吳 瓊，謝宗池，黃 河，李 甜，朱曉晴，李 武*，李鐵浪*（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

缺血性心臟?。╥schemic heart disease, IHD），也被稱為冠心?。╟oronary heart disease, CHD），是由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起血管狹窄，引發(fā)心肌缺血缺氧甚至壞死的一種綜合征，屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“心痛”的范疇[1]。 《針灸大成·卷五》曰：“心內(nèi)怔忡，心俞、內(nèi)關(guān)、神門。”心俞穴是臨床上治療胸痹心痛的常用穴位之一[2-4]。 《素問·舉痛論》中有“寒氣客于背俞之脈則脈泣，脈泣則血虛，血虛則痛，其俞注于心，故相引而痛，按之則熱氣至，熱氣至則痛止矣”的記錄，其中，“按之則熱氣至，熱氣至則痛止矣”闡釋了按法治療胸痹心痛等痛癥的作用機(jī)制[5]。 有研究發(fā)現(xiàn)，按法的機(jī)械刺激、熱傳遞與穴位深部的熱源物質(zhì)有關(guān)，機(jī)械刺激激發(fā)機(jī)體處于高能代謝狀態(tài)，使局部溫度升高，產(chǎn)生“熱氣至”效應(yīng)，從而改善血液循環(huán)，發(fā)揮散寒通絡(luò)止痛的作用[6]，是針對(duì)胸痹“陰寒內(nèi)盛，胸陽痹阻”病機(jī)的治療關(guān)鍵[7]。 生理情況下，心肌細(xì)胞能量供需處于動(dòng)態(tài)平衡，但是在強(qiáng)烈應(yīng)激和缺血缺氧時(shí)，心臟能量供需失衡，影響心臟正常生理功能[8]，因此，改善心肌能量供需平衡有利于恢復(fù)心臟正常功能?；谝陨峡茖W(xué)事實(shí)，本團(tuán)隊(duì)欲探索按法干預(yù)心俞穴發(fā)揮心肌保護(hù)效應(yīng)的機(jī)制及其與心肌能量代謝的關(guān)系，故本實(shí)驗(yàn)采用急性心肌缺血模型，通過按法干預(yù)心俞穴觀察心肌損傷指標(biāo)和能量代謝產(chǎn)物含量變化，探討按法干預(yù)心俞穴對(duì)心肌缺血的保護(hù)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

36 只健康雄性成年SD 大鼠（SPF 級(jí)），由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，體質(zhì)量250～280 g，分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度24～26 ℃，濕度50%～70%。

將36 只動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、按法組3 組，每組12 只。 假手術(shù)組開胸后冠狀動(dòng)脈只扎不結(jié)；模型組、按法組采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)建立大鼠心肌缺血模型[9]。 按法組術(shù)后第2 天介入按法干預(yù)，其余兩組不予按法刺激，僅捆綁固定。

1.2 主要儀器和試劑

冷凍離心機(jī)（型號(hào)：DDL-5，上海安亭科學(xué)儀器）；倒置熒光數(shù)碼顯微鏡（型號(hào)：TS100FIX73-U，Nikon 公司）；小動(dòng)物心電圖儀（型號(hào)：ECG-2303B，廣州三銳電子科技有限公司）；自動(dòng)酶標(biāo)儀（型號(hào)：Infinite F50，瑞士帝肯公司）；雙通道色譜工作站（型號(hào)：N-2000，日本島津公司）。 生理鹽水（批號(hào)：CZ0108，北京雷根生物技術(shù)有限公司）；4%多聚甲醛（批號(hào)：BL539A，北京白鯊易科技有限公司）；LDH試劑盒（批號(hào)：70120，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司）；cTnI 試劑盒（批號(hào)：JM-01784R2）、CK-MB 試劑盒（批號(hào)：JM-02031R2）、ATP 試 劑 盒（批 號(hào)：ADSYS-122）、ADP 試劑盒（批號(hào)：ADS-YS-128）、AMP試劑盒（批號(hào)：ADS-YS-135）均來自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 造模方法

