何菊，李照偉，陳娟，李瀟，羅元宇，董然然

（1.六盤水水城區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 貴州六盤水 553600；2.貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 貴陽 550000；3.六盤水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 貴州六盤水 553000；4.盤州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 貴州六盤水 553537；5.貴州大學(xué) 貴陽 550000）

自2018 年8 月我國確診第一例非洲豬瘟疫情以來，非洲豬瘟疫情在我國境內(nèi)蔓延，為實(shí)現(xiàn)各級實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒的快速檢測并啟動(dòng)防控反應(yīng)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部陸續(xù)開展獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒檢測資質(zhì)授權(quán)。而實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒檢測的準(zhǔn)確性，對指導(dǎo)基層開展非洲豬瘟疫情防控起到關(guān)鍵性作用，實(shí)驗(yàn)室非洲豬瘟病毒檢測技術(shù)的提升和檢測能力的準(zhǔn)確性是非洲豬瘟疫情能否得到快速控制的重要環(huán)節(jié)。因此，嚴(yán)格管控非洲豬瘟采樣及實(shí)驗(yàn)室檢測的各個(gè)環(huán)節(jié)，規(guī)避影響非洲豬瘟病毒檢測結(jié)果，在對非洲豬瘟檢測結(jié)果及時(shí)有效的應(yīng)用到疫情防控工作中起到至關(guān)重要的作用。

1 樣品因素

1.1 樣品的采集

1）抗凝血采集和全血時(shí)，用含有EDTA 的真空采血管（紫色）或含有3.8%枸櫞酸鈉的注射器抽取血液。采樣部位要充分消毒，避免外源污染的影響。采集抗凝血時(shí)，需輕微晃動(dòng)血液，確保血液與抗凝劑充分混勻，防止因混合不均勻而導(dǎo)致血凝塊的產(chǎn)生。

2）在養(yǎng)殖場或規(guī)模屠宰場自檢時(shí)，常使用方便快捷的采集方式，即血拭子。通常采取耳血拭子或尾根血拭子，采集前對采集部位進(jìn)行消毒，用一次性針頭扎破尖或尾根淺表血管，用醫(yī)用棉簽蘸取適量血樣，將白色棉簽全部染成紅色，每頭豬1 個(gè)棉簽，血拭子采集時(shí)，確保蘸取足夠的血量，確保病毒的檢出率。采樣結(jié)束按壓止血至血液不再滲出，嚴(yán)防污染其他豬只。

3）非洲豬瘟檢測可使用棉拭子檢測，棉拭子采集時(shí)，眼鼻、肛門棉拭子確保采集到分泌物，否則為無效樣品，無法檢出病毒或?yàn)榈蜋z出。

4）病死豬或屠宰場宰后胴體抽檢時(shí)，采集病死豬組織樣品，主要采集下頜淋巴結(jié)和脾臟組織。采樣時(shí)防止腸道等內(nèi)容物污染，取樣時(shí)采集病豬病變的組織，胴體采集時(shí)，采集組織病變部位的中部，確保樣品采集量適中。采樣后放入樣品保存管或保存袋中，標(biāo)記后密封保存。

1.2 樣品的保存與運(yùn)輸

1）血液樣品的保存與運(yùn)輸?？鼓獦悠凡杉?，在抗凝劑與血液充分混勻的前提下，冷藏保存，防止暴曬。蘸取淺表血之后，將血拭子放入含有適量PBS 或生理鹽水的無菌試管中，冷藏保存；血樣采集管需正向靜置后，在采集樣品12h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室檢測，樣品若置于常溫或超出12h 后進(jìn)行檢測，則會降低病毒含量，影響檢測結(jié)果。

2）棉拭子保存與運(yùn)輸。棉拭子采集后，放入含有適量PBS 或生理鹽水的無菌試管中，嚴(yán)禁常溫干燥放置采集的棉拭子，或?qū)⒚奘米臃胖糜诓恍l(wèi)生的容器中，導(dǎo)致棉拭子污染或干燥。采樣后12h 內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室檢測或冷凍保存待檢。

3）組織樣品保存與運(yùn)輸。采集組織樣品后，對樣品進(jìn)行分類放置，嚴(yán)格放置于組織保存管或密封袋內(nèi)，冷藏保存，于采樣后2～6h內(nèi)冷藏送至實(shí)驗(yàn)室檢測或冷凍保存待檢。

