馬 力 馬 靜 張常喜

黑枸杞為茄科、枸杞屬植物(Lycium Ruthenicum Murr)的干燥成熟果實(shí)。其味甘、性平，入肝、腎經(jīng)，具有補(bǔ)肝強(qiáng)腎之功效，是一種常用的藥食同源類中藥。有研究表明，黑枸杞營(yíng)養(yǎng)豐富，其多種營(yíng)養(yǎng)成分皆為人體所需要，伍玉輝等[1]發(fā)現(xiàn)黑枸杞中含有大量氨基酸種類繁多，其中為人體所需的氨基酸有18種，還包括有機(jī)酸、脂肪、微量元素、蛋白質(zhì)等,其次有研究發(fā)現(xiàn)黑枸杞中有超過blueberry的大量的黑果色素—天然原花青素(OPC)，是天然野生植物中發(fā)現(xiàn)的含量最高的野生植物。而且在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，黑枸杞在臨床上治療肝病具有很好的療效，其對(duì)肝纖維化、酒精性肝病、脂肪肝、肝炎等多種肝臟疾病具有很好的預(yù)防和治療效果，證明了黑枸杞的補(bǔ)肝功效，但目前黑枸杞補(bǔ)肝的作用機(jī)制尚未闡明。除此之外它還具有抗疲勞、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞、調(diào)節(jié)血脂、延緩衰老等作用。而在中醫(yī)相關(guān)黑枸杞的研究中顯示黑枸杞具有補(bǔ)肝腎、明目、健脾益胃、補(bǔ)腦以及抗衰老等作用。本研究擬以中醫(yī)理論為指導(dǎo)，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和手段，研究黑枸杞補(bǔ)肝作用機(jī)制，為更好地開發(fā)應(yīng)用黑枸杞提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)肝干細(xì)胞SD大鼠肝干細(xì)胞系WB-F344[許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)黑枸杞黑枸杞(寧夏杞愛原生黑果枸杞股份有限公司)

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑Ultrapure RNA 超純RNA提取試劑盒(CW0581M，CWBIO 康為世紀(jì))，UltraSYBR Mixtur(CW0957M，CWBIO 康為世紀(jì))，Trizon Reagent(CW0580S，CWBIO 康為世紀(jì))，HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒(CW2569M，CWBIO 康為世紀(jì))。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器-80 ℃冰箱(BDF-86V348，BIOBASE)，移液槍(20～200 μl，0.1～2.5 μl，0.5～10 μl，eppendorf)，單道可調(diào)移液器(0.5～10 μl，20～200 μl，100～1000 μl，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)，干式電加熱器(GL-150，海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，微型離心機(jī)(D1008E，SCJLOGEX)，旋渦混合器(XH-C，常州越新儀器制造有限公司)，低溫高速離心機(jī)(TGL-16G，常州中捷實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司)，紫外可見分光光度計(jì)(UV-1600PC，上海美譜達(dá)儀器有限公司)，熒光PCR儀(CFX ConnectTM實(shí)時(shí)，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠藥物血清制備藥物血清制備：SD大鼠2只，雄性，連續(xù)藥物(0.15 g/ml的黑枸杞溶液)灌胃7 d(每天1次)，末次給藥后2 h，麻醉心臟取血，后靜置離心分析血清，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 肝干細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)藥物血清處理組加入SD大鼠含藥血清處理(含藥血清量10%)，空白組加10%磷酸鹽緩沖液(PBS),空白血清處理組加不含藥胎牛血清(FBS)10%。WB-F-344細(xì)胞的傳代：棄去培養(yǎng)上清，1×PBS洗兩遍，0.25%胰酶消化3 min，加入培養(yǎng)基終止消化并懸起細(xì)胞；收集細(xì)胞至10 ml離心管中，1000 r/min離心 3 min，棄盡上清，加入DMEM完全培養(yǎng)基吸管吹勻；將上述細(xì)胞懸液稀釋至適宜細(xì)胞密度后加入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)瓶中，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取血后加抗凝劑,靜置1～2 min,置入離心機(jī)內(nèi)以3000 r/min離心15 min,用移吸管吸出分散的血清(上層乳黃色的上清液),反復(fù)2次得較純血清,放置-20 ℃冰箱儲(chǔ)存。