參考文獻(xiàn)[9]以冠脈左前降支結(jié)扎術(shù)建立大鼠心肌缺血模型。

1.3.1 術(shù)前準(zhǔn)備 提前配置10%水合氯醛溶液，按照腹腔注射280 mg/kg（0.004 mL/g）劑量麻醉大鼠，仰臥位固定于自制手術(shù)臺(tái)備皮，乙醇消毒胸前和四肢皮膚，用眼科剪和眼科鑷分離大鼠頸部皮膚及皮下組織，暴露氣管行氣管插管術(shù)，連接實(shí)驗(yàn)小動(dòng)物呼吸機(jī)（呼吸頻率45～65 次/min，呼吸比1∶1，潮氣量為20 mL）和小動(dòng)物心電圖儀。

1.3.2 手術(shù)造模 準(zhǔn)備完畢后，用手術(shù)剪剪開大鼠3～4 肋間左側(cè)皮膚，用彎頭鑷順著肌肉紋理鈍性分離皮下組織，用眼科鑷分離3、4 肋間肌肉，夾出胸腺（色白如脂）并用眼科拉鉤固定，剝離心包膜，充分暴露心臟冠狀動(dòng)脈左前降支，用6-0 號(hào)縫合線穿過結(jié)扎并拉緊絲線，建立心肌缺血模型，逐層縫合肋骨、皮膚，涂抹碘伏、乙醇，再次消毒以防感染。 模型評(píng)價(jià)：結(jié)扎大鼠心臟冠狀動(dòng)脈左前降支后，結(jié)扎局部心肌明顯變白，心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST 段抬高，以PR 段為基線，記錄QRS 波群終點(diǎn)與ST 段交接處的J 點(diǎn)位移，該點(diǎn)上升或下降0.1 mV 或以上，則視為造模成功[10]。取造模前、造模后、干預(yù)后共計(jì)3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測4 個(gè)波型，取其平均值，記錄并計(jì)算J 點(diǎn)變化值，無論升高或降低，取其變化絕對(duì)值。

1.4 干預(yù)方法

參照胡元亮《實(shí)用動(dòng)物針灸手冊(cè)》[11]有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，采用擬人比照法選取雙側(cè)心俞（背部，第五胸椎后兩旁的肋間中，左右側(cè)各一穴），將造模48 h 后大鼠俯臥位捆綁于按摩床（專利號(hào)：201720875965.4），穴位局部備皮。 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[6]，將自制按法刺激儀的力量參數(shù)設(shè)置為0.14 kg，并于雙側(cè)心俞穴行按法刺激，單側(cè)刺激時(shí)間7.5 min，雙側(cè)共計(jì)15 min，其余兩組不予按法刺激，僅捆綁固定。 每次干預(yù)或捆綁15 min，每日1 次，連續(xù)7 d。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 心電圖J 點(diǎn)位置 將每組12 只大鼠仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，連接小動(dòng)物心電圖儀，待穩(wěn)定后，分別記錄、比較大鼠造模前、造模后、干預(yù)后的標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖的J 點(diǎn)（QRS 波群的終點(diǎn)與ST 段交接處）位移。

1.5.2 心肌酶含量 分別于大鼠造模、干預(yù)后對(duì)各組大鼠血液進(jìn)行采集，通過腹主動(dòng)脈采集血液4～5 mL，置于高速離心機(jī)中以3000 r/min 速度離心15 min，取上清液2～3 mL，置于-80 ℃冰箱冷凍保存，按照試劑盒說明書操作步驟測定大鼠血清中肌鈣蛋白I（cardiac troponin I, cTnI）、肌酸激酶MB 同工酶（creatine kinase MB isoenzymes, CK-MB）、乳酸脫氫酶（layered double hydroxide, LDH）含量。本次實(shí)驗(yàn)取每組12 只大鼠的血清檢測心肌酶含量時(shí)，假手術(shù)組1 例、模型組1 例、按法組2 例樣本均出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，直接剔除，未納入統(tǒng)計(jì)。

