孫文靜 馬惠昇 穆 靜 宋 斐 楊 楠 魏曉歌

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，寧夏銀川750001；2.寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏銀川750001）

《素問·長刺節(jié)論》云：“病在筋，筋攣節(jié)痛，不可以行，名曰筋痹”[1]，筋傷常表現(xiàn)為肌肉筋骨等軟組織攣縮、僵硬和疼痛[2]，臨床上此病患者常見頸部疼痛明顯，形成結(jié)節(jié)及條索狀物，嚴(yán)重者出現(xiàn)頭暈、頭痛、惡心等交感神經(jīng)興奮癥狀。頸部肌肉長時間緊張收縮，局部缺血缺氧，產(chǎn)生微循環(huán)障礙，代謝產(chǎn)物堆積，引起炎癥反應(yīng)及肌肉纖維化改變，日久不愈則形成粘連及條索狀物[3]。理筋手法立足于中醫(yī)經(jīng)絡(luò)學(xué)說，具有松解肌肉粘連，緩解痙攣，減輕局部炎癥反應(yīng)，促進血液循環(huán)的作用[4]。

損傷的骨骼肌修復(fù)主要依賴肌衛(wèi)星細(xì)胞（muscle satellite cells，MSCs）的增殖與分化。骨骼肌損傷后，肌纖維壞死伴有炎癥因子浸潤，處于靜息狀態(tài)的肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活[5]，此時胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）與成肌分化 抗 原（myogenic differentiation antigen，MyoD）參與調(diào)控成肌細(xì)胞融合、分化，在肌細(xì)胞再生并生長為成熟肌纖維的過程中發(fā)揮重要作用[6]。本研究通過觀察運用理筋手法干預(yù)兔骨骼肌慢性靜力性損傷后頸后肌組織磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號通路相關(guān)蛋白以及IGF-1和MyoD表達的變化，探索理筋手法促進骨骼肌修復(fù)的相關(guān)機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 選擇6月齡日本大耳白兔38只，體重（2.0±0.6）kg，雌雄各半，實驗動物由陜西君行生物科技有限公司提供，許可證號：SCXK（陜）2017-001，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物房，常規(guī)分籠飼養(yǎng)。室溫為15～20 ℃，濕度為50%～60%，12 h/12 h明暗周期，自由飲食飲水。實驗過程中對動物的處置符合國家實驗動物倫理的相關(guān)規(guī)定，嚴(yán)格遵守寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理原則。

1.2 主要試劑 蘇木素-伊紅（HE）染液（珠海貝索生物技術(shù)有限公司，批號：BA-4041），二甲苯（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），無水乙醇（天津市永大化學(xué)試劑有限公司），分化液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0163M），DBA顯色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZLI-9018），RIPA裂解液（北京索萊寶公司，批號：R0020），ECL發(fā)光試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：sc-2048），PVDF膜（Millipore公司，批號：IPVH00010），山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZB2301），山羊抗鼠二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號：ZB2305）。

1.3 主要儀器 包埋機（武漢俊杰電子有限公司），病理切片機（上海徠卡儀器有限公司），光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)（日本尼康公司），組織攤片機（浙江金華科迪儀器設(shè)備有限公司），低溫高速離心機（Eppendorf公司），電泳儀（北京六一公司），轉(zhuǎn)膜儀系統(tǒng)（ATTO公司），酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃Multiskan）、移液器（吉爾森公司）。

2 實驗方法

2.1 分組 兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)隨機數(shù)字表法選取3只作為空白組，剩余35只制作頸部靜力性損傷模型。造模成功后，隨機選取5只作為模型組，其余30只隨機分為模型對照組15只和手法治療組15只。

2.2 造模 參照劉志華[7]報道的方法，制作改良頸部模型固定架，建立兔頸部靜力性損傷模型。適當(dāng)調(diào)整固定架大小，以不影響兔正常呼吸為度，且四肢活動正常。固定后兔頭頸前屈45°，每天持續(xù)5 h，連續(xù)60d。課題組在前期研究中已證明，采用該法造模后，兔頸后肌肌纖維排列扭曲，結(jié)構(gòu)紊亂甚至斷裂溶解，證明此法可以造成兔頸后肌發(fā)生慢性靜力性肌損傷，但未造成頸椎骨性生理曲度的改變。

