＊宋照風(fēng) 譚杰安 周子凡 朱峰 趙海全

（佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院 廣東 528000）

溪黃草又稱風(fēng)血草、土黃連等，莖葉有細(xì)條紋，屬唇形科的全草植物[1]。溪黃草常成叢生長(zhǎng)在河邊、溪邊、草地等光照充足的地方，在我國(guó)的很多地區(qū)都能生長(zhǎng)。溪黃草具有涼血退瘀、清熱祛濕及退黃等藥用價(jià)值[2]。目前，對(duì)于溪黃草的臨床應(yīng)用，直接水煎服用或提取有效活性成分制成復(fù)方中成藥治療疾病[3]。溪黃草含有多糖、多酚、氨基酸、萜類化合物等有機(jī)活性物質(zhì)[4]。多酚作為一種重要的次生代謝產(chǎn)物存在于溪黃草的莖葉中[5]。多酚普遍存在于植物中，它不僅是天然的抗氧化劑，還是重要的功能因子[6]。近年來(lái)，關(guān)于溪黃草多酚提取工藝[7]的研究報(bào)道比較少，為了能夠有效提取利用溪黃草中的多酚。超聲輔助提取溪黃草多酚相對(duì)而言成本較低、易于操作、提取效率高、實(shí)用性強(qiáng)。目前多酚檢測(cè)的方法是福林酚法。本文圍繞提取的料液比、溶劑的體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、超聲輔助時(shí)間設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)溪黃草多酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1.材料與方法

(1)主要原料和儀器

溪黃草購(gòu)于當(dāng)?shù)兀剐詻](méi)食子酸、福林酚等為分析純。分光光度計(jì)為上海美譜達(dá)UV-1100等。

(2)溪黃草多酚的提取

將溪黃草粉碎，過(guò)60目篩備用；取1.00g溪黃草于燒杯中，按料液比為1:30，加入70%的乙醇；將混合液置于40℃恒溫水浴中10min；在超聲機(jī)中提取30min；過(guò)濾，濾液在4000r/min離心10min。取上清液加水至100mL，以測(cè)定多酚的提取率；按上述步驟，進(jìn)行單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)；根據(jù)福林酚法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算多酚的產(chǎn)量及提取率。

(3)福林酚法測(cè)定多酚含量

①標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取0.050g焦性沒(méi)食子酸，加水定容至50mL，得到焦性沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度為1mg·mL-1。從上述焦性沒(méi)食子酸溶液中準(zhǔn)確量取0.00mL、2.00mL、4.00mL、6.00mL、8.00mL、10.00mL溶液，分別加入到100mL容量瓶中，用蒸餾水定容，即配置得到質(zhì)量濃度分別為0.000mg·mL-1、0.020mg·mL-1、0.040mg·mL-1、0.060mg·mL-1、0.080mg·mL-1、0.100 mg·mL-1的沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

②標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定方法

根據(jù)福林酚法，取1.00mL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入1.5mL福林酚溶液，再加入10mL水，避光靜置5min，加入6mL碳酸鈉緩沖溶液，避光反應(yīng)1h。測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mg·mL-1）對(duì)吸光度值繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到焦性沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=7.9414x+0.0494。該方程的相關(guān)系數(shù)為R2=0.9988線性回歸方程的擬合較好。

(4)數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)采用正交軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理。

2.結(jié)果與分析

(1)乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

取溪黃草1.00g，乙醇料液比為1:30，加入等量的體積分?jǐn)?shù)為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇。將混合液放到40℃恒溫水浴中，提取10min后，再轉(zhuǎn)移到40℃超聲中，提取30min。取出混合液過(guò)濾。濾液高速離心10min，收集上清液，并加水至100mL得到溪黃草多酚待測(cè)液。用福林酚法測(cè)定不同濃度乙醇對(duì)溪黃草多酚提取影響曲線圖。

由圖1可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，溪黃草多酚的提取率升高，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%，溪黃草多酚的提取率最大。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，溪黃草多酚的提取率反而下降，其總體呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響試驗(yàn)結(jié)果分析圖

(2)料液比的影響

取溪黃草1.00g，加入乙醇料液比為1:20、1:30、1:40、1:50、1:60，加入體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇。將混合液放到40℃恒溫水浴提取10min，再把混合液轉(zhuǎn)移到40℃超聲中提取30min。過(guò)濾，濾液高速離心10min，收集上清液，并加水至100mL得到溪黃草多酚待測(cè)液。用福林酚法測(cè)定出不同料液比對(duì)溪黃草多酚提取結(jié)果的影響曲線圖。

從圖2可知，隨著料液比的減小，溪黃草多酚的提取率升高，在料液比為1:50時(shí)，溪黃草多酚的提取率出現(xiàn)最大，而隨著料液比的進(jìn)一步減小，溪黃草多酚的提取率反而開(kāi)始逐漸下降。因?yàn)榱弦罕仍叫。尤氲娜軇┰蕉?，不利于溪黃草多酚的提取。

