蒲吉洲，文 靜，廖 麗，楊澤明，李佳鑫，鄒永芳，陳識澳，青 倩

（1.舍得酒業(yè)股份有限公司，四川射洪 629200；2.四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院，四川宜賓 644005）

“曲為酒之骨”，大曲作為白酒生產(chǎn)不可或缺的糖化發(fā)酵劑，在為白酒發(fā)酵提供微生物的同時，也提供了大量的酶和原料物質(zhì)，大曲的品質(zhì)與白酒的品質(zhì)和產(chǎn)量有著密切的關(guān)系。大曲是開放式生產(chǎn)，原料、空氣、工具、場地等生態(tài)環(huán)境中的微生物可以通過自然接種方式在曲坯上富集形成復(fù)雜微生物群落。目前大量研究表明，大曲的生產(chǎn)與環(huán)境中的微生物密切相關(guān)，例如不同的生產(chǎn)環(huán)境、地理因素等會造成大曲品質(zhì)的差異；不同地區(qū)生產(chǎn)的大曲質(zhì)量和微生物組成群落有較大的差異；不同季節(jié)、不同地域生產(chǎn)的大曲微生物群落不相同。目前有許多研究學(xué)者針對大曲與生產(chǎn)環(huán)境存在的關(guān)系開展了大量研究。唐玉明等對曲房上中下不同位置空氣微生物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)空氣中酵母菌和細(xì)菌與大曲酸度呈顯著相關(guān)。Du在類似的研究中表示新大曲中有82 %的細(xì)菌來源于原料，10 %來源于室內(nèi)地面，2%來源于室內(nèi)空氣；生產(chǎn)工具、室內(nèi)地面、室外地面共為新大曲提供了超過90 %的真菌。可見釀酒微生物除了來源于室內(nèi)、原料、空氣等，還來源于室外地面。

《美國國家科學(xué)院院刊》上的一項研究結(jié)果表明，土壤微生物多樣性與作為凋落物的植物化學(xué)組分的多樣性存在正相關(guān)。土壤是生態(tài)環(huán)境的基礎(chǔ)，其物理化學(xué)性質(zhì)、養(yǎng)分的有效性、區(qū)域氣候、植被類型等眾多環(huán)境因素會對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和組成產(chǎn)生影響。如植被類型，它除了有維持生態(tài)系統(tǒng)物種多樣性、主導(dǎo)群落更新演替、加速群落植被恢復(fù)進(jìn)程等多種功能，還可以通過凋落物和分泌物為土壤微生物提供營養(yǎng)，促進(jìn)植物和微生物之間的協(xié)同進(jìn)化，提升土壤微生物的多樣性。目前關(guān)于植被對制曲微生物的影響還鮮有報道。

因此，本試驗采用高通量測序、理化檢測、植被組成等對制曲植被、植被下土壤及制曲相關(guān)微生物進(jìn)行分析，運用相關(guān)性、主成分、聚類分析探索濃香大曲相關(guān)微生物、土壤、植被組成之間的關(guān)聯(lián)。本研究以沱牌舍得制曲園區(qū)不同植被組成及土壤環(huán)境為研究對象，分析其微生物群落特征，土壤理化性質(zhì)，分析影響土壤微生物分布的理化因素，并分析不同植被下與制曲相關(guān)的真菌、細(xì)菌。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究制曲微生物與植被的關(guān)系，以建立適宜濃香制曲的植被生態(tài)評價，為生態(tài)釀酒提供科學(xué)的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：見1.2.1樣品采集部分。

試劑及耗材：氫氧化鈉、碳酸氫鈉、硼酸等（均為分析純），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；重鉻酸鉀、高錳酸鉀、硫酸等（均為分析純），成都市科隆化學(xué)品有限公司。

儀器設(shè)備：AT-710 自動電位滴定儀，日本京都電子公司；UV-5100B 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；K1100 全自動凱式定氮儀、SH220F 石墨消解儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；BSD-YZ2200 立式智能精密搖床，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；VeritiFAST 梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechain reaction，PCR)儀，美 國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集

在制曲園區(qū)內(nèi)根據(jù)植被組成設(shè)置5 個代表取樣圈(編號C1—C5)，每圈設(shè)置20 個取樣點，每個取樣點在1 cm范圍內(nèi)采用“五點取樣法”采集10～20 cm 深度腐殖層土壤(并記錄植被組成)，立即混合成單個土壤樣品共20 個土樣。土樣過2 mm 篩后分成兩份，一部分自然風(fēng)干，用于土壤物理和化學(xué)性質(zhì)的測定；另一部分土樣用于微生物測序，土壤真菌測序區(qū)域為ITS1，細(xì)菌測序區(qū)域為V4。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)測定

