胡焱，王海娟，王宏鑌

（昆明理工大學環(huán)境科學與工程學院/云南省土壤固碳與污染控制重點實驗室，昆明 650500）

2020年中國農(nóng)用地土壤污染狀況詳查結果顯示，影響農(nóng)用地土壤環(huán)境質量的主要污染物為重金屬，其中鎘（Cd）為首要污染物[1]。在Cd污染土壤的修復植物中，紫茉莉（Mirabilis jalapaL.）對Cd具有極強的耐性，在200 mg·kg-1Cd污染土壤上生長3個月，其地上部生物量僅比對照減少8%，且地上部Cd含量達到92.82 mg·kg-1，已接近Cd超富集植物的標準[2]。因此，作為外來入侵植物的紫茉莉不失為一種具有Cd富集能力的修復植物。此外，紫茉莉株高可達1 m，生性強健，適應性強，養(yǎng)護管理粗放；喜溫和而濕潤的氣候條件，不耐寒，經(jīng)霜即凋，冬季地上部分枯死；喜深厚、疏松肥沃的壤土夾砂土，較耐干旱，喜通風良好環(huán)境，在略有蔽蔭處生長更佳，且在中國南北各地常有栽培。

在我國入侵植物名錄中，紫茉莉的入侵級別被認定為4級，即一般入侵類植物[3]。由于具有入侵性，將紫茉莉用作修復植物時，必須關注其與本地種的種間關系，而化感作用是植物種間關系的一種重要類型?；凶饔檬侵参镌陂L期進化過程中為適應環(huán)境而產(chǎn)生的一種化學表現(xiàn)形式，通過植物釋放化感物質而實現(xiàn)[4]。化感物質可以通過雨霧淋溶植物浸出、植物揮發(fā)、植物殘體分解和根系分泌等方式釋放到環(huán)境中[5]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)化感物質主要包括酚類、萜類、糖和糖苷類、生物堿和非蛋白氨基酸類4類[6]。生物堿是含氮雜環(huán)類堿性有機物，具有特定的生物活性。有研究表明，黃連（Coptis chinensisFranch.）中所含的小檗堿、黃連堿、巴馬汀和藥根堿，其單方和組合復方對微囊銅綠藻均具有很好的抑制效果[7]。大麥（Hordeum vulgareL.）根所釋放的生物堿能引起白芥（Sinapis albaL.）根尖細胞壁損傷，液泡體積增大以及細胞器結構損壞[8]。牛筋草（EleusineindicaL.Daertn.）、香絲草（Conyza bonariensisL.Crinq.）和薇甘菊（Mikania micranthaKunth.）在小檗堿處理7 d后，其根部生長受到顯著抑制[9]。然而，這些研究均在非重金屬脅迫條件下進行，在重金屬脅迫下生物堿的產(chǎn)生、分泌及其化感效應如何，目前少見文獻報道。

本研究以紫茉莉為供試植物，首先在室內(nèi)水培條件下，研究添加不同濃度Cd對紫茉莉根系生物堿分泌的影響，并依據(jù)根系分泌物中的生物堿濃度，研究外源添加紫茉莉根系分泌物和生物堿對本地種種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，找出化感作用最強的生物堿種類。通過室內(nèi)盆栽實驗，進一步驗證在不同濃度Cd脅迫和有菌無菌下生長過紫茉莉的土壤對本地種種子萌發(fā)和幼苗生長的影響，探索土壤微生物對化感效應的影響程度。本研究為評估紫茉莉用于Cd污染農(nóng)田土壤修復的生態(tài)風險及入侵植物在植物修復實踐中的可行性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

供試紫茉莉、蘿卜（Raphanus sativusL.）和萵苣（Lactuca sativaL.）種子均購于云南省昆明市呈貢區(qū)龍街種子銷售經(jīng)營部，蘿卜和萵苣品種分別為短葉十三白蘿卜和二白皮原葉萵苣。兩種受試作物是本地常見的農(nóng)作物，其種子萌發(fā)均勻并對化感物質敏感。紫茉莉種子經(jīng)70%乙醇表面消毒，萌發(fā)生長50 d左右后，挑選大小一致、生長旺盛的植株，轉入1/6濃度的改良霍格蘭營養(yǎng)液[10]中適應性培養(yǎng)1周，挑選大小一致、生長旺盛的植株進行水培實驗。

1.2 水培實驗和樣品處理

用容積為4 L的塑料容器進行紫茉莉在不同Cd濃度處理下的水培實驗。采用改良霍格蘭營養(yǎng)液配方，添加CdCl2·2.5H2O配制成Cd濃度分別為0（對照）、1、3、5、10 mg·L-1的營養(yǎng)液（Cd2+濃度以純Cd計）。每個容器分別加入2 L含Cd營養(yǎng)液進行紫茉莉的懸浮培養(yǎng)。待溶液只能淹沒根尖時，再加入上述營養(yǎng)液至2 L。如此重復直至培養(yǎng)結束。每個處理設置3個重復，所有培養(yǎng)在溫室自然光照下完成，溫度日變幅為18～27℃。

培養(yǎng)14 d后，將紫茉莉取出，用EDTA-Na2和去離子水先后沖洗根系數(shù)次以去除根表面附著的Cd2+，再將根系放入0.2 mmol·L-1CaCl2溶液2 h以抑制細菌生長。隨后將紫茉莉植株放入盛有500 mL滅菌去離子水的玻璃瓶中（玻璃瓶外包有錫箔紙及黑布避光），保證所有植株根系被淹沒，再置入光照培養(yǎng)箱3 d進行根系分泌物釋放。設置光照培養(yǎng)箱溫度25℃，光照12 h·d-1。根系分泌物釋放結束后將植株取出，連續(xù)收集的根系分泌物經(jīng)雙層濾紙過濾后定容至500 mL，即為根系分泌物溶液。將溶液分為兩部分：一部分用于測定根系分泌物中生物堿含量，另一部分進行本地種（萵苣和蘿卜）的種子萌發(fā)和幼苗生長的生物學測試。