圖2 料液比的影響試驗(yàn)結(jié)果分析圖

(3)超聲提取時(shí)間的影響

取溪黃草1.00g，乙醇溶劑料液比1:50，加入等量的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇。將混合液放到40℃水浴鍋中提取10min，混合液轉(zhuǎn)移到超聲中，提取10min、20min、30min、40min、50min，提取溫度為40℃。過(guò)濾，濾液高速離心10min，上清液加水至100mL得到溪黃草多酚待測(cè)液。用福林酚法測(cè)定出不同超聲提取時(shí)間對(duì)溪黃草多酚提取結(jié)果的影響曲線圖。從圖3可知，隨著超聲提取時(shí)間的增大，溪黃草多酚的提取率升高，而且在超聲提取時(shí)間為30min時(shí)，溪黃草多酚的提取率出現(xiàn)最大，而后隨著超聲輔助提取時(shí)間進(jìn)一步增大，溪黃草多酚的提取率反而逐漸下降。由于超聲具有空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，可能會(huì)使溶劑中的多酚發(fā)生分解，導(dǎo)致產(chǎn)率降低。

圖3 超聲提取時(shí)間的影響試驗(yàn)結(jié)果分析圖

(4)提取溫度的影響

取溪黃草1.00g，加入乙醇料液比為1:50，加入等量的體積分?jǐn)?shù)均為70%的乙醇溶劑。將溪黃草與乙醇的混合液放到水浴中，水浴溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃，水浴提取10min后，把溶液轉(zhuǎn)移到超聲中，輔助提取30min，超聲輔助溫度分別為20℃、30℃、40℃、50℃、60℃。取出溪黃草多酚提取液過(guò)濾。濾液高速離心10min，收集上清液，并加水至100mL得到溪黃草多酚樣品待測(cè)液。用福林酚法測(cè)定出不同提取溫度對(duì)溪黃草多酚提取結(jié)果的影響曲線圖。

從圖4中的曲線可以看出，溫度越高，溪黃草多酚越不穩(wěn)定，當(dāng)超過(guò)一定溫度時(shí)，溪黃草多酚會(huì)發(fā)生分解使得提取率降低，所以總體呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。

圖4 提取溫度的影響結(jié)果分析圖

(5)正交因素水平試驗(yàn)

根據(jù)以上單因素試驗(yàn)的結(jié)論，乙醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲輔助時(shí)間和提取溫度這四個(gè)單因素都對(duì)溪黃草多酚的提取率均存在一定的影響。為了能進(jìn)一步優(yōu)化溪黃草多酚的提取工藝，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)四水平正交試驗(yàn)表，如表1。

表1 正交四水平試驗(yàn)表

(6)正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，不同因素對(duì)溪黃草多酚的提取結(jié)果影響有差異，其影響程度從極差和偏差平方和分析出來(lái)，當(dāng)極差和偏差平方和越大時(shí)，說(shuō)明它的影響程度越顯著。由表2可以看出，各個(gè)影響因素的顯著性先后順序?yàn)橐掖俭w積分?jǐn)?shù)＞溫度＞超聲時(shí)間＞料液比。由直觀分析可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)溪黃草多酚的提取影響更顯著。根據(jù)方差分析表，四個(gè)因素的F比以及F臨界值較為接近，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果存在一定的誤差。綜上所述，溪黃草多酚的最佳提取工藝乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，料液比為1:50，超聲輔助提取時(shí)間為30min，提取的溫度為35℃。以分析得出的提取最佳工藝條件進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)三次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平均提取率與正交試驗(yàn)中的最佳提取條件時(shí)的提取率基本一致，說(shuō)明提取工藝方案具有一定的可行性。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果記錄表

3.結(jié)論

綜上所述，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增大，溪黃草多酚的提取率先升后降，說(shuō)明溶劑的體積分?jǐn)?shù)過(guò)大，溶劑濃度越大，越不利于溪黃草多酚的提?。划?dāng)料液比達(dá)到一定值時(shí)，溪黃草多酚已經(jīng)被充分提取，再增加溶劑，反而會(huì)降低提取率，而且成本提高；超聲提取的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)破壞溪黃草多酚的結(jié)構(gòu)，使溪黃草多酚的產(chǎn)率降低；而溫度在一定范圍內(nèi)，對(duì)溪黃草多酚的提取有促進(jìn)的作用，但溫度過(guò)高則會(huì)造成溪黃草多酚的分解。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%，料液比為1:50，超聲輔助提取時(shí)間為30min，提取的溫度為35℃時(shí)，溪黃草多酚的提取率可以達(dá)到最大值。