土樣采用LU描述的標(biāo)準(zhǔn)土壤試驗方法分析。烘箱105 ℃烘干24 h后測定含水量和容重；pH采用離子交換法測定；有機(jī)質(zhì)和有機(jī)碳采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定；全氮采用微量凱氏定氮法測定；速效磷采用鉬藍(lán)比色法測定；速效鉀采用比濁法測定。

1.2.3 生物信息學(xué)分析

使用FLASH(V1.2.7)對原始序列進(jìn)行拼接，fastp(V0.19.6)對數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控獲得優(yōu)化序列，使用Qiime2 (v2020.2)對數(shù)據(jù)進(jìn)行降噪(DADA2)獲得樣本中真實的序列信息ASV(Amplicon Sequence Variant)，基于ASV 代表序列信息和豐度信息，進(jìn)行后續(xù)的物種分類學(xué)分析、群落多樣性分析等。物種注釋方法為bayes 法，注釋數(shù)據(jù)庫為Silva138（細(xì)菌）、Unite8.0（真菌）。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

基于上述分析，可以了解到游客對現(xiàn)階段四川旅游團(tuán)餐滿意度的綜合評價.本研究表明，在28個感知特征項中，每對變量的滿意度均低于重要性，配對t檢驗也證明各項特征值的重要性和滿意度之間存在著顯著差異，這說明游客對四川旅游產(chǎn)品中的旅游團(tuán)餐績效表現(xiàn)各方面的滿意度感知較低，特別是菜品質(zhì)量是影響游客滿意度的最主要因素.因此，在明確了應(yīng)該優(yōu)先改進(jìn)的重點項目后，各利益相關(guān)主體不僅要采取具體措施來改善菜品質(zhì)量，也要重視影響游客實際體驗的用餐環(huán)境及用餐服務(wù)，才能全面提升四川旅游團(tuán)餐的游客滿意度，進(jìn)而增強(qiáng)四川旅游產(chǎn)品的綜合競爭力.

使用SPSS22.0 進(jìn)行方差分析、主成分分析、相關(guān)性分析，顯著水平設(shè)定為0.05；mothur 1.30 用于Alpha 多樣性指數(shù)分析，使用豐富度指數(shù)Chao 指數(shù)和多樣性指數(shù)Shannon 指數(shù)分析土壤微生物的alpha多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 代表圈土壤理化指標(biāo)

由表1 和表2 可知，各圈容重、水解性氮、過氧化氫酶、磷酸酶活性存在顯著性影響(P＜0.05)，其他指標(biāo)差異性不大。

表1 代表圈層理化指標(biāo)

表2 代表圈層理化指標(biāo)

2.2 制曲車間植被組成情況

按照各圈取樣點植被組成的相似性，歸為10組，見表3。

表3 制曲車間主要植被組成

2.3 制曲相關(guān)微生物

2.3.1 制曲相關(guān)細(xì)菌

高通量測序在屬水平上共鑒定出16 種存在于大曲中的主要細(xì)菌。制曲相關(guān)細(xì)菌分別為不動桿菌屬()、放線菌屬()、桿狀細(xì)菌()、短芽孢桿菌()、棒狀桿菌屬()、腸球菌()、梭形桿菌屬()、乳酸桿菌()、奈瑟氏球菌屬()、嗜糖假單胞菌()、假單胞菌()、羅斯氏菌屬()、葡萄球菌屬()、糖多孢菌屬()、鏈(狀)球菌()、高溫放線菌屬()。其中假單胞菌()、乳酸桿菌()、高溫放線菌屬()相對豐度含量最高，為制曲相關(guān)優(yōu)勢菌屬（見圖1）。

圖1 制曲車間土壤與大曲相關(guān)細(xì)菌及豐度變化

選擇主要制曲相關(guān)細(xì)菌與理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，見圖2。由圖2 可知，芽孢桿菌屬()、高溫放線菌屬()、糖多孢菌屬()、短芽孢桿菌()與土壤有機(jī)碳、有機(jī)質(zhì)、速效鉀、全氮含量正相關(guān)，與水解性氮、過氧化氫酶活性、容重負(fù)相關(guān)，此外這些制曲相關(guān)細(xì)菌與第三圈樣品分布相關(guān)性較高，第三圈主要植被組成分布為5 號（珊瑚樹，秤星樹），6 號（桂花，銀杏，沿階草）即芽孢桿菌屬()、高溫放線菌屬()、糖多孢菌屬()、短芽孢桿菌()與珊瑚樹，秤星樹，桂花，銀杏，沿階草關(guān)系密切；假單胞菌(）屬與水分含量、pH 值負(fù)相關(guān)，與有效磷含量、水解性氮、過氧化氫酶活性及容重正相關(guān)，與第五圈植被（松樹、柏樹）以及第二圈植被（紫薇，女貞，桉樹，南天竹）相關(guān)性密切。