2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境及儀器設(shè)備耗材因素

2.1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

病毒檢測實(shí)驗(yàn)室為相對獨(dú)立的區(qū)域，病毒實(shí)驗(yàn)室建有屏障或緩沖區(qū)，確保實(shí)現(xiàn)相對封閉的環(huán)境。根據(jù)PCR 檢測的要求，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)環(huán)境確保通風(fēng)良好，濕度60%～70%之間，溫度24～26℃，配備空調(diào)，減少溫濕度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。實(shí)驗(yàn)室要進(jìn)行嚴(yán)格區(qū)域劃分，確保各功能區(qū)有效分離。結(jié)合實(shí)驗(yàn)室布局，可根據(jù)操作先后順序，大致分隔為實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、核酸提取、擴(kuò)增分析3 個(gè)區(qū)域，確保凈污分離，實(shí)驗(yàn)物品遵循單向流動(dòng)，每次實(shí)驗(yàn)后使用過的儀器設(shè)備要及時(shí)進(jìn)行消毒，且無害化處理廢棄物，防止氣溶膠的產(chǎn)生。

分區(qū)后注明各工作區(qū)域的名稱，在對應(yīng)區(qū)域中合理放置所需的儀器耗材，物資配備齊全。若分區(qū)不合理，則會導(dǎo)致樣品處置過程產(chǎn)生交叉污染，從而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。定期對實(shí)驗(yàn)室使用的儀器設(shè)備取樣檢測，若為陽性，需進(jìn)行徹底消毒，并間隔一個(gè)潛伏期后復(fù)檢為陰性方可繼續(xù)使用。

2.2 儀器設(shè)備耗材

非洲豬瘟病毒檢測實(shí)驗(yàn)室必須配備檢測靈敏度相對較高且與檢測相適應(yīng)的儀器設(shè)備，各分區(qū)物資配備合理，如實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備區(qū)應(yīng)擺放冰箱、水浴鍋、組織研磨儀、水槽、通風(fēng)櫥等。核酸提取區(qū)應(yīng)配置生物安全柜、核酸提取儀、高速冷凍離心機(jī)、混均器、微量加樣器等。擴(kuò)增分析區(qū)配置熒光PCR 儀、電腦、打印機(jī)等。此外，各區(qū)域還應(yīng)有帶蓋密封垃圾桶、消毒設(shè)備、工作服及一次性手套、口罩、吸頭、離心管等耗材，各區(qū)域的設(shè)備物品不得交叉使用，各類儀器技術(shù)規(guī)程要達(dá)到檢驗(yàn)項(xiàng)目的要求，重要儀器要制定儀器操作規(guī)程及使用維護(hù)記錄等，嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行使用維護(hù)，保證其在規(guī)定參數(shù)內(nèi)正常運(yùn)行。各類耗材確保在保質(zhì)期使用，保存方法得當(dāng)，避免耗材污染。吸頭、離心管等使用前進(jìn)行滅菌或者為無酶無菌耗材，各類儀器使用后進(jìn)行清洗消毒。

3 實(shí)驗(yàn)試劑

3.1 試劑的選擇與保存

為了快速完成非洲豬瘟病毒檢測，目前基層開展非洲豬瘟病毒檢測時(shí)主要采用成品試劑盒，包括核酸提取試劑盒和非洲豬瘟核酸擴(kuò)增試劑盒兩種。在購買試劑盒時(shí)，應(yīng)選擇具有非洲豬瘟病毒檢測生產(chǎn)經(jīng)營試劑盒使用資質(zhì)的廠家，已取得農(nóng)村農(nóng)業(yè)部核發(fā)的產(chǎn)品批準(zhǔn)文號的非洲豬瘟病毒診斷制品，并通過正規(guī)途徑購買。為確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確可信，盡量使用與各級實(shí)驗(yàn)室相同的診斷試劑，從而減少與上級部門檢測試劑差異因素。

檢測試劑需嚴(yán)格按試劑盒要求保存的溫度條件進(jìn)行保存，錯(cuò)誤的保存溫度會嚴(yán)重影響試劑的檢測靈敏度甚至完全失效，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)耗時(shí)及資金投入增加。通常核酸提取試劑盒存放于干燥室溫環(huán)境，擴(kuò)增試劑盒存放于-20℃。擴(kuò)增試劑盒購入時(shí)對擴(kuò)增檢測試劑進(jìn)行部分按需分裝，減少試劑反復(fù)凍融而影響試劑的檢測效果。

