黃 威，劉正杰

(安徽大學(xué)a.化學(xué)化工學(xué)院；b.物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院，安徽合肥 230601)

黏度是細(xì)胞內(nèi)的一個重要微環(huán)境參數(shù)，在維持細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、分子間相互作用、營養(yǎng)物質(zhì)運輸和代謝產(chǎn)物擴散等生理過程起至關(guān)重要的作用[1-2]。人體細(xì)胞器黏度維持在一定范圍，黏度異常會影響細(xì)胞正常生理過程，從而誘發(fā)一系列的疾病[3-5]。例如，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的溶酶體黏度通常高于正常細(xì)胞，以此可作為腫瘤診斷的標(biāo)志[6]。作為細(xì)胞中最重要的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)之一，線粒體在細(xì)胞代謝和凋亡中起關(guān)鍵作用。研究證明，線粒體黏度的變化會影響線粒體的正常功能[7]，這與細(xì)胞色素C的釋放和膜的流動性變化有關(guān)。線粒體黏度異常能夠直接影響細(xì)胞代謝過程，進(jìn)而引起神經(jīng)退行性疾病、高血脂癥、惡性腫瘤等[8-9]。因此，監(jiān)測線粒體黏度具有重要意義。

傳統(tǒng)的黏度監(jiān)測工具如落球式、杯式和毛細(xì)管黏度計只適用于體外黏度測量，無法實現(xiàn)細(xì)胞層面的黏度監(jiān)測[10-11]。熒光探針具備非破壞性標(biāo)記、高靈敏度和高時空分辨率等優(yōu)點，已成為監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)黏度的一種重要工具[12-13]。近年，監(jiān)測線粒體黏度的探針被相繼報道，Zou等[14]合成一種小分子熒光探針，實現(xiàn)了對線粒體黏度變化的實時成像追蹤，并發(fā)現(xiàn)線粒體在自噬過程中黏度升高；Cui等[15]合成一種對黏度較敏感的探針，實現(xiàn)了對正常和去極化線粒體黏度變化的可區(qū)分成像。然而，目前多數(shù)用于黏度測定的探針是基于熒光的強度信息，測定結(jié)果受到與黏度無關(guān)因素如光漂白、探針濃度、激發(fā)光強度等的影響[16]。與熒光強度不同，熒光壽命與熒光團(tuán)濃度無關(guān)，這為監(jiān)測復(fù)雜細(xì)胞環(huán)境中的黏度提供了更可靠的信息[17]。針對上述問題，設(shè)計一種對線粒體黏度敏感且同時具有熒光強度和熒光壽命響應(yīng)的小分子探針2-[2-(5-二苯胺噻吩基)乙烯基]-1,3,3-三甲基-H-吲哚碘鹽，以期通過熒光強度和壽命的變化實現(xiàn)對細(xì)胞凋亡過程中線粒體黏度的監(jiān)測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

實驗儀器為旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE-52AA，德國艾卡)、熒光光譜儀(F-7000，日本日立)、真空干燥箱(FD-1C-80，上海比朗儀器)、紫外-可見吸收光譜儀(UH5300，日本日立)、超快時間分辨熒光光譜儀(FLUOROMAXPLUS-P，日本掘場)、高分辨質(zhì)譜儀(LTQ Orbitrap XL，美國賽默飛公司)、激光掃描共聚焦顯微鏡(TCS SP8，德國徠卡)。

碘甲烷、二苯胺、5-溴-2-噻吩醛、2,3,3-三甲基吲哚、甲基三辛基氯化銨、鄰二氯苯、碳酸鉀、小牛胸腺DNA、酵母RNA 均購于上海阿拉丁公司；乙醇、乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、石油醚購于上海國藥試劑公司；MTT(噻唑藍(lán)溴化四唑)、硫氫化鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、過氧化氫、硫酸鈉、亞硫酸鈉、次氯酸、氯化鈣、賴氨酸、谷胱甘肽購于美國Sigma公司。

