張帆帆，李海琴，譚美芳，楊 群，涂凌云，康冬柳，羅士仙，黃奕雯，曾艷兵，譚 佳，黃江南，謝金防，韋啟鵬*，康昭風*

（1.江西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；2.南昌市動物疫病預防控制中心，江西 南昌 330008；3.吉安市畜牧獸醫(yī)局，江西 吉安 343099；4.泰和縣畜牧獸醫(yī)局，江西 吉安 343799）

鵝星狀病毒（Goose astrovirus，GoAstV）是一種近年來新發(fā)現(xiàn)的可引起3 周齡內(nèi)的雛鵝痛風的病毒，以關(guān)節(jié)腫脹，內(nèi)臟器官表面、關(guān)節(jié)腔有大量尿酸鹽沉積為基本特征，死亡率高達30%[1-2]。該病自2017年在我國主要養(yǎng)鵝地區(qū)陸續(xù)發(fā)生，并迅速蔓延至全國，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，嚴重威脅我國養(yǎng)鵝業(yè)的發(fā)展。目前市場尚無GoAstV 商品化疫苗和特效藥，因此迫切需要建立一種高效的檢測方法監(jiān)測GoAstV。GoAstV 是一種無囊膜的、單鏈正義RNA病毒，病毒基因組大小約7.2 kb，包含5′非翻譯區(qū)（5′-UTR）和3′-UTR 及2 個開放閱讀框（ORF），分別編碼多聚酶蛋白1a/1b 和衣殼（Cap）蛋白[3]。其中Cap蛋白是誘導機體產(chǎn)生保護性抗體的主要抗原，而該蛋白編碼基因5′端相對保守，可用于建立高效、準確、快速的分子生物學診斷技術(shù)的靶標，為鵝群中GoAstV 感染的診斷及流行病學調(diào)查提供切實可行的方法[4]。

目前對于GoAstV 的檢測方法主要包括RT-PCR、RT-LAMP、熒光定量RT-PCR、病毒分離鑒定等[1,5-6]。Zhang 等通過將鵝痛風樣品接種鵝胚分離了GoAstV，并利用GoAstV 的ORF2 基因保守序列，設計引物建立了檢測GoAstV 的RT-PCR 方法[1]。張玉霞等根據(jù)GoAstV ORF1b 基因設計了一組特異性的LAMP 引物，建立了特異、快速檢測GoAstV 的RT-LAMP 方法[5]。Wan 等根據(jù)GoAstV ORF1b 保守序列設計了特異性引物和探針建立了GoAstVTaqMan 熒光定量RTPCR 方法，該方法靈敏性高、特異性強，可快速有效地檢測GoAstV[6]。而針對GoAstV 抗體的血清學檢測方法，刁有祥等以原核表達獲得的GoAstV ORF1b重組蛋白為包被抗原，建立了快速、有效的GoAstV間接ELISA 抗體檢測方法[7]。張鑫宇同時利用GoAstV Cap 蛋白和Cap 蛋白C 端為包被抗原，建立了GoAstV血清抗體水平監(jiān)測的間接ELISA 方法[8]。孫敏等利用原核表達系統(tǒng)表達Cap 蛋白的C 末端，并以其為抗原包被酶標板，建立了特異性強、重復性好的競爭ELISA 抗體檢測方法[9]。然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)利用表達Cap 蛋白N 末端保守區(qū)域建立檢測GoAstV抗體的間接ELISA 方法，GoAstV 已經(jīng)在主要養(yǎng)鵝地區(qū)廣泛流行，因此建立一種成本低，快速高效的間接ELISA方法迫在眉睫。本研究原核表達GoAstV 截短重組Cap蛋白（rCap），并以純化并截短的rCap 為包被抗原，建立GoAstV 間接ELISA 抗體檢測方法。為GoAstV 抗體的檢測和血清流行病學調(diào)查以及免疫監(jiān)測提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料GoAstV JXGZ 株由本實驗室分離保存；GoAstV、鵝細小病毒（GPV）、鵝圓環(huán)病毒（GoCV）、禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、坦布蘇病毒（TMUV）、鵝呼腸孤病毒（GRV）、大腸桿菌（E.coli）鵝源陽性血清均由江西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所保存；GoAstV 陽性血清為攻毒康復后的雛鵝血清；200份鵝陰性血清由本實驗室保存；670份臨床鵝血清采自江西及周邊省份各年齡段的鵝；原核表達質(zhì)粒pCold I、大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）感受態(tài)細胞、EcoR I、XhoI 限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase 和DNA Marker 均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；預染蛋白Marker 購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；可溶型單組分TMB 底物溶液購自天根生化科技（北京）有限公司；HRP 標記的兔抗鵝IgG（IgG-HRP）購自北京義翹神州科技股份有限公司；Ni 層析介質(zhì)（NTA）、PDVF 膜、ECL Plus 超敏發(fā)光液均購自北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE 凝膠試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.2 rCap 的誘導表達、純化及反應原性的western blot鑒定根據(jù)GoAstV JX01/China/2021株（MZ576222）的ORF2 基因序列，按照大腸桿菌密碼子的偏好性、mRNA 結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及GC 含量等原則優(yōu)化密碼子后，由武漢金開瑞生物工程有限公司合成ORF2 基因。將合成的ORF2 基因克隆至pCold I 載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pCold I-Cap，并經(jīng)PCR、酶切和測序鑒定。將鑒定正確的重組質(zhì)粒pCold I-Cap 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）構(gòu)建重組菌pCold I-Cap/BL21（DE3），將重組菌接種于LB 液體培養(yǎng)基（Amp+）中，培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8 時加入終濃度1 mmol/L 的IPTG，置16 ℃誘導表達20 h，收集菌液，PBS 重懸、超聲波破碎后分別收集上清及沉淀。將表達的rCap 利用Ni親和純化層析柱純化，純化后的rCap 經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)PVDF 膜，以GoAstV 陽性血清（1∶100）為一抗，以兔抗鵝IgG-HRP（1∶2 000）為二抗孵育，顯色后進行重組蛋白的western blot 鑒定。

