靳玉麗,谷田田,柳 洪,安調(diào)過

(中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所農(nóng)業(yè)資源研究中心 石家莊 050022)

小麥(L.)是世界上最重要的糧食作物之一,養(yǎng)活了超過1/3 的人口。作為世界上最大的小麥生產(chǎn)國和消費國,小麥的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)對保障我國糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重大現(xiàn)實和戰(zhàn)略意義。由布氏白粉病菌(f.sp.,)引起的白粉病是影響小麥產(chǎn)量最嚴(yán)重的病害之一,小麥病蟲害造成的產(chǎn)量損失中5%是由小麥白粉病造成的。近十年,我國小麥白粉病發(fā)病面積每年在667 萬hm以上,造成年均損失產(chǎn)量約1000 萬t,嚴(yán)重威脅我國小麥的安全生產(chǎn)(https://www.natesc.org.cn)。

1930年,澳大利亞科學(xué)家Waterhouse 首次報道了來自小麥品種‘Thew’的顯性抗白粉病基因。截至目前,已鑒定出68 個正式命名的小麥抗白粉病基因,分布于63 個位點(,和是等位基因,=,=,=,=),主要來自小麥的農(nóng)家品種、育成品種、近緣屬種以及小麥的祖先種。隨著測序技術(shù)的不斷發(fā)展及參考基因組的不斷完善,目前已有13個小麥抗白粉病基因相繼被克隆,包括、、、、、、、、、、、和。其中,和為成株抗性基因,其余均表現(xiàn)為全生育期小種?；剐?。、、、、及在我國已部分或完全喪失抗性;來源于簇毛麥(),主要分布在西南和長江中下游麥區(qū)的育成品種中,在黃淮小麥主產(chǎn)區(qū)大面積推廣的品種中較少;來源于農(nóng)家品種‘齒牙糙’,來源于野生二粒小麥(var.),來源于小麥A 基因組供體烏拉爾圖小麥(),這些來源于農(nóng)家品種和小麥近緣屬種的抗病基因多與不利性狀連鎖,無法直接作為小麥抗病育種親本使用,需要與小麥主栽品種進(jìn)行多代回交、自交,打破連鎖累贅后才能應(yīng)用于小麥育種;廣泛分布于我國乃至世界小麥種植區(qū),在育成品種、農(nóng)家品種、國外引進(jìn)品種和高代品系中均有發(fā)現(xiàn),其抗性表現(xiàn)優(yōu)異,農(nóng)藝性狀良好,被廣泛應(yīng)用于小麥抗白粉病育種。因此,本文將從以下幾個方面總結(jié)相關(guān)的最新研究進(jìn)展,以期為抗病機(jī)制的進(jìn)一步解析及其在生產(chǎn)上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 Pm2 定位的研究進(jìn)展

1.1 小麥抗白粉病基因Pm2 位點的發(fā)現(xiàn)

1953年,澳大利亞阿德萊德大學(xué)Pugsley 和澳大利亞聯(lián)邦科工組織Carter 利用兩個白粉菌菌株P(guān) 和P-1 對12 個小麥品種進(jìn)行抗性鑒定,根據(jù)其反應(yīng)型差異,將這12 個小麥品種分成了3 個類群。在此基礎(chǔ)上,通過對不同類群的品種間雜交后代進(jìn)行遺傳分析,明確了其中8 個品種‘Axminster’ ‘Thew’‘Kenya C6041’ ‘Bridproof’ ‘Converse’ ‘Norka’ ‘Normandie’和‘Huron’為第一類群,它們均含有相同的抗白粉病基因,后被正式命名為; 來自美國北達(dá)科塔州的小麥品種‘Ulka’(當(dāng)?shù)剞r(nóng)民從俄羅斯引進(jìn)的農(nóng)家品種)為第2 類群,其攜帶的抗白粉病基因為,后被正式命名為; 第3 類群包括品種‘Sonora’ ‘Indian’和‘Sturgeon’,含有相同的抗白粉病基因,后被正式命名為。1970年,澳大利亞悉尼大學(xué)McIntosh 和Baker 利用單體系分析將‘Ulka’中的基因定位于小麥5DS 染色體上近著絲粒的位置。