1.5.3 心肌組織病理形態(tài)變化 每組隨機(jī)選取6 只大鼠的全心樣本用于HE 染色。從4%多聚甲醛溶液中取出心肌組織樣本，石蠟包埋后切片，常規(guī)脫水包埋，使其切片脫蠟至水，蘇木精水溶液中染5 min，用流水沖洗，鹽酸乙醇中分化3 s，流水沖洗15 min后入蒸餾水5 min，再入70%和90%乙醇中脫水各10 min，入伊紅染色液染色2 min，再以無水乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封固，放置蓋玻片，晾干后于顯微鏡下觀察，并用電腦拍照記錄。

1.5.4 心肌細(xì)胞能量代謝水平 除去上述用于HE染色大鼠，每組剩余6 只大鼠的心肌組織用于心肌能量代謝物質(zhì)含量檢測。 完成末次心電圖測量后，將大鼠斷頸處死，取心臟，用生理鹽水將心臟內(nèi)殘血沖洗干凈，剔除血管、脂肪等非心肌組織，利用吸水紙去除多余水分，沿著冠狀溝切除心房，留下心室，將心肌組織在勻漿介質(zhì)中制成勻漿液后，按照試劑盒說明書操作步驟測定其三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP）、二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）和一磷酸腺苷（adenosine monophosphate,AMP）含量，最后計(jì)算能荷值（energe charge, EC）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 計(jì)量資料以“±s”進(jìn)行描述，若符合正態(tài)分布和方差齊性，采用單因素方差分析并以LSD 或SNK-Q 法進(jìn)行多重比較；若不符合方差齊性，采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)；重復(fù)測量數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)方差分析。所有數(shù)據(jù)均以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心電圖J 點(diǎn)位置比較

造模后，模型組和按法組大鼠心電圖J 點(diǎn)位置較假手術(shù)組、造模前明顯上抬(P＜0.05)，說明造模成功。干預(yù)后，模型組和按法組J 點(diǎn)位置均較造模后明顯下移(P＜0.05)；與模型組相比，按法組大鼠心電圖J 點(diǎn)位置明顯下移(P＜0.05)。 詳見表1。

表1 3 組大鼠心電圖Ⅱ?qū)?lián)J 點(diǎn)位置比較（±s，mV）

表1 3 組大鼠心電圖Ⅱ?qū)?lián)J 點(diǎn)位置比較（±s，mV）

注：與造模前比較，△P＜0.05；與造模后比較，□P＜0.05；與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組按法組n 12 12 12造模前0.20±0.04 0.18±0.05 0.17±0.03造模后0.22±0.02 0.36±0.05△*0.37±0.06△*干預(yù)后0.19±0.04 0.30±0.06△□*0.21±0.04□★

2.2 各組大鼠血清心肌酶含量比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清cTnI、CKMB、LDH 含量明顯升高(P＜0.01)，按法組大鼠血清cTnI 含量明顯降低(P＜0.01)，但血清CK-MB、LDH含量明顯升高(P＜0.01)；與模型組相比，按法組大鼠血清cTnI、CK-MB、LDH 含量明顯降低(P＜0.01)。 詳見表2。

表2 3 組大鼠血清心肌酶含量比較（±s）

表2 3 組大鼠血清心肌酶含量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，□□P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組按法組n 11 11 10 cTnI/（μg/L）24.03±2.15 41.70±9.83△△19.05±0.71△△□□CK-MB/（U/mL）698.01±172.52 1 774.46±377.67△△1 175.59±81.64△△□□LDH/（U/mL）330.55±101.95 1 332.55±429.07△△695.00±107.62△△□□

2.3 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)變化

假手術(shù)組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、邊界整齊，未見炎性細(xì)胞浸潤；與假手術(shù)組比較，模型組心肌損傷嚴(yán)重，心肌細(xì)胞排列紊亂、邊界模糊，炎性細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫伴出血，部分橫紋壞死、溶解，提示手術(shù)造模后可產(chǎn)生心肌缺血樣病理改變，成功建立心肌缺血大鼠模型；按法組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為清晰，可見少量炎性細(xì)胞浸潤和出血，提示按法干預(yù)心俞穴可有效改善心肌缺血大鼠的心肌損傷狀態(tài)。 詳見圖1。