2.3 干預(yù)方法 課題組前期研究已明確理筋手法最佳刺激量為2 kg。為保證手法力量及頻率的標(biāo)準(zhǔn)化，選2名熟悉理筋手法操作要點的干預(yù)者，先在SF-Ⅲ型智能推拿手法參數(shù)測定儀上進行手法力量、頻率等動力學(xué)參數(shù)訓(xùn)練，待兩人手法的動力學(xué)參數(shù)穩(wěn)定并且達到標(biāo)準(zhǔn)后，再于兔頸部實施手法。手法治療組兔均予松筋、撥筋、順筋3種手法。松筋手法是將大拇指和食指指腹著力于頸椎兩側(cè)肌肉，自上而下循環(huán)拿揉，頻率100次/min，共5min[8]；撥筋手法以大拇指指腹著力于一側(cè)頸肩部肌肉，兩側(cè)交替反復(fù)進行撥動，頻率80次/min，共5min；順筋手法將兩手拇食指指腹著力于枕骨粗隆下，自上而下推捋頸部肌肉，頻率80次/min，共5min。手法治療組兔每日予手法干預(yù)1次，每次15min，連續(xù)干預(yù)30d。模型對照組不予任何治療，造模成功后觀察30d。

2.4 取材 造模結(jié)束后，將空白組3只與模型組5只兔禁食12 h后采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死；模型對照組分別于觀察10d、20d、30d后，隨機選取5只兔，禁食12 h后處死；手法治療組分別于干 預(yù)10d、20d、30d后，隨 機 選取5只 兔，干 預(yù)結(jié)束后禁食12 h處死。各組兔處死后各取兩塊約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的頸后肌組織放入4%多聚甲醛中固定，48 h后常規(guī)脫水、固定、石蠟包埋，以分別進行HE染色及免疫組織化學(xué)法（IHC法）檢測；另各取一塊約50mg的頸后肌組織，迅速放入液氮中凍存，以進行蛋白免疫印跡法（Western blot法）檢測。

2.5 觀察指標(biāo)

2.5.1 一般情況 造模結(jié)束后，觀察造模兔飲食水情況、頸部觸覺及行為學(xué)變化，并與空白組兔的一般情況進行比較。

2.5.2 組織形態(tài)學(xué) 將空白組和模型組兔頸后肌組織石蠟包塊制作切片（厚度為5 μm），常規(guī)脫蠟、脫水后放入蘇木素染色液，流水沖洗，鹽酸乙醇分化，繼續(xù)放入伊紅溶液染色，流水沖洗，梯度脫水后進行透明及中性樹脂封固。分別于100、200倍光鏡下觀察肌纖維排列走向等組織形態(tài)學(xué)變化。

2.5.3 IHC法檢測頸后肌組織IGF-1與MyoD陽性表達 各組兔頸后肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟水化，放入檸檬酸修復(fù)液高壓修復(fù)，加入3%甲醇雙氧水20min，水洗后用PBS浸泡1min，5%BSA中孵育30min，滴 加 一 抗IGF-1（1∶100）、MyoD（1∶100）4 ℃過夜，PBS緩沖液洗3次，每次5min，DAB顯色后水洗，蘇木素復(fù)染后脫水、透明及中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并分析陽性表達的平均光密度值。

2.5.4 Western blot法檢測頸后肌組織IGF-1、MyoD、PI3K、Akt蛋白表達 取50mg組織，研磨分裝于離心管中，加入250 μL的RIPA裂解液勻漿（使用前5min加入蛋白酶抑制劑），4 ℃過夜裂解，提取蛋白。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，加入蛋白樣品及裂解液，輕輕混合后95 ℃變性10min。制備SDS-PAGE凝膠，依次進行蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)移膜置于封閉液中，封閉后的膜放入一抗中，4 ℃孵育過夜（β-actin 1∶3000，P-PI3K 1∶800，P-Akt 1∶400，IGF-1 1∶1000，MyoD 1∶500），將反應(yīng)膜放入平皿中洗膜，放入二抗工作液中孵育90min（山羊抗兔1∶3000、山羊抗鼠1∶3000），顯色曝光，膠片掃描后，用Image J軟件測定條帶灰度值，進行定量分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗及方差齊性檢驗后，均符合正態(tài)分布且方差齊，結(jié)果以（±s）表示，多組間樣本比較用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 造模兔與空白組兔一般情況比較 兔造模前期與空白組相比，較煩躁，易激惹，不易抓取，造模后期出現(xiàn)精神倦怠、蜷縮少動、飲食飲水減少等表現(xiàn)。觸碰造模兔頸部時，表現(xiàn)為精神緊張、易躲閃，頸部肌肉較僵硬，可觸及條索狀物。