1.2 探針分子的合成

探針分子的合成路線如圖1。

圖1 探針分子的合成路線Fig.1 Synthetic routes of probe molecule

1.2.1 化合物1的合成

稱取2.03 g 二苯胺(12.0 mmol)、2.85 g 5-溴-2-噻吩醛(15.0 mmol)置于250 mL 的圓底燒瓶中，依次加入碳酸鉀(2.07 g，15.0 mmol)、銅(0.23 g，3.6 mmol)、甲基三辛基氯化銨(1.00 g，2.5 mmol)，再加入100 mL鄰二氯苯使其溶解，設(shè)置溫度為120 ℃，冷凝回流，反應(yīng)48 h。反應(yīng)液冷卻后進(jìn)行減壓抽濾，取濾液，蒸除多余的溶劑，得到油狀物。使用柱層析對所得的粗產(chǎn)物進(jìn)一步分離純化，洗脫劑為石油醚與乙酸乙酯(體積比=20∶1)，最終得到黃色固體化合物1(1.00 g，產(chǎn)率30%)?；衔?的核磁數(shù)據(jù)如圖2。1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ9.56(s,1H),7.70(d,J=4.3 Hz,1H),7.46～7.40(m,4H),7.34～7.25(m,6H),6.30(d,J=4.3 Hz,1H);13C NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ182.29, 163.94, 146.07, 140.42, 130.65, 130.07, 127.10, 126.17, 111.89, 40.69, 40.48,40.27,40.06,39.85,39.64,39.43。

圖2 化合物1的1H NMR和13C NMRFig.2 1H NMR and 13C NMR spectrum of compound 1

1.2.2 化合物2的合成

稱取1.59 g 2,3,3-三甲基吲哚(10.0 mmol)、1.70 g 碘甲烷(12.0 mmol)置于250 mL 的圓底燒瓶中，取50 mL乙腈溶解，設(shè)置溫度為80 ℃，冷凝回流，反應(yīng)12 h。反應(yīng)冷卻后除去多余的溶劑，通過減壓抽濾得到紫紅色固體化合物2(2.20 g，產(chǎn)率73%)。所得產(chǎn)物用乙腈洗滌3 次即可，無需進(jìn)一步純化?；衔? 的核磁數(shù)據(jù)如圖3。1H NMR (400 MHz,DMSO-d6)δ7.90～7.85 (m,1H),7.82～7.76 (m,1H),7.62～7.54 (m,2H),3.94 (s,3H),2.74(s,3H),1.49(s,6H);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ196.56,142.66,142.16,129.86,129.36,123.85,115.68,54.47,35.29,22.25,14.74。

圖3 化合物2的1H NMR和13C NMRFig.3 1H NMR and 13C NMR spectrum of compound 2

1.2.3 探針分子的合成

稱取0.28 g化合物1(1.0 mmol)、0.30 g化合物2(1.0 mmol)置于150 mL的圓底燒瓶中，取40 mL乙醇作為溶劑，溶解固體，設(shè)置溫度為80℃，冷凝回流，反應(yīng)24 h。反應(yīng)液冷卻后除去多余溶劑，使用洗脫劑二氯甲烷與甲醇(體積比=30∶1)的柱層析對粗產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到紫黑色固體2-[2-(5-二苯胺噻吩基)乙烯基]-1,3,3-三甲基-H-吲哚碘鹽(0.29 g，產(chǎn)率50%)。探針分子的核磁數(shù)據(jù)如圖4。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ8.44(d,J=15.0 Hz,1H),8.00(d,J=4.7 Hz,1H),7.66(d,J=7.4 Hz,1H),7.58～7.33(m,13H),6.51～6.41(m,2H),3.73(s,3H),1.64(s,6H);13C NMR(101 MHz,DMSO-d6)δ178.26,168.85,146.28,145.25,142.71,142.59,130.98,129.16,128.51,128.16,127.37,126.82,123.06,114.23,113.40,103.11,50.82,32.98,26.78。

圖4 探針分子的1H NMR和13C NMRFig.4 1H NMR and 13C NMR spectrum of probe molecule

1.3 探針分子光譜性質(zhì)的表征

1.3.1 熒光及吸收光譜

將探針分子分別溶解在水和甘油(用水模擬低黏度環(huán)境，甘油模擬高黏度環(huán)境)體系中，配制成濃度為1×10-5mol/L的2種工作溶液。采用紫外-可見吸收光譜儀測量探針分子的吸收光譜，激發(fā)光波長為570 nm。