1.2 Pm2 的分子標(biāo)記定位

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展,越來越多的標(biāo)記被應(yīng)用于的定位。1994年,Ma 等利用感白粉病的‘Chancellor’與‘Ulka/8*Cc’(CI14118)雜交構(gòu)建的F分離群體進(jìn)行分子標(biāo)記定位,發(fā)現(xiàn)與5DS 上的RFLP 標(biāo)記連鎖,遺傳距離為3.5 cM。隨后,Qiu 等利用‘中國春’與‘CI14118’雜交構(gòu)建的包含814 個F單株的分離群體,通過集群分離分析法(bulk segregant analysis,BSA)篩選獲得了3 個與連鎖的SSR 標(biāo)記、和,與的遺傳距離分別為2.0 cM、34.2 cM和44.2 cM。

2 Pm2 等位基因的發(fā)掘

從發(fā)現(xiàn)至今,已從育成品種、農(nóng)家品種、引進(jìn)品種、小麥品系等各類小麥材料中發(fā)掘出多個的等位基因。趙軍發(fā)現(xiàn)北美硬紅春小麥品種‘Grandin’攜帶基因,距兩側(cè)分子標(biāo)記和的遺傳距離分別為0.9 cM 和3.3 cM。引自英國的小麥品種‘Brock’對我國小麥白粉病菌多年表現(xiàn)良好的抗性,李根橋等將其抗白粉病基因定位于分子標(biāo)記和之間,標(biāo)記和與抗病基因共分離,推斷該抗白粉病基因為。隨后,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所李洪杰實驗室將小麥品種‘良星66’ ‘汶農(nóng)14’和‘中麥155’攜帶的抗白粉病基因、和均定位于5DS 染色體上,與分子標(biāo)記和緊密連鎖。Sun 等通過等位性測試明確了和與位于同一位點,并根據(jù)它們與基因?qū)?0 個不同白粉病菌株的抗性差異,推斷和可能是位點的新等位基因。李丹等將小麥品種‘農(nóng)大399’中的抗白粉病基因定位于小麥染色體5DS Bin 0.67～0.78 區(qū)間,根據(jù)其定位區(qū)間,推測是。小麥品系DH155 對白粉病菌表現(xiàn)高抗,管昌英等將其攜帶的抗白粉病基因定位于標(biāo)記和之間,遺傳距離分別為0.2 cM 和0.8 cM,抗譜分析結(jié)果表明可能是或其等位基因。

本實驗室利用采集于不同地區(qū)的小麥白粉病菌株對5000 余份包括小麥育成品種、高代品系、農(nóng)家品種、國外引進(jìn)品種、近緣種和人工合成麥等不同類型的小麥種質(zhì)資源進(jìn)行了系統(tǒng)的抗病性鑒定,通過遺傳分析、分子標(biāo)記定位等手段從中發(fā)掘出了一系列的新等位基因,這些攜帶等位基因的材料對不同毒力的白粉病菌株均具有特異的抗譜,且大部分具有廣譜抗性。同時,結(jié)合不同地區(qū)來源的白粉病菌株的抗譜分析和農(nóng)藝性狀評價,對這些攜帶等位基因的材料進(jìn)行了系統(tǒng)的育種價值分析,篩選出了一批具有重要育種價值的廣譜抗病材料。其中,KM2939 是一個多花多粒的小麥-冰草[(L.) Gaertn]育種新品系,對小麥白粉病具有廣譜抗性,苗期對供試的50 個白粉病菌株中的48 個表現(xiàn)抗性,遺傳分析表明其抗性由單個顯性抗白粉病基因控制。利用分子標(biāo)記將該基因定位于小麥5DS 染色體上,與兩側(cè)標(biāo)記和的遺傳距離分別為0.5 cM 和1.3 cM?？棺V分析和等位性測試結(jié)果表明,為位點的一個新等位基因,由國際小麥基因命名委員會正式定名為。與此同時,在我國小麥農(nóng)家品種‘鳥麥’中也鑒定到一個定位于5DS 染色體相同區(qū)段的抗白粉病基因,抗譜分析和等位性測試結(jié)果表明是位點的另一等位基因,正式定名為。此外,在小麥育成品種‘嬰泊700’、育成品系萬豐鑒34、10V-2、X3986-2,國外引進(jìn)新品系FG-1 和Subtil 中均鑒定到定位于5DS 上的抗白粉病基因,抗譜分析和等位性測試結(jié)果表明,它們均是位點新的等位基因。本實驗室發(fā)掘的這些攜帶等位基因的材料對不同毒性的白粉病菌株具有特異抗譜,且差異明顯,極大地豐富了基因的遺傳多樣性。

