侯明霞，葉飛，熊東升，劉偉信，曾玖芝，孫燕

母體子宮對于胚胎來說是一個恒溫恒濕的穩(wěn)定生理環(huán)境[1]。溫度作為培養(yǎng)過程中的關鍵因素，過高、過低都會影響卵子和胚胎的發(fā)育，其中影響最顯著的是紡錘體穩(wěn)定性和胚胎代謝水平[2]。就目前的取卵方式而言，卵泡液在回收過程中流經(jīng)回收管時溫度不可避免會下降，因此在收取卵泡液時，維持卵泡液溫度在37℃，對胚胎后續(xù)發(fā)育至關重要。本研究自行設計一套卵泡回收加熱系統(tǒng)，以確保在獲取卵子過程中卵泡液溫度始終維持在37℃，探討在取卵過程中控制卵泡液的溫度變化對體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)臨床結局的影響，現(xiàn)報道如下。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

選擇2020年6月至2021年10月在四川省婦幼保健院因輸卵管阻塞行IVF-ET治療的146例患者，將其按來院就診次序隨機分為對照組和研究組，每組73例(利用PASS15軟件計算得到對照組和研究組樣本數(shù)為n1=n2=58例，考慮到患者退出情況則需樣本量n1=n2=58/0.8≈73例)。

納入標準：① 患者年齡<35歲，體質量指數(shù)(body mass index，BMI)18～25 kg/m2；② 月經(jīng)周期規(guī)律(22～35 d)；③ 既往無卵巢手術史、B 超檢查雙側卵巢外觀正常,無輸卵管積水及多囊卵巢綜合征病史；④ 無影響卵巢功能的內(nèi)分泌疾??；⑤ 丈夫精液檢查正常。

1.2 試劑耗材

試劑均購買于COOK公司，耗材購買于美國BD FALCON公司。卵泡液回收加熱系統(tǒng)由本實驗室設計，廣州品知醫(yī)療器械有限公司按照實驗設計生產(chǎn)出成品(見圖1)。

注：1.保溫套；2.卡槽；3.魔術貼(31.魔術貼勾面；32.魔術貼毛面)；4.套環(huán)；5.加熱頭；6.電線；7.加熱器連接頭

1.3 研究方法

對照組按照常規(guī)取卵步驟操作。研究組在常規(guī)取卵基礎上增加卵泡回收加熱系統(tǒng)進行操作：將卵泡回收加熱系統(tǒng)安裝在卵泡回收系統(tǒng)輸送軟管上，溫度設定在38.6℃，然后模擬取卵過程將37℃生理鹽水作為卵泡液通過卵泡液回收加熱系統(tǒng)抽吸到14 mL圓底試管，此時測定圓底試管中生理鹽水溫度為37℃，因此卵泡回收加熱系統(tǒng)在使用時溫度應設置為38.6℃。

根據(jù)患者基礎內(nèi)分泌水平、卵巢儲備等情況按照常規(guī)促排卵方案，當1～2枚卵泡直徑≥18 mm時注射重組人絨毛膜促性腺激素 (recombinant human chorio gonadotropin，rhCG，艾澤，德國默克雪蘭諾)，36．5～37.0 h 陰道B超引導下取卵，所獲卵母細胞短時受精 4 h后去除顆粒細胞觀察受精情況。將受精卵培養(yǎng)皿置于時差監(jiān)控培養(yǎng)箱(6.0% CO2，5% O2，37.0℃)培養(yǎng)，D3均選擇來源于2PN胚胎 1～2枚進行移植，剩余可利用胚胎換液后繼續(xù)進行培養(yǎng)至D6，記錄囊胚形成情況。

1.4 觀察指標

觀察記錄正常受精率、多PN受精率、卵裂率、D3優(yōu)質胚胎率、囊胚形成率、優(yōu)質囊胚率、臨床結局以及胚胎動力學參數(shù)。胚胎動力學利用時差監(jiān)控系統(tǒng)記錄胚胎從原核發(fā)育至不同細胞期所需時間，其指標如下：發(fā)育至 2 細胞的時間為 t2，發(fā)育至4細胞的時間為 t4，發(fā)育至5細胞的時間為 t5,發(fā)育至8細胞的時間為 t8。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 兩組患者一般資料比較

兩組患者年齡、不孕年限、BMI、總Gn量、總Gn天數(shù)和移植胚胎數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見下頁表1。

表1 兩組患者一般資料比較

2.2 兩組患者胚胎質量及妊娠結局比較

研究組D3優(yōu)質胚胎率和臨床妊娠率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；兩組正常受精率、多PN受精率、卵裂率、囊胚形成率以及優(yōu)質囊胚率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。但研究組卵裂率、囊胚形成率有升高趨勢，并且多PN受精率有所下降，詳見下頁表2。