圖2 細(xì)菌與理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析

2.3.2 制曲相關(guān)真菌

圖3 制曲土壤與大曲相關(guān)真菌及其相對豐度變化

選擇主要制曲相關(guān)真菌與理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，由圖4 可知，交鏈孢屬()相對豐度與土壤pH 值顯著負(fù)相關(guān)，與水分含量、磷酸酶活性、過氧化氫酶活性有一定負(fù)相關(guān)，與其他指標(biāo)相關(guān)性不強(qiáng)。鐮刀菌屬（）受第一圈（桂花，沿階草，臘梅，紫薇；紫薇，臘梅，沿階草，桂花，南天竹）和第四圈（沿階草，小香樟，桂花）樣品影響最大，與水分含量和土壤pH 值關(guān)系最密切。與水分含量、有機(jī)碳含量、有機(jī)質(zhì)含量、有效磷含量有較強(qiáng)的正相關(guān)，并與第二圈（紫薇，女貞，桉樹，南天竹）、第三圈（珊瑚樹，秤星樹）植被分布關(guān)系密切。曲霉屬()與水分含量有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，與其他指標(biāo)相關(guān)性不強(qiáng)。附球菌屬()、假絲酵母屬()與容重、過氧化氫酶活性和pH 值有微弱的正向關(guān)系，與其他指標(biāo)均是負(fù)相關(guān)，并與第一圈（桂花，沿階草，臘梅，紫薇；紫薇，臘梅，沿階草，桂花，南天竹）、第二圈（紫薇，女貞，桉樹，南天竹）和第三圈（珊瑚樹，秤星樹）植被關(guān)系密切。與容重有較強(qiáng)的正相關(guān)，與水分含量、有機(jī)碳含量、有機(jī)質(zhì)含量有較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)。主要受速效鉀、脲酶以及過氧化氫酶影響。毛孢子菌屬()與大多數(shù)理化指標(biāo)有正向的關(guān)系。

圖4 真菌與理化指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析

2.4 不同植被下理化指標(biāo)及微生物分布情況

2.4.1 不同植被下土壤理化指標(biāo)

按照各圈取樣點植被組成的相似性，歸為10組，將植被相似的取樣點位土壤樣品用于分析。由表4 和表5 可知，有機(jī)碳、全氮、速效鉀在10 組植被組合下存在顯著性差異，說明不同植被組合對其影響大；磷酸酶活性、容重不存在顯著性差異；pH 值、水分、有機(jī)質(zhì)、水解性氮等理化指標(biāo)在10 組植被組合下有所差異但差異較小。

表4 10組植被狀態(tài)下理化指標(biāo)

表5 10組植被狀態(tài)下理化指標(biāo)

2.4.2 不同植被下真菌和細(xì)菌分布情況

由表6 可知，植被2 有最高的真菌多樣性，最適宜真菌生長，植被6 組成下細(xì)菌的多樣性最高，因此，十種植被組成中最適宜真菌和細(xì)菌生長的植被分別為：紫薇，臘梅，沿階草，桂花，南天竹；銀杏，沿階草為主。

表6 不同植被下真菌細(xì)菌多樣性指數(shù)及OTU數(shù)量

表7 統(tǒng)計了大曲相關(guān)真菌和細(xì)菌在不同植被下的豐度和頻率。7 號（黃桷樹，竹林）植被組成土壤下制曲相關(guān)真菌出現(xiàn)的頻率最高，其次是6 號、5號；7 號（黃桷樹，竹林）植被組成土壤下制曲相關(guān)細(xì)菌出現(xiàn)的頻率也是最高的，其次是3 號、2 號。就相關(guān)菌出現(xiàn)頻率而言，7 號（黃桷樹，竹林）植被組成最適宜大曲相關(guān)微生物的生長，2 號、3 號、5 號也較適宜大曲相關(guān)微生物生長。從豐度來看，10 號、6號、5號植被土壤相關(guān)真菌總豐度最高，4號、7號、9 號植被組成土壤相關(guān)細(xì)菌總豐度最高。綜合來看，5 號（珊瑚樹，秤星樹）和6 號（桂花，銀杏，沿階草）植被組成下，制曲相關(guān)真菌出現(xiàn)的頻率和豐度均較高；7 號（黃桷樹，竹林）植被下，制曲相關(guān)細(xì)菌豐度及出現(xiàn)頻率均較高。