1.3 土培實驗及樣品處理

供試土壤采自昆明理工大學呈貢校區(qū)，土壤為紅壤。采集清潔土壤除去枯枝落葉及石塊，過5 mm篩，置于溫室自然晾干。取一部分風干土過1 mm篩測定土壤pH，一部分過0.25 mm篩測定土壤中氮、磷、鉀全量和Cd含量。土壤pH為（6.20±1.24），有機質含量為（14.39±2.05）g·kg-1，全磷、全氮和全鉀含量分別為（1.13±0.12）、（1.03±0.08）g·kg-1和（3.76±0.50）g·kg-1（n=3）。取適量風干土（過5 mm篩）、腐殖土和細沙以質量比為2∶1∶1的比例混合均勻，分別加入不同濃度的含Cd溶液，土壤Cd含量設定為0（對照）、1、5、10 mg·kg-1和25 mg·kg-1，攪拌均勻，放置進行熟化（熟化時間為25 d），期間定期攪拌并加去離子水保持土壤濕潤。土壤平衡結束后，Cd實際含量分別為（0.03±0.01）、（1.25±0.05）、（5.10±0.12）、（10.08±0.55）mg·kg-1和（25.20±1.80）mg·kg-1。

準備好供試土壤后，將各濃度土壤分成兩份，均稱取等量放入直徑20 cm、高度20 cm的花盆中，一部分不種植紫茉莉，另一部分種植紫茉莉，每盆播種30粒紫茉莉種子，每一濃度重復4次。讓紫茉莉植株高密度生長，保證其須根充滿整個花盆的土壤。將兩組花盆放置于溫室內(nèi)培養(yǎng)90 d，定期澆水。培養(yǎng)結束后，將紫茉莉植株連同土壤整個取出，用抖落法以及刮片和軟毛刷收集根際土壤。將土壤分為兩部分：一部分用作紫茉莉根際土壤生物堿的測定，另一部分用于本地種（萵苣和蘿卜）的種子萌發(fā)和幼苗生長的生物學測試。將土樣置于-4℃冰盒帶回實驗室。

1.4 生物堿的提取與測定

1.4.1 生物堿待測溶液的制備

取水培實驗中紫茉莉根系分泌物250 mL，加入1 mL 0.5 mol·L-1的CaCl2溶液，于旋轉蒸發(fā)儀上50℃濃縮至5 mL，用甲醇定容至10 mL，并經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾，用于測定根系分泌物中生物堿含量。

取上述Cd脅迫下生長紫茉莉的土壤50 g于500 mL錐形瓶中，加入200 mL 50%的甲醇溶液，封口，于搖床150 r·min-1振蕩24 h，取下后靜置，再經(jīng)3 500 r·min-1離心后取上清液。將上清液于旋轉蒸發(fā)儀上35℃濃縮至5 mL，用甲醇定容至10 mL，并經(jīng)0.45 μm有機濾膜過濾，用于測定根際土壤中生物堿含量。

1.4.2 標準品溶液制備

生物堿標準品購于四川成都樂美天醫(yī)藥/德斯特生物有限公司，純度為HPLC≥98%。

葫蘆巴堿標準品溶液：取葫蘆巴堿標準品10 mg，精密稱量，用50%的甲醇溶解，并定容至10 mL，制備成質量濃度為1 mg·mL-1的標準品溶液。吸取標準品溶液適量配制成濃度為0.05、0.1、0.25、0.5、1 mg·mL-1的溶液。

小檗堿、藥根堿、巴馬汀、黃連堿標準品溶液：取小檗堿、藥根堿、巴馬汀、黃連堿標準品各5 mg，精密稱量，用50%的甲醇溶解定容至50 mL，制備成質量濃度為100 μg·mL-1的標準品混合溶液。吸取標準品混合溶液適量配制成濃度為0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 μg·mL-1的溶液。

1.4.3 色譜條件

生物堿含量使用超高效液相色譜儀（Ultra performance liquid chromatography，UPLC，美國）測定。

葫蘆巴堿：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為水-乙腈（90∶10）；檢測波長280 nm；柱溫30℃；流速1 mL·min-1；進樣量10 μL[11]。

小檗堿、藥根堿、巴馬汀、黃連堿：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（30∶70，pH 3.5）；檢測波長345 nm；柱溫30℃；流速1 mL·min-1；進樣量10 μL[12]。5種生物堿的UPLC色譜圖如圖1所示。

圖1 5種生物堿的UPLC色譜圖Figure 1 UPLC chromatograms of five alkaloids

1.5 本地種種子萌發(fā)和幼苗生長化感實驗

1.5.1 水培紫茉莉根系分泌物對本地種種子萌發(fā)及幼苗生長的化感實驗

分別選取飽滿且均勻一致的蘿卜和萵苣種子，用1% NaClO浸泡15 min，然后用去離子水清洗3次，每次1 min，吹干備用。在每個鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿（Φ=90 mm）中裝入50粒種子，分別加入不同濃度Cd溶液培養(yǎng)下的紫茉莉根系分泌物溶液10 mL，以去離子水為對照。種子于恒溫培養(yǎng)箱25℃暗培養(yǎng)4 d，加入適量的根系分泌物溶液或去離子水，以保證濾紙濕潤使種子能夠正常萌發(fā)。每隔24 h統(tǒng)計一次種子發(fā)芽數(shù)并記錄數(shù)據(jù)。第5天時開啟光照，光照12 h·d-1。培養(yǎng)14 d后，每個培養(yǎng)皿選取20株大小一致且生長旺盛的幼苗，測定其根長、株高、鮮質量及葉面積且每一處理計算3次重復的平均值。處理設置：T0為去離子水對照，T1～T5分別為添加0、1、3、5 mg·L-1和10 mg·L-1Cd濃度處理下的紫茉莉根系分泌物。