1.3 間接ELISA 方法反應條件的優(yōu)化與建立將純化的rCap 和GoAstV 鵝陽性血清倍比稀釋，采用棋盤滴定法，確定最佳抗原包被濃度和血清稀釋倍數(shù)?？乖粷舛纫来螢?0 μg/mL、10 μg/mL、5.0 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL；血清稀釋度依次為1∶25、1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800。在確定抗原包被濃度及血清稀釋倍數(shù)后，對封閉液、封閉時間、血清孵育時間、兔抗鵝IgG-HRP 稀釋倍數(shù)及TMB 顯色時間進行優(yōu)化，確定最佳反應條件。

1.4 臨界值的確定利用優(yōu)化后的GoAstV間接ELISA方法檢測200 份鵝陰性血清（經(jīng)病毒中和試驗確定為GoAstV 陰性）。根據(jù)生物統(tǒng)計學原理計算平均值（-x）和標準差（s），并以此確定血清樣品的陽性或陰性臨界值，臨界值的計算公式為-x+3s。

1.5 特異性試驗利用本研究建立的GoAstV間接ELISA 方法對已知的GPV、GoCV、AIV、NDV、TMUV、GRV、E.coli陽性血清檢測，同時設立GoAstV 陽性血清為對照，每種血清設置2 個重復，評價間接ELISA方法的特異性。

1.6 敏感性試驗將GoAstV 陽性鵝血清2 倍倍比稀釋（1∶50～1∶3 200），以GoAstV 陰性鵝血清為陰性對照，利用本研究建立的間接ELISA 方法檢測，同時利用病毒中和試驗檢測[10]，比較二者的檢測結(jié)果，確定本研究建立的間接ELISA 方法的敏感性。

1.7 重復性試驗選取同一批次包被的酶標板，隨機抽取4 份GoAstV 陽性血清樣品進行批內(nèi)重復性試驗檢測，每份血清設置8 個重復；選取4 個不同批次包被的酶標板，對上述4 份陽性血清進行批間重復試驗，每份血清設置4 個重復；計算批內(nèi)和批間變異系數(shù)（CV），評價該ELISA 方法的重復性。

1.8 符合率試驗選取本實驗室保存的120 份臨床鵝血清，利用本研究建立的間接ELISA 和病毒中和試驗同時檢測，通過Kappa 檢驗進行分析，計算兩種檢測方法的符合率。

