郭 婷，宋 娜，高天翔，劉淑德

(1.淄博市淄川區(qū)般陽中學(xué)，山東 淄博 255110；2.中國海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，山東 青島 266000；3.浙江海洋大學(xué)，浙江 舟山 316000；4.山東省漁業(yè)發(fā)展和資源養(yǎng)護(hù)總站，山東 煙臺 264003)

引 言

大瀧六線魚(Hexagrammosotakii)隸屬于鲉形目(Scorpaeniformes)、六線魚亞目(Hexagrammoidei)、六線魚科(Hexagrammidae)、六線魚屬(Hexagrammos)，俗稱黃魚、黃棒子[1-2]。大瀧六線魚主要分布于我國遼寧、山東近海以及韓國、朝鮮、日本等國近海巖礁區(qū)，為冷溫性底層魚類[3]。其味道鮮美且具有較高的營養(yǎng)價值[4]，因此受到廣大消費(fèi)者青睞。大瀧六線魚懷卵量少、繁殖力低，近年又受到過度捕撈、近海環(huán)境污染等因素影響，其自然資源逐漸匱乏[5]。自2010年潘雷等[6]、胡發(fā)文等[7]突破大瀧六線魚人工養(yǎng)殖技術(shù)難題后，大瀧六線魚實現(xiàn)規(guī)模化養(yǎng)殖，為增殖放流活動的開展奠定了基礎(chǔ)，目前，大瀧六線魚已成為山東省重要的增殖放流物種之一[8]。據(jù)山東省水生生物資源養(yǎng)護(hù)管理中心統(tǒng)計，近五年，山東省大瀧六線魚放流數(shù)量由2015年的35.9萬尾，逐漸增長至2019年的332.4萬尾，累計放流1 100余萬尾。

在增殖放流實施過程中，苗種質(zhì)量是增殖放流成功開展的關(guān)鍵[9-12]。因此，為了防止出現(xiàn)大規(guī)模增殖放流活動帶來的降低該物種自然海域內(nèi)野生群體遺傳多樣性的情況，開展大瀧六線魚親魚、放流苗種和回捕群體遺傳多樣性研究具有重要意義，并為后續(xù)增殖放流的開展提供理論基礎(chǔ)。線粒體DNA為閉合雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由于受選擇壓力較小且缺乏校對修復(fù)機(jī)制，故具進(jìn)化速率快、遵循母系遺傳定律等特點，其突變后形成的多態(tài)位點可反應(yīng)不同群體的遺傳結(jié)構(gòu)，已廣泛應(yīng)用于海洋生物的群體遺傳學(xué)研究[13-14]。例如，張輝等利用線粒體控制區(qū)片段對中國對蝦養(yǎng)殖群體和野生群體進(jìn)行遺傳多樣性比較，結(jié)果顯示野生群體遺傳多樣性略高于養(yǎng)殖群體，且養(yǎng)殖群體與野生群體間存在顯著的遺傳分化[15]。楊爽等通過線粒體控制區(qū)片段對三疣梭子蟹親蟹進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示4個親蟹群體遺傳多樣性均較高，且與放流海域內(nèi)野生群體無明顯遺傳分化[16]。陳文靜等通過線粒體DNA控制區(qū)全序列對鄱陽湖水域中鰱的放流群體和野生群體進(jìn)行遺傳多樣性比較，結(jié)果顯示，放流群體導(dǎo)致該水域中自然群體的遺傳結(jié)構(gòu)分化，建議規(guī)劃其增殖放流工作[17]因此，本研究擬采用線粒體DNA中控制區(qū)高變區(qū)序列對榮成近海大瀧六線魚親魚、放流苗種及回捕群體開展遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)的分析，以期了解大瀧六線魚用于繁殖放流苗種的親魚、放流苗種的遺傳背景，以及與回捕群體間遺傳多樣性差異，為我國大瀧六線魚增殖放流的后續(xù)開展提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