3 Pm2 克隆的研究進(jìn)展

被廣泛應(yīng)用于小麥抗白粉病育種,克隆對明確該位點遺傳和基因組特征、解析其抗病機(jī)制具有重要的意義。Sáchez-Martín 等通過Mut-ChromSeq(Mutant chromosome sequencing)的策略快速克隆了小麥抗白粉病基因。他們首先利用甲基磺酸乙酯(ethylmethylsulfone,EMS)處理基因的載體品種‘Ulka’,獲得了12 個感病突變體。在此基礎(chǔ)上,對其中的6 個突變體進(jìn)行染色體分揀、測序和組裝,找到了2 個長度大于1 kb 且含有NBSLRR(NLR)序列的候選Contig。其中一個與野生型‘Ulka’相比,存在大量的單核苷酸變異(Single Nucleotide Variation,SNV),可能是錯誤的組裝所致; 另一個10 kb 的contig 含有一個全長的NLR 基因,并通過PCR 擴(kuò)增和測序進(jìn)行了驗證。隨后,利用基于該基因序列開發(fā)的PCR 標(biāo)記在80 個感病F單株中擴(kuò)增發(fā)現(xiàn),該標(biāo)記與共分離。對其他6 個感病突變體中該NLR 基因進(jìn)行擴(kuò)增測序的結(jié)果也證實了這個contig 中含有的基因是。

Chen 等通過對小麥品系CH1357 的抗白粉病基因進(jìn)行精細(xì)定位,發(fā)現(xiàn)與基因具有等位關(guān)系,利用2252 個Taichung29/CH1357 的F家系并結(jié)合90K Illumina SNP 芯片測序技術(shù)將定位于標(biāo)記和之間,對應(yīng)‘中國春’參考基因組(Ref V1.0)5DS 染色體上525.64 kb 的物理區(qū)間,該目標(biāo)區(qū)間僅包含1 個基因,編碼典型的CCNBS-LRR 蛋白。同時,本實驗室利用的載體材料KM2939 與感病品種雜交構(gòu)建遺傳分離群體并結(jié)合混池轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)(BSA-RNA sequencing,BSR-seq)分析克隆了。序列分析發(fā)現(xiàn),與及具有完全一致的基因序列,為同一個基因。

4 Pm2 功能標(biāo)記的開發(fā)及單倍型分析

4.1 功能標(biāo)記的開發(fā)及應(yīng)用

通過分析在抗病材料‘Ulka’、CH1357 和KM2939 與感病材料‘中國春’和Taichung29 中的序列變異,發(fā)現(xiàn)感病材料中的等位基因第一個外顯子上含有一個7 bp 的序列缺失,導(dǎo)致所編碼的蛋白出現(xiàn)了提前終止,缺失了大部分的NBS 和全部的LRR 結(jié)構(gòu)域。根據(jù)該7 bp 缺失,開發(fā)了功能標(biāo)記TaPm2、JS322/JS362和Pm2b-map-3,它們均可用于基因的分子標(biāo)記檢測。Chen 等利用的功能標(biāo)記TaPm2 檢測了261 份中國小麥微核心種質(zhì),164 份小麥育成品種以及70 份美國小麥品種,發(fā)現(xiàn)分別有3 份、6 份和1 份材料攜帶抗白粉病基因。 Manser 等利用的功能標(biāo)記JS322/JS362 檢測了487 份普通小麥和150 份粗山羊草()材料,在48 份普通小麥材料和28 份粗山羊草材料中檢測到了。Jin 等利用的功能標(biāo)記Pm2b-map-3 檢測了659 份小麥材料,發(fā)現(xiàn)393 份均攜帶。功能標(biāo)記的開發(fā)促進(jìn)了在分子標(biāo)記輔助選擇抗病育種中的應(yīng)用。

