 SLC39A13 基因突變的分析

2.4 免疫浸潤(rùn)數(shù)據(jù)分析

腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞，作為腫瘤微環(huán)境的重要成分，與癌癥的啟動(dòng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［5-6］。據(jù)報(bào)道，腫瘤微環(huán)境基質(zhì)中的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞參與調(diào)節(jié)各種腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的功能［5-6］。在此，使用一些算法來(lái)挖掘免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平和SLC39A13基因在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中不同癌癥類(lèi)型中的表達(dá)水平之間的潛在關(guān)系。發(fā)現(xiàn)SLC39A13的表達(dá)與免疫浸潤(rùn)呈正相關(guān)的腫瘤有結(jié)腸癌、食管癌、胰腺癌、直腸癌、胃癌、睪丸癌，SLC39A13的表達(dá)水平與腎乳頭狀細(xì)胞癌（KIRP）相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)，見(jiàn)圖4。

圖4 SLC39A13 基因的免疫浸潤(rùn)富集分析

2.5 ZIP13 的相互作用蛋白分析

為了進(jìn)一步研究SLC39A13基因在腫瘤發(fā)生中的分子機(jī)制，篩選出SLC39A13編碼蛋白ZIP13 相互作用蛋白，基于STRING 工具，總共獲得了10個(gè)ZIP13 結(jié)合蛋白的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。圖5A 顯示了這些蛋白質(zhì)相互作用的網(wǎng)絡(luò)。使用GEPIA2 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合TCGA 所有腫瘤的表達(dá)數(shù)據(jù)，獲得了與SLC39A13表達(dá)相關(guān)的前100 個(gè)基因。圖5B 所示，SLC39A13的表達(dá)水平與FAM65A、VEGFB、PLA2G15、GLIS2基因（均P＜0.001）呈正相關(guān)。相應(yīng)的熱圖數(shù)據(jù)也顯示，SLC39A13與上述的4 個(gè)癌癥類(lèi)型的基因呈正相關(guān)，見(jiàn)圖5C。兩組數(shù)據(jù)的交叉分析顯示沒(méi)有共同基因，見(jiàn)圖5D。

結(jié)合兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行KEGG 和GO 的富集分析。KEGG 數(shù)據(jù)顯示出SLC39A13可能通過(guò)參與“代謝途徑”和“溶酶體”通路進(jìn)一步影響腫瘤的發(fā)生。GO 富集分析數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，這些基因中的大多與酶活動(dòng)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)，見(jiàn)圖5E。