本研究中采樣地點見圖1，詳細(xì)采樣信息見表1。所有樣品進(jìn)行生物學(xué)測量后，取魚體背部新鮮肌肉于凍存管中，加入無水乙醇固定并于-20 ℃保存以備后續(xù)DNA提取。

圖1 大瀧六線魚樣品采集地點

表1 大瀧六線魚樣本信息

1.2 基因組DNA的提取及線粒體控制區(qū)片段的擴(kuò)增

基因組DNA的提取使用天根生化科技(北京)有限公司海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(DP324-03)進(jìn)行提取，并保存于-20 ℃?？刂茀^(qū)擴(kuò)增序列引物及PCR反應(yīng)條件參見劉奇[18]，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后選取目的片段明亮的個體送至天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將生物公司測得序列用DNASTA軟件包(DNASTAR，Inc., Madison, USA)依據(jù)峰圖進(jìn)行編輯和校對。用軟件MEGA 6.0[19]統(tǒng)計堿基組成、保守位點、變異位點、簡約信息位點等分子多態(tài)性指數(shù)，用DNASP5.10軟件計算序列的單倍型數(shù)(h)、單倍型多樣性指數(shù)(Hd)、核苷酸多樣性指數(shù)(π)。使用ARLEQUIN[20]軟件(Ver.3.0)進(jìn)行群體間確切P檢驗并計算兩兩群體間遺傳分化指數(shù)(Fst)，并分別計算群體間和群體內(nèi)分子變異分析(AMOVA)；使用MEGA 6.0[19]軟件基于Kimura 2-paramter構(gòu)建的大瀧六線魚單倍型鄰接關(guān)系樹，Bootstrap檢驗次數(shù)為1 000次。

2 實驗結(jié)果

2.1 控制區(qū)序列多態(tài)及遺傳多樣性

經(jīng)PCR擴(kuò)增測序成功后獲得線粒體控制區(qū)第一高變區(qū)序列，在GenBank上與已有的大瀧六線魚控制區(qū)序列進(jìn)行比對分析，并在DNASTAR中截取目的片段，共獲得629條長度為436 bp的大瀧六線魚控制區(qū)第一高變區(qū)序列。A、G、T、C堿基的平均含量分別為33.32%、17.36%、34.61%、14.71%。A+T(67.93%)含量明顯高于G+C(32.07%)含量，表現(xiàn)出較明顯的堿基組成偏倚性，與脊椎動物線粒體DNA控制區(qū)堿基特征相符合。在629尾大瀧六線魚的控制區(qū)序列中，檢測保守位點有372個，變異位點有64個，簡約信息位點有35個，插入/缺失位點為4個。

通過MEGA 6.0[20]軟件基于Kimura 2-paramter構(gòu)建的大瀧六線魚單倍型鄰接關(guān)系樹(圖2)，Bootstrap檢驗次數(shù)為1 000次。圖2顯示629條大瀧六線魚控制區(qū)序列共定義了163種單倍型，其中Hap_5、Hap_23、Hap_35為6個群體間共享單倍型，占單倍型總數(shù)目的1.84%。共享單倍型中親魚、放流苗種、回捕群體總個體數(shù)分別為：73、78、51，分別占各群體總數(shù)比例為31.47%、28.26%、42.15%。

圖2 基于大瀧六線魚線粒體控制區(qū)單倍型構(gòu)建的NJ系統(tǒng)樹

大瀧六線魚遺傳多樣性參數(shù)見表2。6個群體核苷酸多樣度范圍為0.006 8±0.004 1～0.009 2±0.005 1，單倍型多樣度范圍為0.911 8±0.027 8～0.958 8±0.008 0；6個群體中HHYZ群體核苷酸多樣度指數(shù)及兩兩序列平均堿基差異指數(shù)均處于最高水平，WDYZ群體單倍型多樣度處于最高水平，HHYZ次之，而FIHB群體核苷酸多樣度指數(shù)及兩兩序列平均堿基差異指數(shù)均處于最低水平，SEHB群體單倍型多樣度處于最低水平，表明放流苗種遺傳多樣性較高。