為進一步探明每一種生物堿的化感效應強弱，通過外源添加生物堿的方式，探究其對蘿卜和萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長的影響。依據(jù)各生物堿在紫茉莉根系分泌物中的含量，設置一系列濃度，具體為葫蘆巴堿0、0.01、0.05、0.10 mg·mL-1；小檗堿、巴馬汀、藥根堿0、0.05、0.10、0.25 μg·mL-1。除將紫茉莉根系分泌物溶液換成不同濃度的生物堿溶液外，其他步驟同上。

1.5.2 Cd脅迫下未種植與種植紫茉莉的土壤對本地種種子萌發(fā)和幼苗生長的化感實驗

將Cd脅迫下未種植與種植紫茉莉的土壤分為兩部分：一部分不滅菌，另一部分用電離輻射滅菌。選取飽滿且均勻一致的蘿卜和萵苣種子進行同樣的預處理。將直徑10 cm、高10 cm的塑料花盆先進行滅菌處理，再取適量滅菌與不滅菌的上述土壤分別放置于花盆中，土壤高度7 cm左右，每個花盆播種50粒經(jīng)過處理的蘿卜或萵苣種子，再加蓋一層0.5 cm左右薄土。以芽頂出土層為發(fā)芽標準，每天觀察并記錄，共記錄7 d。幼苗生長30 d后，將幼苗連同土壤一起取出，輕輕抖落土壤保證植株根部完整，用自來水和去離子水先后沖洗干凈，測定其根長、株高、鮮質量及葉面積，每一處理計算3次重復的平均值。具體測定指標和方法如表1所示。

表1 本地種種子萌發(fā)及幼苗生長測定指標Table 1 Indicators of seed germination and seedling growth of native species

1.6 數(shù)據(jù)處理

運用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析，并采用Tukey法對不同處理組間蘿卜和萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長參數(shù)值的差異進行平均數(shù)多重比較，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。Tukey法檢驗效率高效且較穩(wěn)健，適用于各處理組樣本數(shù)量相同的情況。

用公式[21]計算種子萌發(fā)和幼苗生長各測定指標的相對抑制率（與對照相比）：

式中：I為相對抑制率，%；R1為受試植物對照組；R2為受試植物處理組。

2 結果與分析

2.1 水培與土培條件下Cd脅迫對紫茉莉根系分泌物和根際土壤中生物堿含量的影響

2.1.1 水培條件下Cd脅迫對紫茉莉根系分泌物中生物堿含量的影響

在紫茉莉根系分泌物中檢測到葫蘆巴堿、小檗堿、巴馬汀和藥根堿4種生物堿。如圖2所示，紫茉莉根系分泌物中各生物堿含量均存在差別。由圖2A可知，在1、3 mg·L-1Cd濃度處理下，根系分泌物中葫蘆巴堿含量顯著高于對照（P＜0.05），并在3 mg·L-1Cd濃度處理下達到0.143 mg·mL-1；但在5、10 mg·L-1Cd濃度處理下，葫蘆巴堿含量與對照相比無顯著差異（P＞0.05）。由圖2B和圖2C可知，在1、3、5 mg·L-1Cd濃度處理下，根系分泌物中小檗堿和巴馬汀含量顯著高于對照（P＜0.05），但在10 mg·L-1Cd濃度處理下，這兩種生物堿含量與對照相比無顯著差異（P＞0.05）。由圖2D可知，隨著Cd處理濃度增加，根系分泌物中藥根堿含量與對照相比無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 Cd脅迫下紫茉莉根系分泌物中各生物堿的含量Figure 2 Contents of alkaloids in root exudates of M.jalapa under Cd stress

綜上，與對照相比，1、3 mg·L-1Cd處理均顯著增加了紫茉莉根系對葫蘆巴堿、小檗堿和巴馬汀的分泌（P＜0.05），但對藥根堿的分泌無顯著影響（P＞0.05）。

2.1.2 Cd脅迫對紫茉莉根際土壤中生物堿含量的影響

在紫茉莉根際土壤中檢測到葫蘆巴堿、小檗堿、巴馬汀、黃連堿和藥根堿（圖3）。由圖3A可知，5 mg·kg-1Cd處理下，紫茉莉根際土壤中葫蘆巴堿含量顯著高于對照和25 mg·kg-1Cd脅迫（P＜0.05），達到3.75 g·kg-1，但1～10 mg·kg-1Cd處理下，根際土壤葫蘆巴堿含量無顯著差異（P＞0.05）。由圖3B可知，在5、10mg·kg-1Cd濃度處理下，紫茉莉根際土壤中小檗堿含量顯著高于對照和25 mg·kg-1Cd脅迫（P＜0.05），并在10 mg·kg-1Cd處理下達到99.27 mg·kg-1。但在1～10 mg·kg-1Cd處理下，小檗堿含量無顯著差異（P＞0.05）。由圖3C可知，在5、10 mg·kg-1Cd處理下，紫茉莉根際土壤中巴馬汀含量顯著高于25 mg·kg-1Cd脅迫（P＜0.05），但與對照和1 mg·kg-1Cd脅迫相比無顯著差異（P＞0.05）。