1.2.3 糖原染色(PAS)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，加4%組織細(xì)胞固定液固定15 min，然后用自來水沖洗3 min，再用蒸餾水浸洗2次，1 min/次，然后再滴加過碘酸溶液，室溫靜置7 min，再用自來水沖洗1 min,蒸餾水浸洗2次，1 min/次，然后再滴加Schiff Reagent，置于室溫陰暗處，浸染15 min，自來水沖洗10 min，最后再滴加蘇木素染色液，染 2 min，酸性分化液分化2～5 s，自來水沖洗10 min，再用蒸餾水沖洗，鏡檢。

1.2.4 肝干細(xì)胞激光共聚焦實(shí)驗(yàn)激光共聚焦實(shí)驗(yàn)鋪板：棄去培養(yǎng)上清，1×PBS洗兩遍，0.25%胰酶消化3 min，加入培養(yǎng)基終止消化并懸起細(xì)胞；收集細(xì)胞至10 ml離心管中，1000 r/min離心3 min，棄盡上清，加入DMEM完全培養(yǎng)基吸管吹勻后將細(xì)胞培養(yǎng)液鋪于6孔板中，24 h后細(xì)胞貼壁后按實(shí)驗(yàn)方案處理細(xì)胞。(1)細(xì)胞的固定 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的培養(yǎng)皿用PBS浸洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定 15 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min；(2)細(xì)胞的通透 0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20 min。(3)封閉 PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次5 min，移液槍吸干PBS，在培養(yǎng)皿內(nèi)滴加5% BSA，37 ℃封閉30 min。(4)免疫反應(yīng) 一抗 移液槍吸掉封閉液，不洗，培養(yǎng)皿內(nèi)滴加足夠量的稀釋好的一抗CK19(1∶200)，AFP(1∶50)，37 ℃孵育3 h。(5)加熒光二抗PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min，移液槍吸干培養(yǎng)皿內(nèi)多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗Cy3(1∶200)，37 ℃孵育30 min，PBS浸洗培養(yǎng)皿3次，每次3 min。(6)核染定位 復(fù)染核:滴加DAPI避光孵育5 min,對(duì)標(biāo)本開始染核,用PBS清洗剩余的DAPI;封片:用50%甘油密封培養(yǎng)皿,并且在熒光顯微鏡下觀察收集圖片。

1.2.5 肝干細(xì)胞PCR實(shí)驗(yàn)(1)細(xì)胞收集：①用移液槍吸掉培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)液。②在培養(yǎng)皿中加入Trizon 裂解液，根據(jù)細(xì)胞量每皿加入1 ml Trizon。③用移液槍吹打，使貼壁細(xì)胞懸浮與裂解液充分接觸，將全部細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1.5 ml 離心管中，保存在-80 ℃，防止降解。(2)RNA提取：①向以上溶液中加入氯仿，每使用1 ml Trizon后加入0.2 ml 氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15 s，冰盒上放置5 min。②4 ℃，12 000 r/min離心15 min，此時(shí)樣品分成3層：紅色有機(jī)相層、中間層、無色水相層，RNA主要在水相層中，把水相層(約500 μl)轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的預(yù)冷1.5 ml RNase-Free 離心管中。③在得到的水相溶液中加入等體積預(yù)冷的70%乙醇，顛倒混勻。④將上述溶液加入到已裝入收集管的吸附柱RM中，在 4 ℃，12 000 r/min 離心30 s，棄流出液。⑤加入700 μl RW1洗滌沉淀。4 ℃，12 000 r/min 離心30 s，棄流出液。⑥加入500 μl RW2洗滌沉淀。4 ℃，12 000 r/min 離心30 s，棄流出液。⑦重復(fù)步驟⑥。⑧棄流出液后，空轉(zhuǎn)離心2 min，棄流出液。⑨冰盒上存放5 min,晾干。將吸附柱裝入到一條新的預(yù)冷1.5 ml RNase-Free離心管中,加入 30 μl 無RNase的水,完全水解RNA,靜置3 min,4 ℃,12 000 r/min離心1 min。把回流液再加入到吸附柱當(dāng)中,靜置3 min,4 ℃,12 000 r/min離心1 min。所得的RNA保持在-80 ℃,避免分解。(3)RNA濃度、純度測(cè)定：①打開紫外可見分光光度計(jì)預(yù)熱20 min，從30 μl體系的RNA溶液中吸取5 μl，與45 μl的RNase free water混合均勻(即將RNA溶液稀釋10倍)。②在260 OD下測(cè)定其數(shù)據(jù)并記錄，再在280 OD下測(cè)定數(shù)據(jù)并記錄。③根據(jù)公式計(jì)算：A260 ×稀釋倍數(shù)×40=RNA ng/μl(濃度);1.8≤A260/280≤2.0(純度)。見表1。(4)逆轉(zhuǎn)錄將RNA通過逆轉(zhuǎn)錄HiFiScript cDNA 第一鏈合成試劑盒合成CDNA：①逆轉(zhuǎn)錄體系 參照試劑盒說明書以4.9 μg總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按下表配制反應(yīng)體系混合液。見表2。②渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。③加入①②③后70 ℃孵育10 min，再迅速冰浴 2 min。④再加入④⑤⑥50 ℃孵育15 min，85 ℃孵育 5 min。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于-80 ℃冰箱，以防降解。(5)熒光定量PCR 根據(jù)各指標(biāo)基因序列，設(shè)計(jì)其特異檢測(cè)引物，以細(xì)胞的總RNA為模板，q-PCR檢測(cè)各基因的表達(dá)情況。見表3。