1.9 臨床樣品的檢測選取本實驗室保存的670 份臨床鵝血清樣品，利用本研究建立的間接ELISA 方法檢測，統(tǒng)計血清陽性檢出率。

2 結(jié) 果

2.1 rCap 的表達及純化結(jié)果對構(gòu)建的重組質(zhì)粒pCold I-Cap 經(jīng)PCR、酶切與測序鑒定，結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將pCold I-Cap 轉(zhuǎn)入BL21（DE3），獲得pCold I-Cap/BL21（DE3）重組菌，16 ℃經(jīng)IPTG 誘導20 h 后收集全菌離心、PBS 重懸、超聲破碎后分別對上清和沉淀進行SDS-PAGE 檢測。結(jié)果顯示，重組蛋白在上清和沉淀中均有表達，大小約為29 ku，與預期蛋白大小一致。重組蛋白經(jīng)Ni 親和純化層析柱純化后，經(jīng)western blot 鑒定，結(jié)果顯示，PVDF 膜上出現(xiàn)29 ku 的特異性條帶（圖1），表明rCap 可以被GoAstV 陽性血清識別，具有很好的反應原性。

圖1 rCap表達的SDS-PAGE和純化的western blot檢測結(jié)果Fig.1 SDS-PAGE and western blot analysis of recombinant GoAstV Cap protein

2.2 間接ELISA 方法的優(yōu)化結(jié)果利用純化的rCap經(jīng)棋盤滴定法確定抗原最佳包被濃度為2.5 μg/mL，4 ℃包被過夜；最佳封閉條件為10%馬血清37 ℃封閉90 min；待檢血清最佳稀釋度為1∶50，37 ℃孵育45 min；兔抗鵝IgG-HRP 最佳稀釋度為1∶2 000，37 ℃孵育60 min。最后加入顯色劑TMB 于37 ℃顯色15 min（表1）。

表1 間接ELISA檢測方法反應條件的優(yōu)化結(jié)果Table 1 The optimized conditions of the indirect GoAstV-ELISA

2.3 臨界值的確定利用本研究建立的間接ELISA方法檢測200 份GoAstV 陰性血清樣品。檢測結(jié)果經(jīng)計算-x為0.161，s為0.032，臨界值為-x+3s=0.257，即OD450nm≥0.257 為陽性，OD450nm＜0.257 判定為陰性，陰性樣品結(jié)果正態(tài)分布圖見圖2。

圖2 陰性血清樣品結(jié)果正態(tài)分布圖Fig.2 Normal distribution diagram of negative serum samples

2.4 特異性試驗結(jié)果利用本研究建立的間接ELISA 方法對GPV、GoCV、AIV、NDV、TMUV、GRV、E. coli陽性血清和GoAstV 陽性血清進行檢測，結(jié)果顯示，除GoAstV 陽性對照血清為陽性外，其他7 種常見病原陽性血清檢測結(jié)果均為陰性（表2），表明建立的間接ELISA 檢測方法特異性較強。

表2 間接ELISA方法的特異性試驗結(jié)果Table 2 The results of specificity evaluation of indirect ELISA

2.5 敏感性試驗結(jié)果利用本研究建立的間接ELISA 方法對不同稀釋度的GoAstV 陽性血清及GoAstV陰性血清進行檢測，結(jié)果顯示，本研究建立的間接ELISA方法能夠檢測的GoAstV陽性血清的檢測下限為1∶400；而病毒中和試驗對陽性血清的檢測下限為1∶200（表3）。表明本研究建立的間接ELISA 方法的敏感性較高。

表3 間接ELISA方法的敏感性試驗結(jié)果Table 3 The sensitivity test of indirect ELISA

2.6 重復性試驗結(jié)果利用本研究建立的間接ELISA方法對4份不同的臨床血清樣品分別進行批內(nèi)和批間重復性試驗，統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示其變異系數(shù)分別為0.6%～2.0%和3.8%～6.0%，變異系數(shù)均小于10%（表4）。表明本研究建立的間接ELISA方法重復性較好。

表4 間接ELISA方法的重復性試驗結(jié)果Table 4 The repeatability evaluation of the indirect ELISA

2.7 符合率試驗結(jié)果利用本實驗建立的間接ELISA 方法和病毒中和試驗同時對120 份鵝血清進行檢測，結(jié)果顯示間接ELISA 方法檢測出43 份陽性血清，77 份陰性血清；病毒中和試驗檢測出36 份陽性血清，84 份陰性血清，二者的總符合率為94.2%，Kappa 系數(shù)為0.868，二者具有較高的符合率和一致性，表明該間接ELISA 方法檢測結(jié)果較準確。

2.8 臨床樣品的檢測結(jié)果利用本研究建立的間接ELISA 方法對江西及周邊省份采集的670 份鵝血清樣品進行檢測，結(jié)果顯示，其中陽性血清樣品214份，陰性血清樣品456 份，陽性率為32.0%。結(jié)果表明江西及周邊省份鵝群中GoAstV 感染率較高，且本研究建立的間接ELISA 方法可用于臨床樣品的檢測。