1.3.2 熒光強度選擇性實驗

配制一系列不同分析物(包括無機鹽、還原性硫、活性氧、氨基酸、核酸等)的溶液，加入探針使其濃度為1×10-5mol/L，使用熒光光譜儀測定探針在各溶液中的熒光強度。

1.3.3 黏度響應(yīng)實驗

在水和甘油體系中，通過改變甘油比例來模擬不同的黏度(η)環(huán)境。將探針加入不同黏度的水-甘油混合體系中，配制成濃度為1×10-5mol/L 的探針溶液，使用熒光光譜儀和超快時間分辨熒光光譜儀測定不同黏度環(huán)境下探針分子的熒光強度和熒光壽命。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及染色

細(xì)胞培養(yǎng)：Hep G2(人肝癌細(xì)胞)購于中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，將其置于含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))青霉素-鏈霉素抗生素的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)；將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于5%CO2(體積分?jǐn)?shù))培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。

活細(xì)胞成像：將探針分子以二甲基亞砜為溶劑配制成濃度為1 mmol/L 的母液，成像時用培養(yǎng)基稀釋；將接種的Hep G2 細(xì)胞在適量濃度的探針分子稀釋液中孵育30 min 后，采用PBS(磷酸鹽緩沖液)緩沖液清洗3～5次，通過共聚焦熒光顯微鏡成像，采用如下公式計算細(xì)胞的存活率D。

式中：A為加樣孔中在492 nm 處的吸光度；B為對照組孔在492 nm 處的吸光度；C為空白對照組孔在492 nm處的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 探針分子的光譜性質(zhì)

2.1.1 吸收和熒光光譜性質(zhì)

圖5顯示：探針處于水環(huán)境時，在波長為575 nm處有一個明顯的吸收峰，而(探針)處于高黏度的甘油環(huán)境中時，吸收峰紅移至585 nm 處；探針在水中幾乎沒有熒光信號，在甘油中有明顯的熒光增強，發(fā)射波長在650 nm 左右。這是由于高黏度的環(huán)境限制探針的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)，抑制非輻射躍遷，從而導(dǎo)致熒光增強。

圖5 探針的光譜性質(zhì)Fig.5 Spectral properties of probe

2.1.2 熒光強度選擇性

探針的熒光強度選擇性實驗結(jié)果如圖6。圖中：1 為blank；2 為Na+；3 為K+；4 為Mg2+；5 為Ca2+；6 為SO42-；7 為SO32-；8 為HPO4-；9 為H2S；10 為HClO；11 為H2O2；12 為賴氨酸；13 為谷胱甘肽；14 為RNA；15 為DNA；16 為甘油。樣品1～13 的濃度為100 mmol/L；樣品14，15 的質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL；樣品16 為純甘油。由圖6 可看出，探針僅對黏度有很強的熒光強度響應(yīng)，對其他分析物如無機鹽、氨基酸、核酸等無響應(yīng)。

圖6 探針的熒光強度選擇性Fig.6 Selectivity based on fluorescence intensity of probe

2.2 探針分子對黏度的響應(yīng)

2.2.1 熒光強度對黏度的響應(yīng)

圖7(a)為探針在不同黏度環(huán)境下的熒光光譜及其與黏度的響應(yīng)關(guān)系。由圖7可知：在低黏度環(huán)境下探針分子有熒光響應(yīng)，隨甘油含量的增加探針分子的熒光強度增強，純甘油中的熒光強度為純水中的50倍，表明探針對黏度高度敏感；探針的熒光強度與其所處環(huán)境黏度符合良好的線性關(guān)系，R2=0.99。

圖7 探針熒光強度對黏度變化的響應(yīng)Fig.7 Response of probe fluorescence intensity to viscosity change

2.2.2 熒光壽命對黏度的響應(yīng)

