許虹，李琳，2，3，潘桂湘，李玉紅，2，3

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.組分中藥國家重點實驗室，天津 301617；3.天津市中藥藥理學重點實驗室，天津 301617；4.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300250）

糖尿病心肌?。―CM）是一種獨立于高血壓、冠心病、瓣膜病及先天性心臟病的心臟疾病，與糖尿病患者心力衰竭的高發(fā)病率和高病死率密切相關[1]。臨床上DCM早期以左心室肥厚和舒張功能受損為主要特征[2]。在糖尿病患者中，大量的代謝改變參與了心肌功能障礙的病理過程。心肌細胞能量代謝紊亂是DCM發(fā)展的機制之一，葡萄糖和脂肪酸代謝失衡通過多條信號通路促進心肌細胞肥大[3]。持續(xù)的失代償性的心肌肥大不斷加重心臟負擔，成為糖尿病心肌病患者晚期發(fā)展為心力衰竭的原因之一[4]。盡管DCM的發(fā)病機制和臨床特點在過去的幾十年中得到了廣泛的研究，但有效的預防和治療方法仍有待進一步探索。

葛根素（Puerarin）是從豆科植物野葛的干燥根中提取的異黃酮類化合物[5]，是中藥葛根的主要活性成分。葛根素注射劑已被列入中國藥典作為血管擴張劑使用?，F(xiàn)代藥理學研究表明，葛根素具有抑制晚期糖基化終產物形成、抑制炎癥、降低氧化應激、降低血糖、改善胰島素抵抗、保護胰島等藥理作用[6]。除了對糖尿病的治療作用外，葛根素及其制劑在改善DCM中的作用也得到了關注。Yin等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在鏈脲霉素誘導的糖尿病大鼠和高糖損傷的H9c2心肌細胞中，葛根素通過抑制炎癥相關因子的產生發(fā)揮心臟保護作用。此外，黃芪注射液與葛根素注射液聯(lián)合應用可保護2型糖尿病小鼠心肌細胞超微結構，抑制內質網應激，減少心肌細胞凋亡[8-9]。這些研究結果提示葛根素對糖尿病心肌病可能有較好的治療潛力，但葛根素對高糖誘導的心肌細胞肥大是否具有干預作用尚無報道。因此，本研究通過高糖損傷H9c2大鼠心肌細胞體外建立高糖損傷心肌細胞模型，從心肌肥大角度初步探討葛根素對H9c2大鼠心肌細胞的保護作用及潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑 大鼠H9c2心肌細胞購自美國ATCC；葛根素購自上海源葉生物科技有限公司（純度≥98%，批號B20446）；低糖DMEM購自以色列Biological Industries公司；胎牛血清與胰蛋白酶購自美國Gibco公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；D-葡萄糖、甘露醇購自美國Sigma公司；AMP活化蛋白激酶α（AMPKα）抗體、磷酸化 AMPKα（p-AMPKα）抗體、絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）抗體、磷酸化Akt（p-Akt）抗體、糖原合成激酶 3β（GSK-3β）抗體、磷酸化 GSK-3β（p-GSK-3β）抗體、Sigma-1受體（Sig-1R）抗體以及山羊抗兔免疫球蛋白G二抗購自美國Cell Signaling Technology公司；β-肌球蛋白重鏈（β-MHC）抗體購自英國 Abcam 公司；1，4，5－三磷酸 2 型受體（IP3R2）抗體、β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽購自美國Cytoskeleton公司。

1.2 儀器 HF240型二氧化碳培養(yǎng)箱（中國力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；Infinite F50型酶標儀（瑞士Tecan公司）；Powerpac型電泳儀（美國BIORAD公司）；INCell 2000型高內涵細胞分析儀、Amersham Imager 600型超靈敏多功能成像儀（美國General Electric公司）。

1.3 方法

1.3.1 H9c2心肌細胞培養(yǎng) 使用添加10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中對H9c2心肌細胞進行常規(guī)培養(yǎng)，當培養(yǎng)瓶中的細胞融合至70%～80%時，用含0．25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰酶消化細胞，按1∶2的比例傳代，根據(jù)細胞的生長情況，每2～3 d進行傳代，取對數(shù)生長期生長良好的細胞用于實驗。