3.2 空白組與模型組兔頸后肌組織形態(tài)學(xué)比較 如圖1所示，細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈紅色?？瞻捉M兔頸后肌組織可見肌纖維排列整齊，細(xì)胞核呈卵圓形，形態(tài)規(guī)則，無組織水腫及炎性浸潤；模型組兔頸后肌組織肌纖維扭曲變形，排列紊亂，肌間隙寬窄不一，可見大量炎性物質(zhì)滲出。結(jié)果顯示骨骼肌靜力性損傷形成，提示造模成功。

圖1 空白組與模型組兔頸后肌組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（HE染色）

3.3 IHC法觀察各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD表達 如圖2、圖3所示，細(xì)胞核染色為藍(lán)色，IGF-1、MyoD陽性表達為棕黃色。空白組細(xì)胞核分布均勻，棕黃色范圍較?。荒Ｐ徒M棕黃色范圍顯著增加。模型對照組觀察10d時可見肌間隙明顯增寬，見染色不均，說明只出現(xiàn)了部分IGF-1、MyoD陽性表達；手法治療組干預(yù)10d時可見肌間隙明顯增寬，大范圍棕黃色分布，此時IGF-1、MyoD陽性表達較高。模型對照組觀察20d時可見局部肌纖維增寬，棕黃色面積較10d前減少，散在分布，著色不均；手法治療組干預(yù)20d時可見肌間隙變小，IGF-1棕黃色分布面積較治療10d時減少，MyoD棕黃色呈散在分布。模型對照組觀察30d時染色部分變少，細(xì)胞核分布逐漸均勻，但仍有局部聚集；手法治療組干預(yù)30d時細(xì)胞核分布均勻，棕黃色染色基本消失。

圖2 各組兔頸后肌組織IGF-1陽性表達（IHC法，×200）

圖3 各組兔頸后肌組織MyoD陽性表達（IHC法，×200）

如表1所示，與空白組比較，模型組兔頸后肌組織IGF-1與MyoD表達量均顯著升高（P＜0.05）；與模型對照組同一觀察時點比較，手法治療組干預(yù)10d、20d時IGF-1表達量均顯著升高（P＜0.05），干預(yù)10d時MyoD表達量顯著升高（P＜0.05）；隨著觀察/干預(yù)時間的延長，模型對照組和手法治療組IGF-1和MyoD表達量均逐漸降低，均以觀察/干預(yù)10d時表達量最高。

表1 各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD表達比較（±s，IHC法）

表1 各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD表達比較（±s，IHC法）

注： 與空白組比較，*P＜0.05；與手法治療組（10 d）比較，#P＜0.05；與手法治療組（20 d）比較，△P＜0.05。

組別（觀察/干預(yù)期）動物數(shù)/只 IGF-1 MyoD空白組 3 0.003±0.002 0.002±0.000模型組 5 0.079±0.025* 0.017±0.003*模型對照組（10d） 5 0.075±0.018# 0.019±0.004#模型對照組（20d） 5 0.035±0.011△ 0.011±0.007模型對照組（30d） 5 0.031±0.021 0.006±0.003手法治療組（10d） 5 0.176±0.023 0.084±0.018手法治療組（20d） 5 0.100±0.022# 0.021±0.006#手法治療組（30d） 5 0.038±0.014#△0.005±0.003#△

