周亞南 張建新 杜巍 胡大軍 鐘敏

心肌細(xì)胞損傷與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，其損傷與心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激密切相關(guān)[1-2]，長鏈非編碼RNA（lncRNA）可參與調(diào)控心肌細(xì)胞損傷[3-4]。LncRNA 癌易感性候選基因2（CASC2）通過調(diào)節(jié)微小RNA（miRNA）-144-3p/水通道蛋白1（AQP1）軸，減少肺上皮細(xì)胞凋亡，改善急性肺損傷[5]。在脂多糖刺激的人腎小管上皮HK-2 細(xì)胞中，CASC2 可以增加細(xì)胞活性，抑制炎性因子分泌、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，改善急性腎損傷[6]。CASC2 通過miR-133b/叉頭框蛋白p1（FOXP1）軸調(diào)節(jié)人腎小球系膜細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)積累和氧化應(yīng)激[7]。上述研究提示CASC2具有抑制細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激、減輕細(xì)胞損傷的作用。研究表明，敲低miR-217 可減輕H9c2 細(xì)胞的心肌缺氧/復(fù)氧損傷[8]，改善氧葡萄糖剝奪和復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷[9]。過表達(dá)miR-217 可加重缺氧誘導(dǎo)的H9c2 細(xì)胞損傷[10]，而生物學(xué)預(yù)測軟件顯示miR-217 與CASC2 有靶向結(jié)合位點。本研究探討CASC2 能否通過調(diào)控miR-217 影響心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

1 材料與方法

1.1 材料

H9c2 細(xì)胞購自無錫欣潤生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基購自上海高創(chuàng)化學(xué)科技有限公司；過氧化氫、四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒、丙二醛（MDA）試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 細(xì)胞處理與分組

用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)H9c2 細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞并分組。模型（Model）組：用300 μmol/L過氧化氫處 理H9c2 細(xì)胞。Model＋pcDNA 組、Model＋pcDNA-CASC2 組：將空載體（pcDNA）、過表達(dá)CASC2 載體（pcDNA-CASC2）分別轉(zhuǎn)染至H9c2 細(xì)胞后再用300 μmol/L 過氧化氫處理。Model＋anti-miR-NC 組、Model＋anti-miR-217組：將抑制物對照（anti-miR-NC）、miR-217 抑制物（anti-miR-217）分別轉(zhuǎn)染至H9c2 細(xì)胞后再用300 μmol/L 過氧化氫處理。Model＋pcDNA-CASC2＋miR-NC 組、Model＋pcDNA-CASC2＋miR-217 組：將pcDNA-CASC2 分別與miR-NC、miR-217 共轉(zhuǎn)染至H9c2 細(xì)胞后再用300 μmol/L 過氧化氫處理。對照組：正常培養(yǎng)的H9c2 細(xì)胞。各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h。

1.3 qRT-PCR檢測CASC2和miR-217的表達(dá)水平

提取各組細(xì)胞總RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 模板，以cDNA 模板按熒光定量試劑盒說明進(jìn)行PCR，相對表達(dá)水平用2-△△Ct法計算。CASC2 和miR-217 分別以GAPDH 和U6 為內(nèi)參，CASC2 上游引物序列為5'-TACAGGAC AGTCAGTGGTGGTA-3'，下游引物序列為5'-AC ATCTAGCTTAGGAATGTGGC-3'；miR-217 上游引物序列為5'-CGCAGATACTGCATCAGG AA-3'，下游引物序列為5'-CTGAAGGCAATGCA TTAGGAACT-3'。

1.4 MTT檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞培養(yǎng)48 h，每孔加入20 μL MTT 溶液，孵育4 h 后加入二甲基亞砜（DMSO）反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm 處檢測吸光度（OD）值。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞培養(yǎng)48 h，加入10 μL Annexin V-FITC、5 μL PI，避光孵育10 min；用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.6 Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

提取細(xì)胞總蛋白，定量后取50 μL 蛋白樣品進(jìn)行10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后加入Bax、Bcl-2 一抗（稀釋1 ∶800）4 ℃過夜，加入二抗室溫培養(yǎng)1 h，加入化學(xué)發(fā)光試劑顯影，以GAPDH 為內(nèi)參分析蛋白條帶灰度值。

1.7 試劑盒檢測細(xì)胞SOD活性、MDA含量和培養(yǎng)液中LDH水平

細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后收集各組細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按試劑盒說明書檢測細(xì)胞SOD 活性、MDA含量和培養(yǎng)液中LDH 水平。

1.8 雙熒光素酶報告實驗

構(gòu)建CASC2 的野生型（WT-CASC2）和突變型（MUT-CASC2）熒光素酶載體，將其分別與miRNA 對照（miR-NC）和miR-217 共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞中，按照說明書檢測熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶報告基因活性值為參照，計算心肌細(xì)胞熒光素酶活性值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CASC2對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