3 討 論

星狀病毒是一種具有廣泛宿主范圍的病毒，可以分為感染哺乳動物（人、豬、綿羊、牛、貓等）的哺乳動物星狀病毒和感染禽類（雞、鴨）的禽星狀病毒。哺乳動物星狀病毒主要引起宿主胃腸炎和腹瀉，而禽星狀病毒感染主引起雞腎炎、肝炎、腸炎等。自2017 年以來，我國華北、華中、華南等多地鵝場暴發(fā)了一種以關(guān)節(jié)痛風和內(nèi)臟痛風為主要特征的致死性傳染病，該病由一種新型GoAstV 引起，該病毒主要侵害5 日齡～20 日齡的雛鵝，感染的鵝各內(nèi)臟器官及關(guān)節(jié)出現(xiàn)大量白色尿酸鹽沉積，給養(yǎng)鵝產(chǎn)業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[11]。余明興等對福建地區(qū)患鵝腫大關(guān)節(jié)、有尿酸鹽沉積的內(nèi)臟組織檢測，結(jié)果顯示GoAstV 的陽性率為33.33%[12]。苗艷等對采集的50 份組織樣品檢測，GoAstV 的陽性率為70.00%，與GPV 混合感染率為4.00%[13]。最新研究發(fā)現(xiàn)，GoAstV可使番鴨和櫻桃谷鴨發(fā)生腎出血、腫脹、內(nèi)臟尿酸鹽沉積，死亡率高達61%，結(jié)果表明GoAstV在家養(yǎng)水禽之間存在跨物種傳播的可能，并且可以對水禽造成嚴重的危害[14-16]。因此，建立一種適合大規(guī)?？焖贆z測GoAstV的方法對防控GoAstV的流行與傳播意義重大。

目前，GoAstV 的檢測主要以RT-PCR 為主，該方法需要采集鵝內(nèi)臟器官提取病毒核酸后檢測，大規(guī)模檢測對于養(yǎng)殖戶存在一定困難，并且GoAstV 為RNA 病毒，對檢測人員和設備均具有較高的要求，不適合臨床大規(guī)模監(jiān)測；本研究首次建立的GoAstV間接ELISA 抗體的檢測方法敏感度高、特異性強、重復性和穩(wěn)定性好，可以用于臨床樣品中GoAstV 抗體的檢測。Cap 蛋白是GoAstV 唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2 基因轉(zhuǎn)錄翻譯后可被胰蛋白酶水解加工成VP34、VP27/29 和VP25/26，其中VP34 來自Cap 蛋白高度保守的N 端，組成病毒的衣殼結(jié)構(gòu)，VP27/29 和VP25/26 來自Cap 蛋白高度變異的C 端，以二聚體形式組成病毒突起的外表面結(jié)構(gòu)[4]。Cap 蛋白高度保守的N 端相對于其高度變異的C 端，具有更高的保守性且在病毒中含量高，是建立GoAstV血清學檢測方法的首選抗原[4]。相對于包涵體蛋白，可溶性蛋白純化簡單，不需要溶解、復性等步驟，可大幅降低生產(chǎn)成本，且包涵體抗原性比可溶性蛋白差。為此，本研究根據(jù)GoAstV Cap 基因N 末端的保守區(qū)域，構(gòu)建pCold I-Cap 重組原核表達質(zhì)粒，經(jīng)低溫誘導表達純化獲得高純度的可溶性rCap，經(jīng)western blot 分析表明，rCap具有很好的反應原性。利用純化的rCap 作為包被抗原，經(jīng)各反應條件優(yōu)化，最終確定了最佳反應條件，建立了GoAstV間接ELISA抗體的檢測方法，且該方法特異性強、敏感性高、重復性好，與病毒中和試驗的符合率較高為94.2%。利用建立的間接ELISA 方法對江西及周邊省份采集的670 份鵝血清檢測，結(jié)果顯示GoAstV 可以感染各年齡段的鵝，總陽性率為32.0%，與Zhang 等的研究結(jié)果相似[1]；調(diào)查數(shù)據(jù)還顯示雛鵝GoAstV 抗體的陽性率最高，為42.3%（113/267），這也充分表明江西及周邊地區(qū)GoAstV的感染水平較高。綜上所述，本研究建立的GoAstV間接ELISA抗體的檢測方法，可以用于臨床GoAstV 的抗體檢測，為GoAstV感染疫病的防控提供了切實可行的方法。