3.4 Western blot法觀察各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表達 結(jié)果見表2、圖4。模型組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表達量均顯著高于空白組（P＜0.05）；手法治療組干預(yù)10d、20d時IGF-1、MyoD蛋白表達量均顯著高于同時期模型對照組（P＜0.05），手法治療組干預(yù)30d時IGF-1、MyoD蛋白表達量顯著低于同時期模型對照組（P＜0.05）；手法治療組干預(yù)10d、20d、30d時P-PI3K、P-Akt蛋白表達量均顯著高于同時期模型對照組（P＜0.05）。

圖4 Western blot法檢測各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表達量

表2 各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表達比較（±s，Western blot法）

表2 各組兔頸后肌組織IGF-1、MyoD、P-PI3K、P-Akt蛋白表達比較（±s，Western blot法）

注： 與空白組比較，*P＜0.05；與手法治療組（10 d）比較，#P＜0.05；與手法治療組（20 d）比較，△P＜0.05；與手法治療組（30 d）比較，☆P＜0.05。

組別（觀察/干預(yù)期）動物數(shù)/只 IGF-1 MyoD P-PI3K P-Akt空白組 3 0.214±0.026 0.391±0.025 0.234±0.026 0.215±0.028模型組 5 0.817±0.042* 1.245±0.052* 0.789±0.067* 0.660±0.028*模型對照組（10d） 5 0.699±0.028# 0.997±0.005# 0.688±0.048# 0.623±0.033#模型對照組（20d） 5 0.603±0.065△ 0.901±0.026△ 0.549±0.036△ 0.488±0.027△模型對照組（30d） 5 0.435±0.017☆ 0.756±0.041☆ 0.472±0.037☆ 0.377±0.042☆手法治療組（10d） 5 0.941±0.068 1.485±0.059 0.912±0.086 0.743±0.066手法治療組（20d） 5 0.822±0.050# 1.163±0.037# 1.002±0.098 0.769±0.050手法治療組（30d） 5 0.354±0.028#△ 0.690±0.025#△ 0.726±0.108#△ 0.578±0.021#△

隨著觀察/干預(yù)時間的延長，模型對照組和手法治療組IGF-1和MyoD蛋白表達量均逐漸降低，均以觀察/干預(yù)10d時表達量最高。隨著觀察/干預(yù)時間的延長，模型對照組P-PI3K、P-Akt蛋白表達量逐漸降低，而手法治療組P-PI3K、P-Akt蛋白表達量呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢。

4 討論

《靈樞·刺節(jié)真邪》中提道：“一經(jīng)上實下虛而不通者，此必有橫絡(luò)盛加于大經(jīng)，令之不通，視而瀉之，此所謂解結(jié)也?！盵9]此處“橫絡(luò)”可理解為經(jīng)筋走行上出現(xiàn)的局部條索狀的肌索及結(jié)節(jié)，“解結(jié)”則是針對“橫絡(luò)”的治療方法，即松解“橫絡(luò)”對經(jīng)脈、關(guān)節(jié)的卡壓[10]。我們臨床通過松解肌筋、理筋止痛、正骨順筋的方式，治療頸部筋傷疾病，獲得了較好的療效。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，理筋手法中常用的松法、撥法、順法三種手法，廣泛應(yīng)用于臨床且療效顯著[11]，故設(shè)計本研究以探討理筋手法治療靜力性損傷的作用機制。

本研究通過建立兔頸部前屈靜力性損傷模型，觀察理筋手法對頸后肌PI3K-Akt信號通路相關(guān)因子表達以及IGF-1、MyoD蛋白表達的影響。骨骼肌損傷后，炎性細(xì)胞浸潤增多，處于靜息狀態(tài)的肌衛(wèi)星細(xì)胞在生長因子和其他信號蛋白的作用下開始活化，遷移到損傷部位進行增殖，分化的肌衛(wèi)星細(xì)胞形成新生肌管，與原有肌纖維融合或形成新的肌纖維，修復(fù)受損骨骼肌[12-14]。