4.2 單倍型分析

研究發(fā)現(xiàn)位點存在多個等位基因。Chen等根據(jù)已克隆的基因序列,設(shè)計引物并擴(kuò)增了抗譜存在顯著差異的等位基因、和,發(fā)現(xiàn)它們具有與一致的序列。Manser 等對76 份攜帶的材料進(jìn)行序列分析,發(fā)現(xiàn)來源于六倍體小麥的48 份材料的基因序列與完全一致,因此推測在六倍體小麥基因池中僅存在一種抗病單倍型; 在28 份粗山羊草中發(fā)現(xiàn)了7 個新的等位變異,即-,其中,、、、和相似性較高,僅分別存在2、6、3 和4 個氨基酸的變異,、、與相比差異較大,且氨基酸變異主要發(fā)生在LRR 結(jié)構(gòu)域。

5 Pm2 無毒基因的克隆及單倍型分析

禾谷類白粉菌與其寄主之間的互作符合“基因?qū)颉奔僬f。在寄主中存在編碼免疫受體的基因,它們大多屬于保守的NLR 蛋白家族,具有識別和啟動下游防衛(wèi)反應(yīng)的功能。而在病原菌中存在有與基因相對應(yīng)的無毒基因,它們的編碼產(chǎn)物能直接或間接與R 蛋白互作,激活寄主抗病反應(yīng),達(dá)到防御病害的目的。

5.1 AvrPm2 的克隆

Praz 等通過遺傳作圖和關(guān)聯(lián)分析相結(jié)合的手段克隆了對應(yīng)的無毒基因。將白粉病菌株96224(無毒)和JIW2(有毒)雜交,構(gòu)建了遺傳分離群體,利用的近等基因系Ulka/8*Chancellor、Federation*4/Ulka 和CI12632/8*Chancellor 群體進(jìn)行表型鑒定; 同時利用12 個有毒和30 個無毒的小麥白粉病菌株及18 個小黑麥()白粉病菌株的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析,克隆了無毒基因,并利用煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)證明了能夠與特異識別并引起寄主的過敏性壞死反應(yīng),從而確認(rèn)了為與對應(yīng)的無毒基因。

5.2 AvrPm2 的功能解析

Praz 等在的無毒菌株96224 基因組中,發(fā)現(xiàn)非缺失區(qū)的轉(zhuǎn)座子類型主要是高拷貝的Copia 轉(zhuǎn)座子,并提出了一種模型解釋基因缺失可能的分子機(jī)制,即缺失區(qū)域兩側(cè)的Copia轉(zhuǎn)座子通過同源重組的方式發(fā)生交換,導(dǎo)致含有soloLTR 的中間區(qū)域缺失。這些結(jié)果說明小麥白粉菌效應(yīng)因子的進(jìn)化與轉(zhuǎn)座子相關(guān),且這種機(jī)制在禾谷類白粉菌中普遍存在。屬于典型的分泌性效應(yīng)蛋白,其編碼蛋白N 端為含有21 個氨基酸的信號肽,信號肽下游為保守的Y(x)xC 基序。在結(jié)構(gòu)上還與已知的RNase 類核糖核酸酶具有同源性,這類酶對吸器的形成是必需的。因此,推測可能具有雙重功能: 一是在非親和互作中具有與識別并激發(fā)寄主免疫反應(yīng)的功能; 二是在親和性互作中參與吸器的形成,抑制寄主細(xì)胞防衛(wèi)反應(yīng)的功能。但與的互作機(jī)制尚需要進(jìn)一步的生理生化證據(jù)來解析。