探針熒光壽命及其與黏度的響應(yīng)關(guān)系如圖8。由圖8 可看出：在不同黏度環(huán)境下，探針的熒光壽命也表現(xiàn)出高度敏感，純水環(huán)境中探針的熒光壽命僅0.027 ns，純甘油中可達(dá)1.903 ns；與熒光強度相似，探針的熒光壽命與其所處環(huán)境黏度在一定范圍內(nèi)也符合良好的線性關(guān)系，R2= 0.99。

圖8 探針熒光壽命對黏度變化的響應(yīng)Fig.8 Response of probe fluorescence lifetime to viscosity change

2.3 探針分子的細(xì)胞毒性

細(xì)胞中加入外源性的物質(zhì)或毒性大的探針分子時會對細(xì)胞正常的生理代謝活動產(chǎn)生影響，使細(xì)胞進(jìn)入應(yīng)激狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生過量的活性氧，繼而破壞細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，毒性較大時甚至?xí)l(fā)細(xì)胞的自噬和凋亡。不同探針分子濃度下的細(xì)胞存活率如圖9。由圖9 可看出：探針濃度達(dá)10 μmol/L 時，Hep G2 細(xì)胞仍擁有80%以上的存活率；探針濃度為2 μmol/L時，Hep G2 細(xì)胞存活率可達(dá)90%，表明該濃度下的探針幾乎不會對細(xì)胞的存活和生長產(chǎn)生影響。

圖9 探針的細(xì)胞毒性實驗結(jié)果Fig.9 Cytotoxicity test results of probe

2.4 探針分子在細(xì)胞中的定位

探針在細(xì)胞中的定位情況如圖10。由圖10可看出，探針的熒光信號與線粒體商染重疊度較高。采用共聚焦軟件計算得到探針通道與線粒體商染的共定位系數(shù)為0.83，表明探針在細(xì)胞中能夠靶向線粒體，這是由于線粒體具有-180～-200 mV的膜電勢，探針帶正電，能夠較好地在線粒體內(nèi)膜上富集。

圖10 探針的共定位實驗結(jié)果Fig.10 Co-location experimental results of probe

2.5 探針分子對線粒體黏度變化的實時監(jiān)測

為研究細(xì)胞凋亡過程中線粒體黏度的變化，使用外源性的制霉菌素刺激細(xì)胞凋亡，采用共聚焦顯微鏡觀察此過程中探針熒光強度和熒光壽命的變化，結(jié)果如圖11。

圖11 線粒體黏度的實時監(jiān)測Fig.11 Real-time monitoring of mitochondrial viscosity

由圖11(a)可見：探針在線粒體中的熒光強度隨時間的增加而增強，說明線粒體黏度上升；線粒體黏度隨凋亡水平的增加而逐漸增加，這一結(jié)果與之前的報道[12]是一致的。但是，由于熒光強度受到探針濃度或光漂白的干擾，僅通過熒光強度成像分析難以準(zhǔn)確計算出黏度，因此使用熒光壽命成像對實驗結(jié)果進(jìn)行分析。由圖11(a)中熒光壽命成像可見：在初始狀態(tài)下，探針在線粒體中的熒光壽命為0.824 ns，對應(yīng)黏度為78.79 mPa·s；進(jìn)一步培養(yǎng)30 min 后，熒光壽命延長至0.986 ns，相應(yīng)黏度為121.09 mPa·s，如圖11(b)，(c)，證實線粒體黏度增加；用另一種凋亡誘導(dǎo)劑依托泊苷處理細(xì)胞時也得到了類似的結(jié)果，如圖11(d)～(f)。

3 結(jié)論

設(shè)計合成一種用于監(jiān)測線粒體黏度的小分子熒光探針2-[2-(5-二苯胺噻吩基)乙烯基]-1,3,3-三甲基-H-吲哚碘鹽。結(jié)果表明：探針對線粒體具有特異性靶向，對黏度敏感且熒光響應(yīng)迅速；利用探針，結(jié)合共聚焦顯微鏡的熒光強度和壽命成像，可實現(xiàn)不同生理過程中黏度的雙模式成像。這種活細(xì)胞成像的策略可進(jìn)一步用于動態(tài)監(jiān)測線粒體黏度的變化，為線粒體生理學(xué)的研究提供潛在工具。