表7 不同植被下制曲相關(guān)微生物出現(xiàn)頻率和豐度

2.5 制曲植被生態(tài)評價

2.5.1 主成分分析

對不同植被組成下的理化指標(biāo)、微生物指標(biāo)以及制曲相關(guān)微生物指標(biāo)進(jìn)行主成分分析。根據(jù)特征值大于1 的原則提取了6 個主成分，6 個主成分特征值分別為6.21、3.46、2.63、1.97、1.50、1.05，6 個主成分的方差貢獻(xiàn)率分別為34.49 %、19.19 %、14.60%、10.96%、8.33%、5.82%，累計方差貢獻(xiàn)率為93.4%，即這6個主成分能反映原始數(shù)據(jù)93.24%的信息量，因此可以將這6 個成分用于主成分分析。通過主成分分析得到表8 中的載荷系數(shù)，該系數(shù)能夠反應(yīng)各指標(biāo)影響程度，絕對值越大表明該變量的貢獻(xiàn)越大。

表8 主成分因子載荷矩陣

由表8 可知，主成分1 方差貢獻(xiàn)率為34.49 %，有機(jī)碳、全氮、磷酸酶活性在主成分1 上的載荷較大；主成分2 方差貢獻(xiàn)率為19.19%，制曲相關(guān)細(xì)菌出現(xiàn)頻率、pH 值、水解性氮含量在主成分2 上的載荷較大；主成分3 方差貢獻(xiàn)率為14.60 %，水分含量、有效磷、速效鉀含量在主成分3 上的載荷較大；主成分4 方差貢獻(xiàn)率為10.96%，制曲相關(guān)真菌、細(xì)菌豐度在主成分4 上的載荷較大；主成分5 方差貢獻(xiàn)率為8.33%，土壤細(xì)菌Chao 指數(shù)在主成分5 上的載荷較大；主成分6 方差貢獻(xiàn)率為5.82 %，脲酶活性在主成分6 上的載荷較大。將各指標(biāo)主成分載荷除以相對應(yīng)特征值開平方根（即特征向量），將得到的特征向量與標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)相乘，就可以得出主成分表達(dá)式。

主成分3、主成分4、主成分5、主成分6 得分計算方法同理(LH1'表示LH1標(biāo)準(zhǔn)化后的值)，見表9。

表9 主成分系數(shù)向量

根據(jù)公式計算各植被組成的主成分得分，把不同植被下的各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)代入以上線性模型，可以計算出各類型植被分別在6 個主成分上的得分Zi。以各主成分的方差貢獻(xiàn)率為權(quán)重，根據(jù)以下評價函數(shù)計算綜合得分。

由表10 綜合評分可知，植被組成3 綜合評價得分最高，植被組3 成主要分布在制曲車間第二圈，植被組成7 得分第二。排行前5 的植被組成均與其環(huán)境土壤營養(yǎng)水平、微生物多樣性、制曲相關(guān)微生物出現(xiàn)頻率高的分布規(guī)律基本相符合，可見評價結(jié)果具有一定的參考價值。該評價結(jié)合了制曲相關(guān)微生物的分布，因此，各植被的得分高低能在一定程度上體現(xiàn)對于制曲活動的價值高低。

表10 制曲車間不同植被評價得分和排序

2.5.2 聚類分析

根據(jù)各植被綜合評價得分對各類型進(jìn)行系統(tǒng)聚類，以歐氏距離5 將10 種植被進(jìn)行聚類。由圖5可知，組合3（紫薇，女貞，桉樹，南天竹）、組合5（珊瑚樹，秤星樹）、組合7(黃桷樹，竹林)被歸為一類，與主成分分析結(jié)果一致，說明這三組植被有益于生態(tài)制曲。

圖5 制曲車間植被聚類分析結(jié)果

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，不同植被組下的土壤pH 值、水分、有機(jī)碳、有機(jī)質(zhì)等理化指標(biāo)都與濃香大曲真菌和細(xì)菌豐度等存在一定的相關(guān)性；10組植被下的土壤指標(biāo)有機(jī)碳、全氮、速效鉀存在顯著性差異(P＜0.05)。綜合不同植被組成環(huán)境下制曲相關(guān)微生物出現(xiàn)頻數(shù)和豐度等，通過主成分析與聚類分析得出適宜濃香制曲微生態(tài)的植被生態(tài)：紫薇，女貞，桉樹，南天竹；珊瑚樹，秤星樹；黃桷樹，竹林。