表1 RNA濃度及純度表

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系表

表3 引物信息表

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)所用數(shù)據(jù)皆運(yùn)用GraphPad Prism 5來統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)t檢驗(yàn)顯著性差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 (PAS)實(shí)驗(yàn)肝干細(xì)胞(Liver stem cell)與肝細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、增殖甚至纖維化程度等有著密切的關(guān)系，為了研究黑枸杞的補(bǔ)肝機(jī)制，本研究中選用肝干細(xì)胞系WB-F344細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。陽性物質(zhì)呈紅色或紫紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈深淺不一的紅色。此結(jié)果提示黑枸杞能夠促進(jìn)肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成肝細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期研究所發(fā)現(xiàn)的黑枸杞具有促進(jìn)肝干細(xì)胞增殖，抑制其凋亡的結(jié)論相符合。見圖1。

圖1 肝干細(xì)胞(PAS)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 肝干細(xì)胞激光共聚焦結(jié)果采用免疫熒光檢測(cè)技術(shù)研究黑枸杞溶液對(duì)肝干細(xì)胞分化的影響。實(shí)驗(yàn)時(shí)，將細(xì)胞固定、打孔、封閉后進(jìn)行免疫反應(yīng)，通過加入甲胎蛋白(AFP)、細(xì)胞角蛋白19(CK-19)或白蛋白(Albumin,ALB)孵育一定時(shí)間，再加入熒光二抗Cy3，染細(xì)胞核，再通過共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況。其中紅色熒光為檢測(cè)的目的蛋白，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核。與空白組和不含藥組相比，含藥組的紅色熒光很明顯。此結(jié)果表明黑枸杞應(yīng)該能夠誘導(dǎo)肝干細(xì)胞向肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞分化的作用。見圖2。

圖2 肝干細(xì)胞激光共聚焦實(shí)驗(yàn)結(jié)果

科學(xué)研究表明肝干細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化受各種細(xì)胞因子控制，如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)[2]等能促使肝干細(xì)胞的增殖，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)[3]等能誘發(fā)其凋亡,并抑制生長(zhǎng),表明細(xì)胞生長(zhǎng)因素可以在重度肝損害后肝干細(xì)胞的啟動(dòng)、生長(zhǎng)和分化過程調(diào)節(jié)中起作用。此外,調(diào)控肝干細(xì)胞增生與分離涉及細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)通道Wnt、Notch、Hedgehog、BMP/TGFβ、PI3K、AKT等[4]，Wnt-βcatenin信號(hào)通道與肝細(xì)胞的形成相關(guān)，Wnt1量的變化決定著卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化，Notch信號(hào)通道與肝細(xì)胞增殖、膽管及新生血管形成相關(guān)，對(duì)肝臟損傷后重塑起重要作用[5]。肝干細(xì)胞誘導(dǎo)分化決定著肝細(xì)胞再生和肝損傷修復(fù)，直接影響肝病的治療和預(yù)后。通過提取大鼠肝干細(xì)胞中的RNA，并將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。PCR結(jié)果顯示，CYP1A1、wnt-1和notch2的mRNA的表達(dá)均降低，該結(jié)果提示黑枸杞可能通過下調(diào)wnt-1和notch2通路，誘導(dǎo)肝干細(xì)胞分化。見表4、表5。