由圖3D和圖3E可知，隨著Cd含量增加，紫茉莉根際土壤中黃連堿和藥根堿的含量與對照相比無顯著差異（P＞0.05）。綜上，與對照相比，5 mg·kg-1Cd處理顯著增加了紫茉莉根系對葫蘆巴堿和小檗堿的分泌（P＜0.05），但對巴馬汀、黃連堿和藥根堿的分泌無顯著影響（P＞0.05）。

圖3 Cd脅迫下紫茉莉根際土壤中各生物堿的含量Figure 3 Contents of alkaloids in the rhizospheric soil of M.jalapa under Cd stress

2.2 Cd脅迫下水培紫茉莉根系分泌物對蘿卜和萵苣生長的影響

2.2.1 Cd脅迫下水培紫茉莉根系分泌物對蘿卜和萵苣種子萌發(fā)的影響

如圖4所示，不同處理下，蘿卜種子發(fā)芽率顯著低于T0（P＜0.05），且T3處理下蘿卜種子發(fā)芽率顯著低于T1處理，僅為25.17%，而其他處理下種子發(fā)芽率與T1相比無顯著差異（P＞0.05）。T1～T5處理下萵苣種子發(fā)芽率先降低，隨后又增加并與T0持平。T2、T3處理下萵苣種子發(fā)芽率與T0相比顯著降低（P＜0.05），且T3處理下萵苣種子發(fā)芽率顯著低于T1處理，發(fā)芽抑制率為10%。不同處理對兩個本地種發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時間均無顯著影響（P＞0.05）。蘿卜與萵苣相比，不同Cd濃度處理下的紫茉莉根系分泌物均對蘿卜種子萌發(fā)產(chǎn)生顯著抑制作用，且最大發(fā)芽抑制率高于萵苣，由此可知Cd脅迫下紫茉莉根系分泌物對蘿卜種子萌發(fā)的抑制作用強于萵苣。

圖4 紫茉莉根系分泌物對蘿卜和萵苣種子萌發(fā)的影響Figure 4 Effects of root exudates of M.jalapa on seed germination of radish and lettuce

2.2.2 Cd脅迫下水培紫茉莉根系分泌物對蘿卜和萵苣幼苗生長的影響

如圖5A至圖5D所示，T3處理下蘿卜幼苗根長、株高和鮮質量均顯著低于T0及T1處理（P＜0.05），且與T0相比抑制率分別達到44.23%、23.76%和23.30%。在不同處理下，萵苣根長與株高、鮮質量、葉面積表現(xiàn)出不同的效果（圖5E至圖5H）。T2、T3、T4處理下萵苣幼苗根長顯著低于T0及T1處理（P＜0.05），且在T3處理下與T0相比抑制率達最大值（40.44%）。然而，除T3處理外，其他處理下萵苣幼苗株高和鮮質量均顯著高于T0（P＜0.05），T1、T2處理下的萵苣葉面積顯著高于T0（P＜0.05）。蘿卜與萵苣相比，T3處理顯著抑制了蘿卜幼苗生長，但僅顯著抑制了萵苣根長，可見Cd脅迫下紫茉莉根系分泌物對蘿卜幼苗生長的抑制作用強于萵苣。

圖5 紫茉莉根系分泌物對蘿卜和萵苣幼苗生長的影響Figure 5 Effects of root exudates of M.jalapa on the growth of radish and lettuce seedlings

2.3 外源添加生物堿對蘿卜和萵苣生長的影響

2.3.1 外源添加生物堿對蘿卜和萵苣種子萌發(fā)的影響

由圖6可知，4種生物堿對蘿卜和萵苣種子萌發(fā)存在不同程度的抑制作用。當葫蘆巴堿濃度為0.10 mg·mL-1時，蘿卜和萵苣的發(fā)芽率顯著低于對照（P＜0.05，圖6A），平均發(fā)芽時間顯著長于對照（P＜0.05，圖6C）。當小檗堿濃度為0.25 μg·mL-1時，蘿卜發(fā)芽率顯著低于對照（P＜0.05，圖6D），萵苣的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及發(fā)芽勢均顯著低于對照（P＜0.05，圖6D至圖6F）。當巴馬汀濃度為0.25 μg·mL-1時，蘿卜種子發(fā)芽率顯著低于對照（P＜0.05，圖6G），平均發(fā)芽時間也顯著長于對照（P＜0.05，圖6J）。萵苣種子的發(fā)芽指數(shù)顯著低于對照（P＜0.05，圖6I），平均發(fā)芽時間顯著長于對照（P＜0.05，圖6J）。當藥根堿濃度為0.25 μg·mL-1時，蘿卜發(fā)芽率顯著低于對照（P＜0.05，圖6K），平均發(fā)芽時間顯著長于對照（P＜0.05，圖6L）。此外，隨著藥根堿濃度增加，萵苣種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、平均發(fā)芽時間的變化與對照相比差異不顯著（P＞0.05）。

圖6 生物堿對蘿卜和萵苣種子萌發(fā)的影響Figure 6 Effects of alkaloids on seed germination of radish and lettuce

2.3.2 外源添加生物堿對蘿卜和萵苣幼苗生長的影響

由表2可知，4種生物堿對蘿卜幼苗各測定指標有不同程度的抑制作用。當葫蘆巴堿濃度達到0.01 mg·mL-1時，蘿卜幼苗株高及鮮質量顯著低于對照（P＜0.05）；濃度達到0.10 mg·mL-1時，蘿卜幼苗的根長、株高、鮮質量和葉面積均受到顯著抑制。在0.10、0.25 μg·mL-1小檗堿處理下，蘿卜幼苗的根長、株高和鮮質量顯著減少（P＜0.05）。當巴馬汀和藥根堿濃度達到0.25 μg·mL-1時，蘿卜幼苗的根長、株高和葉面積顯著低于對照（P＜0.05）。