5.3 AvrPm2 的單倍型分析

Manser 等在白粉病菌株USA7 和USA2 中發(fā)現(xiàn)了的另兩個單倍型和。序列分析發(fā)現(xiàn),與相比,僅在第67 位氨基酸上發(fā)生了變異,由甘氨酸變成了絲氨酸;的第67 位氨基酸由甘氨酸變成了絲氨酸,第96 位的纈氨酸變成了天冬氨酸。利用白粉病菌株USA7 和USA2 對的近等基因系進(jìn)行離體鑒定,發(fā)現(xiàn)USA7 攜帶的H1 是的無毒基因,而USA2 攜帶的H2 對是有毒的。因此,只有可以被特異性識別。

6 Pm2 在小麥抗白粉病育種中的應(yīng)用

在我國小麥抗病育種中發(fā)揮了重要的作用。山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所系統(tǒng)選育的高產(chǎn)、多抗小麥新品種‘濟(jì)麥22’,在山東省和黃淮北片審定和大面積推廣,截至2020年夏收,累計推廣面積2000 萬hm(http://www.saas.ac.cn/art/2021/1/11/art_1847991028 4451.html)。以‘濟(jì)91102’和‘濟(jì)935031’為親本選育而成的國審小麥品種‘良星66’,在黃淮冬麥區(qū)北片的山東、河北中南部、山西南部、河南安陽等地推廣種植。利用英國高產(chǎn)抗病小麥品種‘Riband’與河南小麥品種‘溫麥6 號’和‘周麥13’雜交和回交,育成的高產(chǎn)抗病小麥新品種‘農(nóng)大1108’,在河南省和陜西省審定并推廣種植。利用意大利品種‘Torino’與‘冀麥38’和‘石4185’等進(jìn)行雜交和回交,育成的高產(chǎn)抗病節(jié)水的小麥新品種‘農(nóng)大399’,在河北省中南部審定并推廣種植。利用‘豫麥34’為母本、‘濟(jì)麥22’為父本雜交后回交并利用分子標(biāo)記輔助選育而成的‘濟(jì)麥23’,在山東省審定并推廣種植。遺傳分析和分子標(biāo)記結(jié)果表明這些主栽品種均攜帶小麥抗白粉病基因。

胡娜等利用的連鎖標(biāo)記檢測了260 份小麥材料,包括35 份國外引進(jìn)品種,1 份農(nóng)家品種及224 份高代品系及育成品種,發(fā)現(xiàn)有145 份材料攜帶,占供試材料的55.8%。曹廷杰等利用與緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測了908 份河南省參加區(qū)試和預(yù)試的小麥材料,發(fā)現(xiàn)其中8 個材料攜帶,分別是‘遂民081’ ‘農(nóng)大1108’ ‘鄭麥117’‘中麥61’ ‘德麥1201’ ‘鄭麥129’ ‘偃展03114’和‘天寶2018’。劉理森等利用與緊密連鎖的分子標(biāo)記檢測了241 份小麥品種(系),發(fā)現(xiàn)有13份材料攜帶,包括‘鄭麥129’ ‘邯09-41344’‘邯農(nóng)2312’ ‘LS4223’ ‘南大2419’ ‘蘇麥3 號’ ‘火麥’‘寧春4 號’ ‘興義4 號’ ‘漢中白’ ‘扁頭光禿麥’ ‘長芒石扁頭’和‘紅春麥’。劉易科等利用的功能標(biāo)記JS322/JS362 檢測了11 份湖北省的小麥主栽品種‘鄭麥9023’ ‘鄂麥596’ ‘鄂麥352’ ‘鄂麥580’ ‘鄂麥006’ ‘鄂麥216’ ‘鄂麥325’ ‘襄麥25’ ‘襄麥55’ ‘襄麥35’和‘襄麥D31’,發(fā)現(xiàn)它們均攜帶。本實驗室利用的功能標(biāo)記Pm2b-map-3 檢測了411 份高代品系、165 份育成品種、42 份引進(jìn)品種、37 份異染色體系和4 份農(nóng)家品種共659 份小麥材料,發(fā)現(xiàn)有252 份高代品系、83 份育成品種、33 份引進(jìn)品種、5 份異染色體系和3 份農(nóng)家品種共393 份材料攜帶,占供試材料的59.6%。