IGF-1是一種蛋白多肽，可以促進蛋白質(zhì)的合成，有效刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖，增加細(xì)胞核數(shù)量，刺激肌纖維分化成熟[15]。骨骼肌損傷后在肌衛(wèi)星細(xì)胞的不同階段，肌衛(wèi)星細(xì)胞、成肌細(xì)胞和肌管都會分泌IGF-1，IGF-1對肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖具有促進作用[16]。骨骼肌損傷后IGF-1合成和分泌增加，在細(xì)胞表面結(jié)合受體IGF-1R[17]，受體構(gòu)象發(fā)生改變，激活酪氨酸活性和自身磷酸化，作用于胰島素受體 底 物-1（IRS-1）[18]。IRS-1通過其結(jié)構(gòu)域與受體結(jié)合后被磷酸化，激活PI3K，從而導(dǎo)致質(zhì)膜內(nèi)磷脂的生成，使Akt磷酸化，致mTOR和p70S6激酶（p70S6K）的激活[19]。該通路的激活提高下游基因的轉(zhuǎn)錄水平，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成增加，刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，促進肌細(xì)胞分化，恢復(fù)肌細(xì)胞增殖與凋亡的平衡狀態(tài)，加速骨骼肌修復(fù)[20]。MRFs基因家族的四種轉(zhuǎn)錄基因相互作用調(diào)控，共同促進肌細(xì)胞的生成，調(diào)控肌肉組織的生長發(fā)育[19]。成肌調(diào)節(jié)因子之一的MyoD主要在活化的肌衛(wèi)星細(xì)胞中表達，使未分化和已分化的細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞，促進肌細(xì)胞融合形成肌管，是肌衛(wèi)星細(xì)胞激活和增殖的標(biāo)志[21]。細(xì)胞轉(zhuǎn)錄抑制因子抑制素2（PHB2）能抑制MyoD所依賴的基因轉(zhuǎn)錄，從而降低肌分化，Akt能抑制MyoD與PHB2的結(jié)合，這可能是Akt介導(dǎo)MyoD激活和促進肌分化的機制之一[22]。

本研究結(jié)果顯示，骨骼肌損傷形成后，局部肌肉中IGF-1和MyoD蛋白表達量較空白組明顯升高（P＜0.05），說明此時肌衛(wèi)星細(xì)胞開始激活。手法治療組各觀察時點兔頸后肌組織P-PI3K、P-Akt表達量均顯著高于同時期模型對照組（P＜0.05），說明理筋手法作用于PI3K-Akt信號通路。手法治療組干預(yù)10d時頸后肌組織IGF-1和MyoD蛋白表達量達到最高（P＜0.05），可能肌衛(wèi)星細(xì)胞此時高度增殖。隨后，IGF-1通過級聯(lián)反應(yīng)向PI3K-Akt信號通路傳導(dǎo)刺激信號，所以手法治療組干預(yù)10d、20d時頸后肌組織P-PI3K、P-Akt表達量顯著高于干預(yù)30d時（P＜0.05），但干預(yù)10d、20d兩個時點上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明手法干預(yù)10d、20d時，頸后肌組織P-PI3K、P-Akt表達量顯著升高，促進肌蛋白合成。手法治療組干預(yù)20d時頸后肌組織IGF-1和MyoD蛋白表達量較干預(yù)10d時明顯降低（P＜0.05），且免疫組織化學(xué)法檢測可見陽性細(xì)胞核已轉(zhuǎn)至新生細(xì)胞核附近表達，說明此時肌衛(wèi)星細(xì)胞由增殖開始進入分化階段，形成新生肌管，融合成肌纖維，促進骨骼肌的修復(fù)。手法治療組各觀察時點比較發(fā)現(xiàn)，干預(yù)30d時頸后肌組織MyoD陽性表達最低，說明此時肌衛(wèi)星細(xì)胞基本分化成熟，重新回到靜息狀態(tài)，骨骼肌修復(fù)及重塑已基本完成。

綜上，理筋手法可通過調(diào)控MyoD的表達量，加快激活肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化出成肌細(xì)胞，同時介導(dǎo)IGF-1激活PI3K-Akt信號通路，促進損傷部位成肌細(xì)胞進一步分化融合，向損傷部位遷移，形成新的肌管修復(fù)肌組織損傷。骨骼肌損傷與修復(fù)的作用機制較為復(fù)雜，涉及多個信號通路，且相互之間交叉影響，因此后期還需進一步深入探索理筋手法對Wnt信號通路、FOXO3信號通路等的影響，以及研究肌細(xì)胞骨架蛋白相關(guān)機制等，為臨床治療提供基礎(chǔ)理論指導(dǎo)。