與對照組相比，Model 組心肌細(xì)胞中CASC2 mRNA 表達(dá)水平和Bcl-2 蛋白表達(dá)水平降低，miR-217 和Bax 蛋白表達(dá)水平升高，心肌細(xì)胞活性、SOD 活性降低，凋亡率、MDA 含量和LDH 水平升高（P均＜0.05）；與Model組和Model＋pcDNA組相比，Model＋pcDNA-CASC2 組心肌細(xì)胞中CASC2 mRNA 表達(dá)水平和Bcl-2 的蛋白表達(dá)水平升高，miR-217 和Bax 蛋白表達(dá)水平降低，心肌細(xì)胞活性、SOD 活性升高，凋亡率、MDA 含量和LDH 水平降低（P均＜0.05）。見圖1、表1、表2。

表2 CASC2對過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞OD值、凋亡率及氧化應(yīng)激的影響（n＝3）

圖1 CASC2對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

表1 上調(diào)CASC2表達(dá)對心肌細(xì)胞CASC2、miR-217及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n＝3）

2.2 CASC2靶向miR-217

CASC2 和miR-217 存在互補的核苷酸序列，見圖2。miR-217 與WT-CASC2 共轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞熒光素酶活性降低，而miR-217 與MUT-CASC2共轉(zhuǎn)染的心肌細(xì)胞熒光素酶活性無顯著變化，見圖2、表3。

表3 miR-NC或miR-217與WT-CASC2及MUT-CASC2共轉(zhuǎn)染心肌細(xì)胞后雙熒光素酶活性比較（n＝3）

圖2 CASC2和miR-217的互補序列

2.3 抑制miR-217對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷氧化應(yīng)激的影響

與Model 組和Model＋anti-miR-NC 組相比，Model＋anti-miR-217 組心肌細(xì)胞中miR-217、Bax蛋白表達(dá)水平降低，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平升高，心肌細(xì)胞活性升高，凋亡率降低，SOD 活性水平升高，MDA 含量和LDH 水平降低（P均＜0.05）。見圖3、表4、表5。

表4 抑制miR-217對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-217及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n＝3）

表5 抑制miR-217對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞OD值、凋亡率及氧化應(yīng)激的影響（n＝3）

圖3 抑制miR-217對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.4 miR-217可逆轉(zhuǎn)CASC2對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的影響

與Model＋pcDNA-CASC2＋miR-NC 組相比，Model＋pcDNA-CASC2＋miR-217 組心肌細(xì)胞中miR-217、Bax 蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2 表達(dá)水平降低，心肌細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，心肌細(xì)胞中SOD 活性水平降低，MDA 含量、LDH 水平升高（P均＜0.05），見圖4、表6、表7。

表6 miR-217可逆轉(zhuǎn)CASC2對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞miR-217和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（n＝3）

表7 miR-217可逆轉(zhuǎn)CASC2對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞OD值、凋亡率及氧化應(yīng)激的影響（n＝3）

圖4 miR-217可逆轉(zhuǎn)CASC2對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

研究表明過氧化氫可進(jìn)入細(xì)胞形成自由基，造成細(xì)胞損傷[11]。因此，本實驗采用過氧化氫處理心肌細(xì)胞建立損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞活性降低，凋亡率升高，SOD 活性降低，MDA 含量、LDH 水平升高。SOD、MDA、LDH 是氧化應(yīng)激相關(guān)因子，其水平異常影響氧化應(yīng)激的發(fā)生[12]，上述結(jié)果表明本研究成功建立心肌氧化損傷模型。

研究報道CASC2 通過調(diào)控miR-194-5p/陷窩蛋白-1（CAV1）軸減輕小鼠和細(xì)胞模型中高氧誘導(dǎo)的肺損傷[13]。CASC2 還可通過調(diào)節(jié)miR-9-5p/過氧化物酶體增殖物激活受體γ 軸提高細(xì)胞活性并抑制細(xì)胞凋亡，從而減輕高糖誘導(dǎo)的人足細(xì)胞損傷[14]。本研究中，過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中CASC2 表達(dá)降低，過表達(dá)CASC2 后心肌細(xì)胞活性升高，凋亡率降低，SOD 活性升高，MDA 含量、LDH 水平降低，表明過表達(dá)CASC2 可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。

研究發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭患者心臟中的miR-217 表達(dá)水平增加，miR-217 可促進(jìn)心肌肥大和心功能障礙[15]。抑制miR-217 可降低柯薩奇病毒B3感染所致心肌炎中MDA 含量降低，SOD 活性增加[16]。下調(diào)miR-217 可抑制1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP＋）誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[17]。本研究顯示，過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-217 表達(dá)水平升高，抑制miR-217 表達(dá)可抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激。本研究還發(fā)現(xiàn)，CASC2 靶向調(diào)控miR-217，miR-217 可逆轉(zhuǎn)CASC2 對過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激的影響。

綜上所述，過表達(dá)CASC2 通過靶向miR-217抑制過氧化氫誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激。