表2 兩組患者胚胎質量及妊娠結局比較

2.3 兩組患者胚胎發(fā)育速率比較

兩組患者胚胎發(fā)育速率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見下頁表3。

表3 兩組患者胚胎發(fā)育速率比較

3 討論

胚胎體外培養(yǎng)涉及多個環(huán)節(jié)，從卵泡液離開卵泡開始，各種外部環(huán)境開始影響卵子和胚胎質量，而胚胎質量將直接影響移植后的臨床結局。除去配子和胚胎本身質量外，影響它們的外部因素有很多，從實驗室角度，主要有操作因素、環(huán)境因素等，其中環(huán)境因素最為復雜，比如環(huán)境溫度、濕度等。由于監(jiān)控的節(jié)點較多，目前胚胎實驗室廣泛關注的是胚胎培養(yǎng)過程中的環(huán)境控制，尤其是培養(yǎng)過程中溫度的監(jiān)控，而常常忽略卵泡液獲取過程中溫度的控制和監(jiān)測。本中心以37℃生理鹽水模擬卵泡液，然后模擬卵泡液獲取整個流程發(fā)現(xiàn)，37℃的生理鹽水經(jīng)過常規(guī)卵泡回收系統(tǒng)流入14 mL圓底試管后，溫度會降至34℃～34.5℃。因此，本研究關注于該過程中溫度的控制，自行設計和組裝一套簡易的卵泡回收加熱系統(tǒng)用于卵泡液回收過程中溫度的控制，探究卵泡液回收過程中溫度對胚胎質量以及臨床結局的影響。

溫度對胚胎發(fā)育有至關重要的影響，人體的基礎體溫是37℃，常規(guī)理論認為，37℃是配子體外受精和發(fā)育的最適溫度(輸卵管溫度和宮腔溫度)[3-4]。然而，有研究發(fā)現(xiàn)，人卵泡液內(nèi)溫度低于37℃，大約低2.3℃，因此，理論上認為36℃更接近生殖道溫度，也許更有利于胚胎發(fā)育[5]。不過，Hong KH等[6]一項前瞻性隨機對照研究認為，在控制培養(yǎng)箱溫度波動、類型及pH值等因素后，37℃培養(yǎng)的胚胎與36℃相比，第3天細胞數(shù)更多，囊胚形成率更高，而著床率和非正整倍體率差異無統(tǒng)計學意義。而低溫對配子和胚胎的影響是明確的，在小鼠卵母細胞中，從37℃分別冷卻至25℃、18℃或4℃會導致減數(shù)分裂紡錘體的微管破裂；當溫度恢復到37℃時，這種破壞就會逆轉[7]。相比之下，人類卵母細胞冷卻至室溫會導致紡錘體的破壞且不可逆轉[8]。Sherbahn R[9]的研究結果顯示，取卵時卵泡液溫度超過36.4℃～36.9℃這一范圍，將影響胚胎囊胚形成率、著床率及活產(chǎn)率，提示配子及胚胎在體外離開培養(yǎng)箱后，溫度降至36.4℃下，可能對胚胎后期發(fā)育產(chǎn)生影響。

目前尚不清楚溫度變化是否會影響胚胎植入或活產(chǎn)?，F(xiàn)有的研究表明，體外培養(yǎng)條件(包括溫度)可能會影響胚胎植入前的有絲分裂非整倍性或嵌合比例[10-11]。Walters EA等[12]認為現(xiàn)有的研究并不支持胚胎培養(yǎng)過程中調節(jié)溫度，在37.0℃的穩(wěn)定溫度下進行培養(yǎng)可能更穩(wěn)妥。

本研究利用卵泡回收加熱系統(tǒng)對卵泡液從卵泡到取卵管這個過程溫度的控制，發(fā)現(xiàn)D3優(yōu)質胚胎率(62.36%)和臨床妊娠率(57.78%)較對照組(43.87%，46.51%)有明顯提高，囊胚形成率、卵裂率有升高的趨勢。但胚胎動力學觀察未發(fā)現(xiàn)兩組間差異有統(tǒng)計學意義。有研究表明36℃培養(yǎng)和37℃培養(yǎng)胚胎，移植后妊娠率差異無統(tǒng)計學意義，但過低溫度卵裂率和妊娠率顯著下降[13-17]。

綜上所述，雖然最適宜的胚胎培養(yǎng)溫度還有爭議，但目前大家公認的配子和胚胎維持溫度是37℃，所以應當在每一個環(huán)節(jié)對溫度做好控制和監(jiān)測。本研究在取卵過程中實施的保溫措施僅是初步探索，還需要增加樣本量進一步驗證該項保溫措施對胚胎質量和妊娠結局的影響。