圖5 SLC39A13 編碼蛋白ZIP13 相互作用蛋白及其基因富集分析與腫瘤相關(guān)性分析

3 討論

目前尚無(wú)從整體角度對(duì)SLC39A13進(jìn)行泛癌分析的文獻(xiàn)。本文首次系統(tǒng)地通過(guò)生信分析發(fā)現(xiàn)SLC39A13在乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌等腫瘤組織中高表達(dá)。已有文獻(xiàn)證實(shí)在卵巢癌中SLC39A13/ZIP13 是一種重要的腫瘤干細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，在卵巢癌組織中過(guò)度表達(dá)，通過(guò)Src/FAK 信號(hào)通路調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，促進(jìn)卵巢癌的轉(zhuǎn)移［1］。這與本文分析結(jié)果一致。SLC39A7基因是乳腺癌細(xì)胞生存的關(guān)鍵基因，是乳腺癌診斷和預(yù)后的重要分子標(biāo)志物［7］。生信分析發(fā)現(xiàn)SLC39A13在乳腺癌組織中高表達(dá)，可能作為潛在的表乳腺癌預(yù)后分子標(biāo)志物。高表達(dá)的SLC39A13基因與結(jié)腸癌的預(yù)后差相關(guān)。結(jié)腸癌曾是全球第五大癌癥死亡原因［8］，而根據(jù)最新數(shù)據(jù)預(yù)計(jì)2021 年結(jié)腸癌將成為全球癌癥死亡的主要原因［9］。結(jié)腸癌也是我國(guó)最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一［10］，大約四分之一的患者在初次診斷時(shí)就發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致預(yù)后較差［11］?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）參與結(jié)腸癌的局部和遠(yuǎn)端侵襲，血漿中MMP 高表達(dá)與結(jié)腸癌預(yù)后差相關(guān)［12］。據(jù)報(bào)道，EMT 相關(guān)基因的表達(dá)與T 細(xì)胞的抗腫瘤免疫相關(guān)。EMT 基因的高表達(dá)與結(jié)腸癌的預(yù)后差有關(guān)，而浸潤(rùn)性T 細(xì)胞豐度（ITA）越高與結(jié)腸癌的預(yù)后好相關(guān)［13］。本文發(fā)現(xiàn)SLC39A13基因在結(jié)腸癌患者中的異常表達(dá)也有可能作為結(jié)腸癌診斷和預(yù)后分析的分子標(biāo)志物。宮頸癌組織中SLC39A13的表達(dá)低于正常組織，其高表達(dá)與患者預(yù)后差有關(guān)。宮頸癌是世界上第四大常見(jiàn)的惡性腫瘤，每年新增超過(guò)52 萬(wàn)例，其中超過(guò)85%發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家［14］。鈣活化氯離子通道2（CLCA2）表達(dá)的降低可能是宮頸癌患者的一個(gè)潛在預(yù)后標(biāo)志物，但其分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究［15］。前膠原賴氨酸，2-酮戊二酸5-雙加氧酶（PLOD）是一種有效的預(yù)后標(biāo)志物，與宮頸癌的免疫浸潤(rùn)有關(guān)［16］。SLC39A13基因在宮頸癌患者中表達(dá)情況也可以作為一個(gè)診斷和治療的輔助標(biāo)志物。在胰腺癌組織中SLC39A13的表達(dá)量低于正常組織，其低表達(dá)與患者預(yù)后差有關(guān)。根據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)2019年公布的數(shù)據(jù)，胰腺癌引起的死亡率在惡性腫瘤中排名第四［17-18］。雖然在了解胰腺癌的分子發(fā)病機(jī)制方面取得了重大進(jìn)展，但胰腺癌患者的預(yù)后仍然非常差，過(guò)去20 年的5 年生存率僅從5%增加到8%。胰腺癌的新分子預(yù)后標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)仍是未來(lái)研究方向［19］。臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示與正常/良性胰腺組織相比，人胰腺癌組織中鋅的含量持續(xù)降低［4］。胰腺癌患者血清鋅濃度降低表明，鋅和鋅轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因可能作為這種惡性疾病的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。鋅穩(wěn)態(tài)受到細(xì)胞中SLC39A/ZIP、SLC30A/ZnT 和金屬硫蛋白（MT）的調(diào)控。鋅穩(wěn)態(tài)失調(diào)可能影響癌細(xì)胞的異常特征［20］。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)體ZIP4、ZIP11、ZnT 和ZnT6 的表達(dá)增加預(yù)示著胰腺癌的預(yù)后不良［20］。生信分析表明ZIP13 的表達(dá)降低預(yù)示著胰腺癌的預(yù)后不良，這為理解鋅穩(wěn)態(tài)與胰腺癌之間的復(fù)雜關(guān)系提供了新的線索。鋅穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因在胰腺癌中的預(yù)后和治療作用機(jī)制值得進(jìn)一步探索［20］。SLC39A13表達(dá)量的不同對(duì)不同類(lèi)型的腫瘤影響是不一樣的，在臨床中，還需要考慮到其他臨床特征，通過(guò)更深入的分子實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)確定SLC39A13的表達(dá)是否與上述腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

SLC39A13最主要的變異類(lèi)型是錯(cuò)義突變。子宮內(nèi)膜瘤患者中發(fā)生該基因的錯(cuò)義突變和擴(kuò)增。子宮內(nèi)膜瘤是一種遺傳性疾病，通常伴有基因突變或異常表達(dá)［21］。分析發(fā)現(xiàn)SLC39A13的擴(kuò)增與患者的預(yù)后差相關(guān)，因此SLC39A13基因突變也有可能是子宮內(nèi)膜瘤患者預(yù)后差的潛在分子標(biāo)志物。SLC39A13表達(dá)與免疫浸潤(rùn)呈正相關(guān)的腫瘤有結(jié)腸癌、食管癌、胰腺癌、直腸癌、胃癌和睪丸癌，SLC39A13表達(dá)水平與腎乳頭狀細(xì)胞癌相關(guān)成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)。腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞從血液遷移到腫瘤組織，并在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用［22］。越來(lái)越多研究表明，腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)抑制和預(yù)后密切相關(guān)［22］。SLC39A13基因與免疫浸潤(rùn)的關(guān)系有望為免疫治療提供新思路。

綜上所述，SLC39A13的泛癌分析表明其表達(dá)與臨床預(yù)后、基因突變、腫瘤細(xì)胞的免疫浸潤(rùn)之間存在相關(guān)性，這有助于從多因素綜合分析SLC39A13在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，為臨床診斷治療及基礎(chǔ)研究提供幫助。