表2 大瀧六線魚遺傳多樣性參數(shù)

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳分化

經(jīng)Bonferroni校正后兩兩群體間遺傳分化指數(shù)見表3，6個群體間Fst范圍為-0.006 1～0.007 5，RCQB和HHYZ之間Fst最大(0.007 5)，WDYZ和FIHB之間Fst最小(-0.006 1)，除親本與放流苗種之間存在顯著的遺傳差異之外，親本與回捕群體以及放流苗種與回捕群體之間遺傳分化指數(shù)差異較小，遺傳差異較小。

表3 基于線粒體控制區(qū)第一高變區(qū)序列的大瀧六線魚遺傳分化指數(shù)Fst

進(jìn)行群體間分子方差分析(AMOVA)時，將6個群體看做一個組群分析，結(jié)果顯示99.64%的變異來自于群體內(nèi)，僅0.36%的變異來自于群體間，且群體間存在顯著的遺傳分化(P<0.05)；將6個群體按照大瀧六線魚親魚(RCQB)、放流苗種(WDYZ、HHYZ)、回捕群體(FIHB、SEHB、THHB)進(jìn)行分組，結(jié)果顯示，組群間變異百分比為0.58，分組內(nèi)組群間變異百分比為-0.22，群體內(nèi)變異百分比為99.64，遺傳分化均不顯著(P>0.05)，兩種方式的分子方差分析(AMOVA)結(jié)果均顯示高達(dá)99.64%的變異來自于群體內(nèi)(表4)。

表4 大瀧六線魚群體的分子方差分析

3 討論

生物群體遺傳多樣性是生物適應(yīng)環(huán)境和進(jìn)化的基礎(chǔ)，生物群體擁有愈豐富的遺傳多樣性和變異性，其對于復(fù)雜多變的生物環(huán)境的適應(yīng)能力愈強(qiáng)，其進(jìn)化潛力愈大[21]。近年來，隨著增殖放流力度的不斷加大，其產(chǎn)生的遺傳學(xué)影響逐漸成為研究增殖放流成效的焦點[22]，有研究認(rèn)為使用大量無親緣關(guān)系的親本進(jìn)行繁殖可避免遺傳漂變的發(fā)生[23]。FAO早期曾提出，為了保障放流苗種的遺傳多樣性，應(yīng)當(dāng)依據(jù)苗種繁育工程量至少選用50至500尾的親魚參與繁育過程[24]。Allendorf and Phelps研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)人工繁育苗種的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)與野生群體差異較大時，增殖放流的進(jìn)行將會對野生群體產(chǎn)生嚴(yán)重的遺傳危害[25]。因此對放流苗種遺傳多樣性進(jìn)行監(jiān)測，是有效預(yù)防放流群體對野生群體產(chǎn)生有害影響以及安全開展增殖放流工作的前提[26]。