表2 外源添加生物堿的蘿卜幼苗生長指標Table 2 Effects of exogenous application of alkaloids on seedling growth of radish

由圖7可知，葫蘆巴堿、小檗堿和巴馬汀對萵苣幼苗根長產(chǎn)生了抑制作用。隨著葫蘆巴堿濃度增加，萵苣根長逐漸減少，并在0.05 mg·mL-1時顯著低于對照（P＜0.05，圖7A）。當小檗堿濃度為0.05 μg·mL-1時，萵苣根長顯著減少（P＜0.05，圖7B）；隨著小檗堿濃度增加，根長受到的抑制作用增強。當巴馬汀濃度為0.25 μg·mL-1時，萵苣根長顯著低于對照（P＜0.05，圖7C）。不同濃度葫蘆巴堿、小檗堿和巴馬汀對萵苣株高、鮮質量和葉面積影響均不顯著（P＞0.05）。藥根堿對萵苣根長、株高、鮮質量和葉面積的影響均不顯著（P＞0.05）。

圖7 外源添加生物堿對萵苣幼苗根長的影響Figure 7 Effects of exogenous alkaloids on root length of lettuce seedlings

2.4 水培條件下，4種生物堿對2個本地種種子萌發(fā)和幼苗生長的最低抑制濃度

通過上述化感指標的測定，得出4種生物堿對2個本地種種子萌發(fā)和幼苗生長的最低抑制濃度，如表3所示。小檗堿對2個本地種幼苗生長的抑制效應最大，最低抑制濃度分別為0.1 mg·L-1和0.05 mg·L-1；葫蘆巴堿對2個本地種種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制效應最弱，至少達到50 mg·L-1才對萵苣幼苗生長起抑制作用；在所測定的濃度內(nèi)，藥根堿對萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長無顯著的抑制效應。

表3 4種生物堿對2個本地種種子萌發(fā)和幼苗生長的最低抑制濃度（mg·L-1）Table 3 The minimum inhibition concentrations of four alkaloids for seed germination and seedling growth of two native species（mg·L-1）

2.5 4種不同處理的土壤對蘿卜和萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

2.5.1 4種不同處理的土壤對蘿卜和萵苣種子萌發(fā)的影響

菌渣:取自安徽省某雙孢菇栽培基地,pH值為6.4,有機質含量為35.8%,總氮含量為3.98%,有效磷含量為0.125%.

從圖8A和圖8B可知，除種植過紫茉莉的有菌土壤外，其余3種處理在10 mg·kg-1和25 mg·kg-1Cd脅迫下，蘿卜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢均比無Cd時顯著降低（P＜0.05）。種植紫茉莉的無菌土壤在5 mg·kg-1Cd脅迫下，蘿卜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢比無Cd時顯著降低且抑制率最大，分別為32.88%和41.23%。但對于種植紫茉莉的有菌土壤，添加Cd對蘿卜種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢的抑制作用大多不顯著（P＞0.05），甚至在5 mg·kg-1Cd脅迫下起顯著促進作用。種植了紫茉莉后，高濃度（25 mg·kg-1）Cd脅迫顯著降低了蘿卜種子的發(fā)芽指數(shù)（圖8C），并顯著延長了平均發(fā)芽時間（P＜0.05，圖8D）。

在5 mg·kg-1Cd脅迫下，當土壤中有菌時，與不種植紫茉莉相比，種植紫茉莉的土壤使蘿卜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著增加，但當土壤中無菌時，種植紫茉莉的土壤反而顯著降低了蘿卜種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢（圖8A和圖8B）；在10 mg·kg-1Cd脅迫下，當土壤中有菌時，種植過紫茉莉的土壤使蘿卜種子的發(fā)芽指數(shù)顯著增加，但當土壤中無菌時，對蘿卜發(fā)芽指數(shù)的影響不顯著（圖8C）。無論是否種植紫茉莉，蘿卜種子平均發(fā)芽時間受到的影響大多不顯著，僅個別情況下種植紫茉莉可縮短蘿卜種子的平均發(fā)芽時間（圖8D）。

圖8 蘿卜種子在4種不同處理土壤中的萌發(fā)情況Figure 8 Germination of radish seeds in four different soil treatments

從圖9B可知，未種植紫茉莉的土壤在25 mg·kg-1Cd脅迫下，萵苣種子的發(fā)芽勢比無Cd時顯著降低（P＜0.05）。在種植過紫茉莉的無菌土壤中，5 mg·kg-1Cd脅迫下萵苣發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)與無Cd時相比顯著降低，平均發(fā)芽時間顯著延長（P＜0.05，圖9A、圖9C和圖9D），且抑制率分別為14.29%、21.07%和18.75%。而對于種植紫茉莉的有菌土壤，5、10 mg·kg-1Cd脅迫下萵苣發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)與無Cd時相比顯著提高，平均發(fā)芽時間顯著縮短（P＜0.05）。

在5、10 mg·kg-1Cd脅迫下，當土壤中有菌時，與不種植紫茉莉相比，種植紫茉莉的土壤使萵苣種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)顯著增加，平均發(fā)芽時間顯著縮短（圖9）。但當土壤中無菌時，與不種植紫茉莉相比，5 mg·kg-1Cd脅迫下種植紫茉莉的土壤顯著降低了萵苣種子的發(fā)芽率（圖9A），但10 mg·kg-1Cd脅迫下未種植紫茉莉的土壤比種植的顯著降低了萵苣種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢（圖9A和圖9B）。