3.2 試劑的使用

目前常用非洲豬瘟病毒擴(kuò)增試劑盒主要為兩種，一種是根據(jù)PCR 反應(yīng)體系所需試劑，在計(jì)算用量后，結(jié)合使用量分別加入后混合使用的，主要包含水、PCR 反應(yīng)液、引物探針混合液。一種是配合好的A、B 液，兩種混合液全部混合均勻即可。混合時(shí)要進(jìn)行充分混合，使用微量移液器時(shí)要規(guī)范操作，確保各試劑使用量足夠。冷凍試劑使用時(shí)要提前進(jìn)行回溫，確保試劑完全融化。PCR 反應(yīng)體系中酶對溫度敏感，使用時(shí)應(yīng)置于冰上操作，用完后及時(shí)冷凍保存，按需分裝，減少凍融次數(shù)。確保試劑在有效期內(nèi)使用，做好試劑登記管理。

核酸提取試劑盒分為手動(dòng)提取和機(jī)提試劑盒兩種，手動(dòng)提取試劑盒操作步驟繁瑣，耗時(shí)相對較長，人工操作容易造成核酸提取量不足或核酸受污染等人為因素較大，在基層非洲豬瘟病毒核酸提取時(shí)應(yīng)用較少。手動(dòng)提取試劑盒操作時(shí)嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行，試劑反應(yīng)時(shí)間及離心速度、試劑加入用量充足等，做好標(biāo)記，規(guī)范操作，避免交叉污染，否則均會影響核酸的濃度和純度。機(jī)提試劑盒使用時(shí)確保樣品加入至提取液面以下，蛋白酶k 的用量充足，并做好標(biāo)記，避免加錯(cuò)反應(yīng)孔。吸頭不可重復(fù)使用，防止交叉污染。機(jī)提試劑盒需與核酸提取儀匹配，方能有效提取核酸。

4 人員因素

4.1 檢測人員的配置

非洲豬瘟病毒熒光定量PCR 檢測對實(shí)驗(yàn)室操作的要求更為嚴(yán)格，它是以DNA 擴(kuò)增檢測分子生物學(xué)的檢測技術(shù)，要求取得檢測資質(zhì)的獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備2 名以上具有實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)且掌握簡單英語的人員，以確保實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。檢測人員應(yīng)經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)化、系統(tǒng)化的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)規(guī)范、相關(guān)法律法規(guī)、操作規(guī)程、生物安全防護(hù)知識和實(shí)際操作技能等培訓(xùn)，并獲得檢測資格后方可開展相關(guān)檢測工作。

4.2 檢測人員技術(shù)要求

進(jìn)行非洲豬瘟病毒檢測的人員，不僅要具備強(qiáng)烈的責(zé)任心，耐心細(xì)致的進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，具有嚴(yán)謹(jǐn)對待科學(xué)實(shí)驗(yàn)的態(tài)度，還需熟知實(shí)驗(yàn)原理，熟練操作相關(guān)設(shè)備，規(guī)范使用儀器，熟悉檢測步驟和方法，明確工作流程，掌握實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制方法、檢測結(jié)果分析及生物安全防護(hù)措施。在出現(xiàn)錯(cuò)誤時(shí)具有分析查找原因的能力。在實(shí)驗(yàn)操作過程中，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)程序，高度集中精神，防止加錯(cuò)樣品或跳孔現(xiàn)象的發(fā)生，正確使用移液器，使用前檢查移液器量程，吸取液體時(shí)觀察吸頭液體的吸取量和是否取到液體。實(shí)驗(yàn)室人員要參與相關(guān)部門的盲樣比對考核，合格后方可上崗。定期進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室技能培訓(xùn)，查缺補(bǔ)漏，提高實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)技能，確?？茖W(xué)規(guī)范的檢測流程，準(zhǔn)確可靠的檢測數(shù)據(jù)。

5 討論

經(jīng)過以上分析，非洲豬瘟病毒檢測從采樣至實(shí)驗(yàn)室檢測操作中的每一個(gè)環(huán)節(jié)，都會不同程度的對其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響。因此，在檢測失敗時(shí)，認(rèn)真分析查找影響因素對非洲豬瘟病毒檢測的準(zhǔn)確性起到關(guān)鍵性作用。在基層實(shí)踐操作中，需要工作人員認(rèn)真嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶Υ僮髦械母鱾€(gè)環(huán)節(jié)，不斷積累和總結(jié)經(jīng)驗(yàn)、查找問題等能力也是提高非洲豬瘟病毒檢測準(zhǔn)確性的必備技能還需配備與檢測要求相符合的實(shí)驗(yàn)條件，盡可能的認(rèn)識和排除影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)因素。合進(jìn)而逐一避免，使非洲豬瘟檢測及時(shí)發(fā)揮預(yù)警預(yù)報(bào)作用，從而指導(dǎo)非洲豬瘟防控工作。