1.3.2 給藥與分組 DCM細胞模型的建立：將H9c2心肌細胞以3×104個/mL接種于6孔板中，每孔3mL，隨機分為正常對照（NG）組、低糖模型（LG）組、高糖模型（HG）組、低甘露醇（LM）組、高甘露醇（HM）組。NG、LG、HG 組分別采用 5．6、33、44 mmol/L 葡萄糖處理，LM 組采用 5．6 mmol/L 葡萄糖+27．4 mmol/L 甘露醇處理，HM 組采用 5．6 mmol/L 葡萄糖+38．4 mmol/L甘露醇處理，均處理48 h。

葛根素心肌細胞保護作用：根據(jù)相關蛋白表達情況，選擇葡萄糖濃度為44 mmol/L為高糖損傷模型濃度進行后續(xù)實驗，分為NG組、HG組、HM組、低劑量給藥（HG+PUE-Ⅰ）組、高劑量給藥（HG+PUE-Ⅱ）組。NG、HG 組分別采用 5．6、44 mmol/L 葡萄糖處理，HM組采用 5．6 mmol/L 葡萄糖+38．4 mmol/L 甘露醇處理，HG+PUE-Ⅰ、HG+PUE-Ⅱ組分別采用44 mmol/L葡萄糖+5、20 μmol/L葛根素干預，均干預 48 h。

1.3.3 細胞表面積染色 將H9c2心肌細胞接種于96孔板中，用4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min，然后用0．1%TritonX-100孵育5 min，用羅丹明標記的鬼筆環(huán)染色20 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）緩慢沖洗細胞 3 次，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）孵育細胞10 min，PBS緩慢沖洗細胞3次，使用高內涵細胞分析儀采集圖像，參考文獻[10]方法計算細胞的表面積，每孔選擇4個觀察視野，隨機選取60個心肌細胞，使用Image J軟件進行定量分析。

1.3.4 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測蛋白的表達 收集6孔板中的H9c2細胞，加入細胞裂解液靜置20 min，離心后取上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。所得樣品進行SDS凝膠電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉，加入對應一抗抗體4℃孵育過夜，TBST洗滌后，加入相應種屬二抗抗體室溫孵育1．5 h。再用TBST洗滌，ECL試劑浸潤后，使用超靈敏多功能成像儀成像。Image J、Gelpro32軟件對蛋白條帶進行分析計算蛋白的相對表達水平。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26．0軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用LSD法。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度葡萄糖對H9c2心肌細胞表面積的影響 分別采用33 mmol/L和44 mmol/L葡萄糖處理H9c2心肌細胞48 h，模擬機體高糖環(huán)境對心肌細胞的損傷。細胞表面積增加是細胞肥大的特征之一[11]，故采用羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽對細胞骨架進行染色并對H9c2心肌細胞表面積進行分析。由圖1可見，與NG組相比，44 mmol/L葡萄糖處理后心肌細胞表面積增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0．01），而33 mmol/L葡萄糖不影響心肌細胞表面積。此外，為了排除高糖引起的滲透壓增高對心肌細胞的影響，實驗設置了33、44 mmol/L的甘露醇等滲對照組，結果顯示，滲透壓增高不影響心肌細胞表面積。

圖1 葡萄糖對H9c2細胞表面積的影響（±s，n=3）Fig.1 Effect of glucose on surface area of H9c2 cell（±s，n=3）

2.2 不同濃度葡萄糖對H9c2心肌細胞β-MHC蛋白水平的影響 β-MHC是細胞肥大的生物標志物之一[11]。Western Blot法檢測β-MHC蛋白水平，如圖2所示，與NG組相比，44 mmol/L葡萄糖處理后心肌細胞β-MHC蛋白相對表達量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），而33 mmol/L葡萄糖不影響心肌細胞β-MHC蛋白相對表達量，且滲透壓增高不影響心肌細胞β-MHC蛋白水平。因此選擇44 mmol/L葡萄糖損傷心肌細胞48 h為后續(xù)葛根素藥效研究的細胞模型。