圖9 萵苣種子在4種不同處理土壤中的萌發(fā)情況Figure 9 Germination of lettuce seeds in four different soil treatments

結合兩種植物看，在種植紫茉莉的有菌土壤中，5、10 mg·kg-1Cd脅迫土壤中萵苣種子各萌發(fā)指標均受到顯著促進作用，而蘿卜種子僅在5 mg·kg-1Cd脅迫土壤中發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著增高，說明萵苣種子受到的促進作用強于蘿卜。在種植紫茉莉的無菌土壤中，5 mg·kg-1Cd脅迫下蘿卜和萵苣種子的萌發(fā)均受抑制，但蘿卜種子萌發(fā)指標抑制率大于萵苣，說明蘿卜種子萌發(fā)所受抑制作用強于萵苣。

2.5.2 4種不同處理的土壤對蘿卜和萵苣幼苗生長的影響

從圖10A和圖10B可知，未種植紫茉莉的土壤在25 mg·kg-1Cd脅迫下，蘿卜幼苗的根長和株高均比無Cd時顯著降低（P＜0.05）。在種植過紫茉莉的無菌土壤中，5 mg·kg-1Cd脅迫下蘿卜幼苗根長、株高、鮮質量和葉面積與無Cd時相比均顯著降低（P＜0.05，圖10），各指標抑制率分別為29.05%、25.77%、48.54%和14.20%。而對于種植紫茉莉的有菌土壤，1、5 mg·kg-1Cd脅迫下蘿卜幼苗根長、株高、鮮質量和葉面積與無Cd時相比均顯著提高（P＜0.05，圖10）。

在5、10 mg·kg-1Cd脅迫下，當土壤中有菌時，與不種植紫茉莉相比，種植紫茉莉的土壤使蘿卜根長、株高、鮮質量和葉面積顯著增加（圖10）；但當土壤中無菌時，種植紫茉莉的土壤僅在5 mg·kg-1Cd脅迫下顯著降低了蘿卜幼苗葉面積（圖10D）。在10 mg·kg-1和25 mg·kg-1Cd脅迫下的無菌土壤中，無論種植紫茉莉與否，蘿卜幼苗各指標受到的影響均不顯著。

圖10 蘿卜幼苗在4種不同處理土壤中的生長情況Figure 10 Growth of radish seedlings in four different soil treatments

圖11 萵苣幼苗在4種不同處理土壤中的生長情況Figure 11 Growth of lettuce seedlings in four different soil treatments

結合兩種植物看，在種植紫茉莉的有菌土壤中，蘿卜幼苗受到的促進作用主要在1、5 mg·kg-1Cd脅迫下，而萵苣幼苗主要在1、5 mg·kg-1和10 mg·kg-1Cd脅迫下，萵苣幼苗受到的促進作用強于蘿卜。在種植紫茉莉的無菌土壤中，5 mg·kg-1Cd脅迫下蘿卜和萵苣幼苗生長均受到抑制，但蘿卜各生長指標抑制率均大于萵苣，說明蘿卜幼苗生長所受抑制作用強于萵苣。

3 討論

植物會通過化感作用釋放次生代謝物質來抵御昆蟲、動物和微生物的侵襲，抑制鄰近植物的生長，以增強自身的生存競爭能力。目前已有不少研究表明紫茉莉根、莖、葉和種子等浸提液對其他植物的種子萌發(fā)和幼苗生長具有化感作用。趙赫南等[22]的研究表明，紫茉莉甲醇提取物能抑制茄子的種子萌發(fā)和根莖生長，并促進黃豆種子萌發(fā)但抑制其根莖生長。許桂芳等[23]發(fā)現(xiàn)紫茉莉根、莖和葉的水浸提液對小麥和白菜的種子萌發(fā)及幼苗生長產(chǎn)生明顯抑制作用。本研究中，Cd脅迫下水培紫茉莉根系分泌物在一定程度上抑制了蘿卜、萵苣種子萌發(fā)（圖4）和幼苗生長（圖5），蘿卜的最大抑制率分別為25.17%和44.23%，萵苣則為10.00%和40.44%，表明Cd脅迫下紫茉莉根系分泌物具有一定的化感作用?；凶饔玫漠a(chǎn)生需要化感物質來實現(xiàn)，已有的文獻大多未深入研究紫茉莉產(chǎn)生化感效應的化感物質種類。本研究通過測定Cd脅迫下紫茉莉根系分泌物中的生物堿種類，發(fā)現(xiàn)其主要有葫蘆巴堿、小檗堿、巴馬汀和藥根堿。已有研究表明用3 mmol·L-1葫蘆巴堿處理萵苣根尖時，葫蘆巴堿可使細胞周期中的G2期延長或停止，從而減少了原生根系伸長速率[24]。小檗堿及其衍生物能顯著抑制擬南芥主根長和根系細胞分裂，從而抑制植物根系生長[25]。本研究中，外源添加葫蘆巴堿、小檗堿、巴馬汀和藥根堿在一定程度上抑制了蘿卜和萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長，一方面這與前人的研究結果相似，另一方面本研究也確定了究竟是紫茉莉根系分泌的哪幾種生物堿起到了化感作用。