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05。圖3 肝干細(xì)胞PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果條形圖

表4 黑枸杞對(duì)CYP1A1 Notch2 Wnt-1表達(dá)的影響

表5 黑枸杞對(duì)CYP1A1 Notch2 Wnt-1影響的顯著性差異分析表

總之，研究結(jié)果表明，黑枸杞可通過下調(diào)wnt-1和notch2通路(PCR實(shí)驗(yàn))，促進(jìn)肝干細(xì)胞向肝細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞分化，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞再生和修復(fù)(PAS和PCR對(duì)CYP1A的檢測(cè))。

3 討論

有多種研究表明Wnt1信號(hào)能夠調(diào)控機(jī)體的發(fā)育、生長(zhǎng)、衰老和死亡, 成體組織細(xì)胞的分化、增殖及凋亡都和它有著密不可分的關(guān)系[6,7]。當(dāng)肝臟受損時(shí)，殘存的肝組織就會(huì)再生，而肝臟的再造功能與肝干細(xì)胞也是離不開的[8]。肝干細(xì)胞是指產(chǎn)生在成熟肝的Herring狹隙中的一類有雙向分化潛能的細(xì)胞,在肝細(xì)胞遭受破壞時(shí)或肝細(xì)胞的再生遭到抑制時(shí),它們能夠生長(zhǎng)、分化形成不同的肝細(xì)胞與膽管細(xì)胞,從而參加肝構(gòu)造與功能的重組，具有干細(xì)胞特點(diǎn)的一類細(xì)胞[9,10]。而且肝干細(xì)胞來源也有不同，由此可以將肝干細(xì)胞分為2類，即：肝源性肝干細(xì)胞、非肝源性肝干細(xì)胞[11]。肝源性肝干細(xì)胞又可以分化為肝卵圓細(xì)胞等多種細(xì)胞形態(tài)，而當(dāng)肝臟受到損傷時(shí)，肝卵圓細(xì)胞就會(huì)分化為肝細(xì)胞，幫助肝臟再生[12-14]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Wnt-βcatenin信號(hào)通路與肝臟細(xì)胞的形成相關(guān)，其中Wnt1量的變化決定著卵圓細(xì)胞向肝細(xì)胞的分化[15，16]。相關(guān)研究表明卵圓細(xì)胞有導(dǎo)致膽管癌或肝細(xì)胞癌的傾向，而阻斷Wnt1信號(hào)通道可阻礙卵圓細(xì)胞分化為肝細(xì)胞[17]。細(xì)胞色素P450(Cytochrome P450)是一組含亞鐵血紅素的同工酶，是至關(guān)重要的一類酶，它在人體中有許多作用，例如：可以幫助一些藥物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化(即藥物代謝)；它具有催化功能，可以對(duì)一些物質(zhì)進(jìn)行催化作用，例如許多前致癌物和前毒物的活化過程就離不開其的催化作用。有研究表明，當(dāng)細(xì)胞色素CYP1A1被激活后，能引起細(xì)胞內(nèi)鈣釋放、活性氧增多進(jìn)而產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，激發(fā)Caspase通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，產(chǎn)生肝毒性作用[18]，當(dāng)阻斷CYP1A1的表達(dá)，可以有效減少肝臟的損傷。Notch信息通道由Notch受體、Notch配體、CSLDNA融合蛋白質(zhì)、其他的效應(yīng)物和Notch的調(diào)控分子等構(gòu)成。Notch信號(hào)通路與肝纖維化相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)Notch能與生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子相互作用增強(qiáng)或減少EMC,選擇性的介導(dǎo)纖維化產(chǎn)生[19,20]。本研究采用pcr技術(shù)檢測(cè)黑枸杞作用于肝干細(xì)胞系WB-F344后，通過抑制Wnt1等相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)，從而對(duì)肝臟起到保護(hù)作用。因此得出結(jié)論加藥血清對(duì)肝干細(xì)胞系WB-F344能產(chǎn)生影響。