圖2 葡萄糖對H9c2細胞β-MHC蛋白表達的影響（±s，n=3）Fig.2 Effect of glucose on β-MHC expression in H9c2 cells（±s，n=3）

2.3 不同濃度葡萄糖對H9c2心肌細胞AMPKα和Akt蛋白磷酸化水平的影響 AMPK是細胞內重要的能量傳感器和能量穩(wěn)態(tài)調節(jié)器，可激活Akt調節(jié)細胞內的能量平衡，從而抑制心肌肥厚的發(fā)展[12-14]。如圖3A-B所示，與NG組相比，33、44mmol/L的甘露醇等滲對照組AMPKα與Akt磷酸化水平無明顯差異；與NG組相比，33 mmol/L葡萄糖不影響AMPKα磷酸化水平，44 mmol/L葡萄糖使AMPKα磷酸化水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與NG組相比，33 mmol/L或44 mmol/L葡萄糖均可使Akt磷酸化水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。上述結果表明，44 mmol/L葡萄糖可抑制H9c2心肌細胞AMPK和Akt磷酸化。

圖3 葡萄糖對H9c2細胞中AMPK、p-AMPK、Akt、p-Akt蛋白表達的影響（±s，n=3）Fig.3 Effect of glucose on AMPK，p-AMPK，Akt，p-Akt expression in H9c2 cells（±s，n=3）

2.4 葛根素對高糖誘導的H9c2心肌細胞肥大的影響 為了探索葛根素能否調節(jié)高糖誘導的心肌肥大，使用不同濃度的葛根素（5、20 μmmol/L）干預H9c2心肌細胞48 h。由圖4A可見，與NG組相比，HM組心肌細胞表面積增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與HM組相比，HG+PUE-Ⅰ組心肌細胞表面積有所降低，但無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；而HG+PUE-Ⅱ組能夠降低心肌細胞表面積，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。此外，Western Blot法檢測 β-MHC蛋白水平，如圖4B所示，HM組心肌細胞β-MHC蛋白水平高于NG組，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01），與HM組相比，HG+PUE-Ⅰ組心肌細胞β-MHC蛋白相對表達量有所降低，但無統(tǒng)計學差異（P>0.05）；而HG+PUE-Ⅱ組心肌細胞β-MHC蛋白相對表達量降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

圖4 葛根素對高糖誘導H9c2心肌細胞肥大的影響（±s，n=3）Fig.4 Effect of puerarin on hypertrophy of H9c2 cardiomyocytes induced by high glucose（±s，n=3）

2.5 葛根素對高糖誘導的H9c2心肌細胞AMPK、Akt和GSK-3β蛋白磷酸化水平、IP3R2和Sig-1R蛋白水平的影響 為了進一步研究葛根素如何減輕高糖誘導的H9c2心肌細胞肥大，檢測了與心肌肥大相關的AMPK、Akt、GSK-3β蛋白磷酸化水平以及IP3R2和Sig-1R蛋白水平。如圖5A-C所示，與NG組相比，HG組心肌細胞AMPKα和Akt磷酸化水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。與HG組相比，HG+PUE-Ⅰ組心肌細胞AMPKα和GSK-3β磷酸化水平升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）、Akt磷酸化水平無統(tǒng)計學差異（P<0.05）；而HG+PUE-Ⅱ組 AMPKα、p-Akt和 GSK-3β 磷酸化水平均升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。此外，由圖5D、E可見，與HG組相比，HG組IP3R2和Sig-1R蛋白相對表達量升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而葛根素對IP3R2、Sig-1R蛋白相對表達量沒有明顯影響。以上結果說明，葛根素可通過激活心肌細胞AMPK和Akt、抑制GSK-3β的活性，抑制心肌細胞肥大。

圖5 葛根素對高糖損傷的 H9c2 細胞 AMPK、p-AMPK、Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK3β、IP3R2、Sig-1R 蛋白表達的影響（±s，n=3）Fig.5 Effect of puerarin on AMPK，p-AMPK，Akt，p-Akt，GSK-3β，p-GSK-3β，IP3R2，Sig-1R expression in HG-injured H9c2 cells（±s，n=3）