的載體材料‘KM2939’是一個多花多粒、綜合農(nóng)藝性狀優(yōu)良的小麥育種新品系,苗期和成株期均高抗白粉病。本實驗室將KM2939 與黃淮麥區(qū)高感白粉病的主栽品種雜交,創(chuàng)建了3 個以主栽品種‘石麥15’ ‘石新828’和‘科農(nóng)199’為背景的近等基因系,其背景恢復(fù)率分別達(dá)99.0%、98.9%和99.0%;進(jìn)一步結(jié)合的分子標(biāo)記輔助選擇,篩選出了一批綜合農(nóng)藝性狀良好的抗白粉病新品系,為高產(chǎn)抗病新品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

7 展望

在基因的多項研究中,‘Ulka’()、KM2939()、‘鳥麥’()、CH1357、‘良星66’和‘農(nóng)大399’對不同白粉病菌株表現(xiàn)出了不同的抗性反應(yīng)差異,但序列分析表明它們所攜帶的抗病基因序列完全一致。出現(xiàn)這種情況的可能原因包括:1)這些材料的遺傳背景存在較大的差異,例如‘鳥麥’是中國農(nóng)家品種,‘良星66’和‘農(nóng)大399’是育成品種等。2)該基因在不同的遺傳背景下可能存在其他相關(guān)調(diào)控因子,共同決定它們對白粉病菌株的抗性。3)白粉病菌本身是高度雜合異質(zhì)混合群體,與抗病基因?qū)?yīng)的毒性基因位點可能不是單一的純合狀態(tài),導(dǎo)致出現(xiàn)不同的鑒定結(jié)果。因此,要反復(fù)驗證比較其抗性反應(yīng),確認(rèn)抗性反應(yīng)的差異能穩(wěn)定遺傳。同時,在不同材料背景下進(jìn)一步研究的轉(zhuǎn)錄、蛋白翻譯及表觀修飾,解析其作用機(jī)制,明確小麥抗病基因及其與寄主之間的互作關(guān)系。

在目前已正式命名的抗白粉病基因中,雖然不乏抗性優(yōu)異的基因,但是真正能被應(yīng)用到育種中的抗病基因相對較少。究其原因,一是隨著病原菌的變異,其抗性被克服; 二是抗病基因的載體品種農(nóng)藝性狀太差不宜直接作為育種親本利用; 三是部分抗病基因來源于小麥的近緣屬種,多以抗病附加系、代換系或易位系的形式存在,多與不利性狀基因連鎖,需要打破連鎖累贅后才能用于育種。作為生產(chǎn)上常用的抗白粉病基因,其抗性表現(xiàn)優(yōu)異,同時載體材料的綜合農(nóng)藝性狀較好,因而在生產(chǎn)上得到了廣泛應(yīng)用。例如大面積推廣的‘濟(jì)麥22’ ‘濟(jì)麥23’‘良星66’ ‘良星99’以及它們的衍生品種(系)等。但是,需要注意的是,當(dāng)前在育種上,越來越多的雜交組合都以大面積推廣的主栽品種為親本,從而使得新培育的品種(系)間遺傳相似性不斷提高,導(dǎo)致遺傳基礎(chǔ)狹窄。隨著2 在生產(chǎn)上利用頻率的提高,其對應(yīng)的毒性菌系的頻率也在不斷上升,導(dǎo)致抗性被克服的風(fēng)險不斷加大。因此,在抗病育種上應(yīng)當(dāng)合理布局利用該基因,運(yùn)用分子標(biāo)記輔助選擇將不同抗性的基因聚合使用,這樣不僅可以彌補(bǔ)不同抗病基因間的差異,還能延長抗病基因的使用壽命,使抗病表現(xiàn)更加持久。此外,系統(tǒng)鑒定現(xiàn)有的抗性資源,深入發(fā)掘新的抗病基因及其優(yōu)異等位變異,豐富抗源的遺傳多樣性,大力加強(qiáng)種質(zhì)資源的原始創(chuàng)新,以保持小麥新品種培育和生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展已成為小麥抗病育種急需解決的重要問題。