Blankenship等認(rèn)為開展對放流物種親本和放流群體的遺傳多樣性監(jiān)測與管理應(yīng)當(dāng)成為評估增殖放流效果成效的重要內(nèi)容[27]。本研究中結(jié)果顯示，大瀧六線魚親魚、放流苗種核苷酸多樣度和單倍型多樣度均較高，表明其較好的種質(zhì)資源，因此適合作為增殖放流的苗種進(jìn)行放流；沈朕等(2017)通過線粒體控制區(qū)片段發(fā)現(xiàn)即墨大瀧六線魚養(yǎng)殖群體的核苷酸多樣性和單倍型多樣性分別為0.003 54、0.657[28]，均遠(yuǎn)低于本研究中大瀧六線魚暫養(yǎng)階段遺傳多樣性指數(shù)；Allendorf研究也說明放流苗種在人工暫養(yǎng)階段與普通人工繁育苗種不同，需要更加嚴(yán)格的管理，從而保證苗種更好的保存親魚的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)[29]。在2019年7月28日于威海市文登區(qū)五壘島灣進(jìn)行人工放流后，于9月份開始在放流點附近海域采集回捕樣品，回捕樣品的遺傳多樣性指數(shù)相較于親本和放流苗種而言，呈現(xiàn)下降趨勢，其可能原因其一為從榮成近海捕撈的大瀧六線魚親本來源復(fù)雜；其二為回捕群體采樣數(shù)量較少，遺傳信息覆蓋不全面，從而使整體遺傳多樣性呈現(xiàn)下降趨勢。趙文溪等(2019)通過線粒體控制區(qū)片段發(fā)現(xiàn)榮成大瀧六線魚群體單倍型多樣度為0.868，核苷酸多樣性為0.005，均低于本研究中回捕群體遺傳多樣性指數(shù)，同時，趙文溪等(2019)結(jié)果也顯示山東近海大瀧六線魚核苷酸多樣性均值為0.007，單倍型多樣性均值為0.922[30]，與本研究中回捕群體遺傳多樣性指數(shù)相近，表明本研究中回捕群體依然擁有較高的遺傳多樣性。因此，隨著大瀧六線魚每年增殖放流活動的開展，威海近海大瀧六線魚群體遺傳多樣性并未呈現(xiàn)明顯的降低。

本研究中，兩兩群體間的Fst結(jié)果顯示僅大瀧六線魚親魚(RCQB)與放流苗種(WDYZ、HHYZ)之間存在較小但顯著的遺傳分化，而大瀧六線魚親魚和回捕群體以及放流苗種和回捕群體之間均不存在顯著的遺傳分化；同時AMOVA結(jié)果也顯示，不管將6個群體看做一個基因池還是三個基因池，均有超過99%的變異發(fā)生于群體內(nèi)部，僅不足1%的變異發(fā)生于群體間。以上實驗結(jié)果均說明大瀧六線魚親魚、放流苗種和回捕群體之間的遺傳差異較小，Lynch研究認(rèn)為子代通常會攜帶和親魚的生存環(huán)境相適應(yīng)的基因型[31]，據(jù)了解，用于繁殖大瀧六線魚放流苗種的親魚一部分為榮成近海捕撈的野生大瀧六線魚個體，之后暫養(yǎng)于海上，并在海上完成受精等工作，待精卵結(jié)合后將鋪在孵化盤中的受精卵帶回養(yǎng)殖場開始放流前的暫養(yǎng)，另一部分為養(yǎng)殖場自己培育的親魚，繁殖均在養(yǎng)殖場進(jìn)行，復(fù)雜的親本來源較好的保持了親本的遺傳多樣性，并遺傳子代其適應(yīng)海域的基因型，有助于提高后續(xù)增殖放流苗種在自然海域內(nèi)的成活率?；夭度后w較高的遺傳多樣性指數(shù)也說明增殖放流所用苗種種質(zhì)資源較好，未造成自然海域內(nèi)大瀧六線魚群體遺傳多樣性下降的現(xiàn)象。

總而言之，本研究中大瀧六線魚親魚、放流苗種以及回捕群體均具有較高的遺傳多樣性，且其之間無明顯的遺傳分化，說明大瀧六線魚增殖放流工作的進(jìn)行是有意義的。在增殖放流活動進(jìn)行之前將生長到一定規(guī)格的苗種在自然海域內(nèi)暫養(yǎng)一段時間，有助于提高放流苗種適應(yīng)自然環(huán)境的能力，并提高放流苗種放流后的成活率[32-34]。因此我們建議在后期增殖放流工作的開展應(yīng)盡可能選取在放流海域獲取的野生大瀧六線魚親本，以保證其繁育苗種的質(zhì)量，提高實際參與繁殖的親本數(shù)量，同時在暫養(yǎng)階段，加強(qiáng)對放流苗種的科學(xué)管理，并在增殖放流后期開展對自然海域內(nèi)野生群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)監(jiān)測，以防出現(xiàn)大規(guī)模增殖放流降低野生群體遺傳多樣性的現(xiàn)象。