3 討論

高血糖誘發(fā)的能量代謝紊亂引起心臟結構和功能損傷，導致心肌肥厚和心律失常，是糖尿病性心肌病發(fā)生的獨立危險因素。本研究在不同濃度的高糖刺激下觀察心肌細胞肥大情況，通過檢測細胞表面積和肥大關鍵蛋白β-MHC的水平，建立了高糖誘導的心肌細胞肥大模型。在此基礎上，發(fā)現(xiàn)葛根素能顯著下調β-MHC蛋白水平，抑制高糖誘導的心肌細胞肥大。

AMPK是調節(jié)糖尿病心臟代謝的關鍵蛋白。在糖尿病心肌病的發(fā)展過程中，AMPK對心臟代謝異常起到調節(jié)葡萄糖利用、改善線粒體鈣離子（Ca2+）轉運、減輕線粒體功能障礙、抑制心肌肥厚和纖維化等有益作用[15]。AMPK通過影響Akt活化調節(jié)心肌肥厚和心肌收縮功能。Akt能夠介導下游靶蛋白GSK-3β磷酸化，抑制GSK-3β的活性[16-17]。已有文獻報道，小檗堿可通過激活AMPK和Akt、抑制GSK-3β活化，減輕棕櫚酸酯誘導的H9c2心肌細胞肥大；一旦采用AMPK抑制劑阻斷AMPK后，Akt/GSK-3β信號通路蛋白磷酸化程度也受到抑制，并減弱小檗堿的抗心肌肥大作用[13]。此外，Al-Damry等[14]研究發(fā)現(xiàn)抗糖尿病藥物西格列汀可提高糖尿病大鼠心臟中AMPK和Akt磷酸化水平，使GSK-3β失活，從而緩解糖尿病時高糖誘導的心肌細胞凋亡和肥厚。因此，AMPK/Akt/GSK-3β信號通路是緩解糖尿病性心肌病過程中出現(xiàn)的心肌肥大的重要調控機制。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖抑制心肌細胞AMPK和Akt的蛋白磷酸化，而葛根素能夠促進AMPK和Akt的磷酸化修飾，并增加GSK-3β蛋白的磷酸化水平，提示葛根素可能通過激活AMPK/Akt/GSK-3β信號通路發(fā)揮抗心肌肥大作用。

圖6 葛根素通過激活AMPK/Akt/GSK-3β信號通路抑制高糖誘導的H9c2細胞肥大Fig.6 Puerarin inhibits hypertrophy of H9c2 cells induced by high glucose through activating AMPK/Akt/GSK-3β signaling pathway

研究顯示，心臟Ca2+信號的變化是誘發(fā)心肌肥厚的因素之一[18]。IP3R2是位于內質網的Ca2+釋放通道，介導細胞質Ca2+濃度的上升。有研究發(fā)現(xiàn)高表達IP3R2的轉基因小鼠表現(xiàn)出心肌肥厚，而低表達IP3R2的轉基因小鼠，經主動脈縮窄刺激2周后心肌肥厚的程度并沒有增加[19]。此外，位于線粒體內質網相關膜結構上的Sig-1R同樣參與調節(jié)細胞內鈣穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)，壓力過載及血管緊張素II誘導的心肌肥厚模型中Sig-1R水平顯著降低，而Sig-1R激動劑不僅恢復了Sig-1R的mRNA和蛋白的表達，而且減輕了心肌肥厚[20-21]。因此，研究對IP3R2和Sig-1R蛋白水平進行了檢測。筆者發(fā)現(xiàn)高糖刺激的肥大的心肌細胞內IP3R2和Sig-1R蛋白水平均升高，而但葛根素對它們沒有顯著影響。說明葛根素對肥大心肌的抑制作用與調節(jié)IP3R2和Sig-1R蛋白無關。

綜上所述，葛根素可能通過激活AMPK/Akt/GSK-3β信號通路減輕高糖誘導的心肌細胞肥大，并可能在糖尿病心肌病中發(fā)揮治療作用。