生物堿屬于植物次生代謝物，從生態(tài)學意義看，它的分泌一般被認為是可防止植物被草食動物吞食[26]。此外，生物堿大多偏堿性，在Cd脅迫下，紫茉莉分泌的生物堿可以與一部分Cd2+發(fā)生沉淀，從而降低了Cd的生物有效性。生物堿的分泌受諸多因素的影響，植物生境、水分、養(yǎng)分、溫度、動物侵食、微生物侵染等均可影響化感作用[27]。環(huán)境脅迫會影響化感物質的產(chǎn)生和釋放，在一定情況下植物產(chǎn)生和釋放化感物質的量會增加，從而增強化感作用[28]。有研究表明低劑量重金屬脅迫會促進次生代謝物的合成，但隨著重金屬濃度增加，次生代謝物的含量反而下降[29]。本研究表明，在1 mg·L-1和3 mg·L-1Cd的水培和5 mg·kg-1Cd的土培條件下，紫茉莉根系分泌的葫蘆巴堿和小檗堿均比對照（不加Cd）顯著增加。但在高濃度（10 mg·L-1水培或25 mg·kg-1土培）Cd脅迫下，紫茉莉分泌的幾種生物堿均與對照無顯著差異，說明高Cd脅迫顯著抑制了紫茉莉生物堿的分泌（圖2和圖3）。這可能是因為重金屬對植物生長的“低促高抑”現(xiàn)象普遍存在，高Cd脅迫嚴重降低了紫茉莉植株的根系活力和生物堿合成的生理生化過程，進而降低了如生物堿等次生代謝物質的產(chǎn)生。當然，有的生物堿如水培和土培中的藥根堿和土培中的黃連堿，隨著Cd處理濃度的增加其含量均未發(fā)生顯著變化，說明不同生物堿種類對Cd脅迫的響應存在自身差異。Cd脅迫下植物生物堿的產(chǎn)生、釋放和化感效應的研究較少，今后還需要進一步深入研究。

本研究中，當添加紫茉莉根系分泌物和生長過紫茉莉的無菌土壤進行蘿卜、萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長實驗時，發(fā)現(xiàn)3 mg·L-1Cd脅迫下紫茉莉根系分泌物中蘿卜、萵苣發(fā)芽率和根長顯著低于其他處理，可能是由于在此濃度脅迫下，紫茉莉根系分泌物中葫蘆巴堿和小檗堿含量達到最大值，分別為0.143 mg·mL-1和0.293 mg·L-1，均超過其最低抑制濃度（0.10 mg·mL-1和0.25 mg·L-1）；5 mg·kg-1Cd脅迫下紫茉莉根際土壤葫蘆巴堿、小檗堿和巴馬汀含量分別為3.74 g·kg-1、90.27 mg·kg-1和13.00 mg·kg-1（圖3），且此濃度Cd脅迫下紫茉莉根際無菌土壤對蘿卜種子萌發(fā)和幼苗生長的抑制作用最強，表明Cd脅迫下水培與土培無菌土壤中生物堿分泌量的增加顯著增強了紫茉莉根系分泌物的化感效應。此外，化感物質間的互作方式也能影響化感作用強度。各化感物質間可能存在的相加或協(xié)同作用會導致化感效應增強[30]。植物化感作用具有選擇性，同一種化感物質對不同受體植物的作用不同，對同一受體植物不同生長階段、不同部位的作用也不同[22]。本研究中，外源添加的各生物堿對蘿卜和萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長起抑制作用的最低濃度有所不同，且藥根堿濃度為0.25 mg·L-1時，只對蘿卜有顯著影響，對萵苣無顯著作用，說明生物堿對蘿卜和萵苣的化感作用具有物種選擇性和濃度依賴性[31]。Cd脅迫下紫茉莉根系分泌物及生長過紫茉莉的無菌土壤對蘿卜的抑制作用強于萵苣，說明不同受體植物對化感物質的敏感性不同，也可能與受體植物物種進化有關[32]。種子萌發(fā)和幼苗生長是保證植物個體生存和種族繁衍的重要階段。本研究中，外源添加生物堿、Cd脅迫下紫茉莉根系分泌物和種植過紫茉莉的無菌土壤都在一定程度上抑制了蘿卜和萵苣種子萌發(fā)率，可能原因是化感物質影響了種子內(nèi)部物質代謝及各種代謝關鍵酶的活性，使代謝受阻，從而減少了種子萌發(fā)的正常能量供應，抑制或推遲種子萌發(fā)[33]。蘿卜和萵苣幼苗根長顯著變短，可能是由于其根部與生物堿直接接觸，根部細胞膜受到損傷，使得膜功能失調，進而影響呼吸作用和水分吸收，最終影響根部細胞的分裂及生長[34]。由于植物代謝是一個連鎖反應，離子吸收及水分狀況等變化必然引起植物營養(yǎng)物質運輸、光合作用和呼吸作用等的變化，從而對植物株高、鮮質量和葉面積產(chǎn)生影響。然而，外源添加生物堿僅對萵苣根長有顯著抑制作用，對株高、鮮質量和葉面積影響不顯著，造成這一現(xiàn)象的原因可能是植物莖葉靠根部運輸養(yǎng)分，只有當根系受到的化感脅迫到達一定程度時，莖葉才會表現(xiàn)出明顯的響應[35]。

土壤是植物間相互作用的媒介，是植物化感物質的釋放場所。本研究在探明Cd脅迫下水培紫茉莉根系分泌物具有化感作用后，通過土培實驗進一步驗證在不同濃度Cd脅迫和有菌無菌條件下生長過紫茉莉的土壤中化感作用的差異程度。本研究測定了不同濃度Cd脅迫下紫茉莉根際土壤中生物堿的種類與含量，發(fā)現(xiàn)除了得到與水培條件下相同的4種生物堿外，還檢測到土壤中存在黃連堿（圖3D）。這可能是由于土培實驗中紫茉莉生長時間更長（90 d），隨著時間的推移，紫茉莉根系分泌的生物堿在土壤中不斷積累，當積累到一定量便能夠被檢測到，而水培實驗中紫茉莉根系分泌的時間短（3 d），導致黃連堿分泌量過少而未被檢出。紫茉莉根際土壤中生物堿含量在Cd脅迫下的表現(xiàn)趨勢與水培條件下基本一致，但含量顯著增加時的Cd濃度有所不同。Cd脅迫下紫茉莉根際土壤中葫蘆巴堿和小檗堿含量在Cd含量為5 mg·kg-1時顯著增加，而水培條件下Cd濃度為1～3 mg·L-1時此兩種生物堿含量顯著增加，可能是由于水培條件下的Cd主要是水溶性Cd，其生物有效性更高，而土壤中的Cd由于受生物與非生物因素的影響，其有效性Cd含量相對較低[36]。因此土培條件下，Cd對紫茉莉根系分泌生物堿起促進作用的濃度高于水培條件。

植物釋放的化感物質進入土壤后，能夠在滯留、遷移、轉化等過程中富集，并達到一定的濃度和持續(xù)的活性，從而產(chǎn)生化感作用。而土壤本身是一個極其復雜的生態(tài)系統(tǒng)，化感物質在土壤中可能會經(jīng)歷微生物分解、土壤顆粒吸附、聚合、離子交換等一系列過程，而這些過程均會影響化感物質的作用[35]。本研究中除25 mg·kg-1Cd脅迫外，Cd脅迫下種植紫茉莉的有菌土壤對蘿卜、萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長均存在不同程度的促進作用，而水培實驗中紫茉莉根系分泌物則抑制了蘿卜、萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長，造成這種相反作用的原因可能是自然土壤環(huán)境遠比單一的水培環(huán)境復雜，微生物和土壤作用等影響更大。紫茉莉根際土壤中的生物堿可被土壤吸附與解吸，以及可被土壤微生物降解或轉化為其他物質，從而使得生物堿濃度發(fā)生變化，控制生物堿的潛在生物有效性[37]，進而使得Cd脅迫下生長過紫茉莉的有菌土壤化感作用得到緩解。25 mg·kg-1Cd脅迫下的有菌土壤對2個本地種種子萌發(fā)和幼苗生長表現(xiàn)為抑制作用，可能是土壤中Cd含量過高所致。這說明雖然紫茉莉在5、10 mg·kg-1Cd脅迫時生物堿含量顯著增加，但化感效應并不強烈，且實際農(nóng)田土壤中Cd含量并非如此高，因此將紫茉莉用于大田實際Cd污染土壤修復的生態(tài)風險較小。而種植紫茉莉的土壤滅菌后，蘿卜、萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長受到不同程度的抑制，可能是生物堿留存在土壤中未受到微生物分解，在Cd與生物堿雙重脅迫下產(chǎn)生顯著抑制作用所致[38]。這說明微生物在Cd脅迫下生長過紫茉莉土壤的化感作用中起重要作用，但至于哪些微生物在對生物堿起分解作用進而緩解了對本地種的化感效應，將是今后深入研究的一個重點內(nèi)容。

紫茉莉作為外來入侵植物，其繁殖力強、生物量大、適應性強，且具有一定富集Cd的能力。但是在Cd污染土壤修復過程中，外來入侵植物對本地種的危害不容忽視，探究將其用于Cd污染土壤修復的生態(tài)風險和可行性非常必要且重要。目前關于Cd脅迫下紫茉莉生物堿對本地種的化感作用未見相關報道。本研究通過水培與土培實驗，對紫茉莉根系分泌的生物堿對蘿卜、萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長的化感效應進行探究，表明在Cd脅迫下，紫茉莉水培和土培方式對本地種產(chǎn)生的化感效應不同，土培和有菌條件減緩了生物堿的化感效應，將紫茉莉用于大田實際Cd污染農(nóng)田土壤修復生態(tài)風險小，且利用紫茉莉與本地種進行Cd污染農(nóng)田土壤的間作修復時，萵苣是較為合適的間作種類。然而，目前我們的研究結果只能說明紫茉莉根系分泌物及根際土壤中測定到的幾種生物堿的化感效應，但各生物堿間可能存在的協(xié)同、相加或拮抗效應等，還有待今后深入研究。

4 結論

（1）水培條件下，1、3 mg·L-1Cd脅迫下紫茉莉根系分泌物中葫蘆巴堿、小檗堿和巴馬汀含量顯著增加。3 mg·L-1Cd脅迫下紫茉莉根系分泌物對蘿卜和萵苣的抑制作用最強，其中蘿卜種子萌發(fā)和幼苗根長抑制率分別為25.17%和44.23%，萵苣為10.00%和40.44%，蘿卜受到的抑制作用強于萵苣。外源添加各生物堿對蘿卜和萵苣幼苗生長的化感效應不同，小檗堿最低抑制濃度分別為0.10 mg·L-1和0.05 mg·L-1，化感效應最強；巴馬汀和藥根堿均為0.25 mg·L-1，化感效應次之；葫蘆巴堿為100 mg·L-1和50 mg·L-1，化感效應最弱。

（2）土培條件下，除25 mg·kg-1Cd脅迫外，種植紫茉莉的有菌土壤對蘿卜、萵苣種子萌發(fā)和幼苗生長均產(chǎn)生不同程度的促進作用，且對萵苣的促進作用強于蘿卜；而無菌土壤則產(chǎn)生抑制作用，5 mg·kg-1Cd脅迫對蘿卜種子萌發(fā)和幼苗生長的最大抑制率分別為41.23%和48.54%，萵苣則為21.07%和15.25%。這說明土培和有菌條件減緩了生物堿的化感效應。

（3）當利用紫茉莉與本地種進行Cd污染農(nóng)田土壤的間作修復時，萵苣所受的化感抑制作用較小，是較為合適的間作種類。