圖1 3 組大鼠心肌組織病理形態(tài)變化（HE，×200）

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞能量代謝物質(zhì)含量比較

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞ATP 含量、EC 值明顯降低（P＜0.01），ADP、AMP 含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組對(duì)比，按法組心肌細(xì)胞ATP含量、EC 值明顯升高（P＜0.01），AMP 含量明顯降低（P＜0.01）。 詳見表3。

表3 3 組大鼠心肌細(xì)胞能量代謝物質(zhì)含量比較（±s，nmol/L）

表3 3 組大鼠心肌細(xì)胞能量代謝物質(zhì)含量比較（±s，nmol/L）

注：與假手術(shù)組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，□□P＜0.01。

組別假手術(shù)組模型組按法組n 66 6 ATP 4 799.90±280.92 2 798.19±392.27△△5 189.96±222.99□□ADP 3 594.89±90.44 5 056.79±234.67△△4 515.60±872.70 AMP 35.02±1.80 39.00±0.80△△24.89±1.05△△□□EC 0.79±0.01 0.67±0.02△△0.77±0.02□□

3 討論

3.1 按壓心俞對(duì)心肌缺血大鼠的保護(hù)作用

張仲景在《金匱要略》中正式提出“胸痹”名稱，認(rèn)為陰寒內(nèi)盛、胸陽痹阻、心脈凝滯、不通則痛是該病的主要病機(jī)，當(dāng)以散寒通陽、活血止痛為法[12]。 按法作用機(jī)制關(guān)鍵為“按之則熱氣至，熱氣至則痛止矣”，即按法“熱氣至”效應(yīng)具有散寒止痛之功，熱氣至則陰寒散，陰寒散則氣血通，通則不痛，可有效治療“胸痹心痛”，即冠心病心絞痛[13]。 臨床研究表明，穴位按壓應(yīng)用于冠心病心絞痛的急救，起效迅速且沒有不良反應(yīng)[14]。 其中，心俞穴作為心之背俞穴，可通過經(jīng)絡(luò)氣街直接聯(lián)絡(luò)心臟，因此，古代醫(yī)家治療胸痹心痛時(shí)，膀胱經(jīng)常用穴、背部常用穴、常用背俞穴都是心俞穴[15]，可見心俞穴是治療胸痹心痛的要穴之一。 同時(shí)，基礎(chǔ)研究表明，刺激心俞穴可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮性氨基酸過度釋放，緩解其興奮性神經(jīng)毒性的產(chǎn)生，保護(hù)缺血心肌[16]；可降低大鼠血清心肌酶水平，改善缺血心肌損傷狀態(tài)[17-18]；可通過上調(diào)外周血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，減輕缺血心肌血管內(nèi)皮細(xì)胞的受損程度[19]；可提高機(jī)體抗氧化能力，降低心肌組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度，保護(hù)受損心肌細(xì)胞[20]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支后，心電圖Ⅱ?qū)?lián)J 點(diǎn)上移，提示心肌缺血模型成功建立，干預(yù)7 d 后再次檢測心電圖，發(fā)現(xiàn)其Ⅱ?qū)?lián)J 點(diǎn)下移，符合心肌缺血的心電變化規(guī)律和診斷標(biāo)準(zhǔn)[21]，提示未經(jīng)治療的模型組心肌缺血情況尚未顯著好轉(zhuǎn)。按法組大鼠造模成功后，經(jīng)7 d 按壓心俞治療，心電圖Ⅱ?qū)?lián)J 點(diǎn)位置均低于干預(yù)前，提示按壓心俞可有效改善心肌缺血狀態(tài)，與團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果相符[22]。心肌組織病理形態(tài)變化是反映急性心肌缺血程度的重要指標(biāo)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)應(yīng)用廣泛，亦可作為心肌缺血大鼠按法治療效果的判斷標(biāo)準(zhǔn)之一[23]。 本實(shí)驗(yàn)HE 染色顯示，模型組呈現(xiàn)缺血樣改變，按法組病理形態(tài)改變顯著，提示按壓心俞穴能明顯改善大鼠心肌缺血狀況。

3.2 按壓心俞穴改善缺血心肌能量代謝的作用機(jī)制

當(dāng)心臟缺血缺氧時(shí)，ATP 分解增加、合成減少，以維持機(jī)體能量供應(yīng)，一旦能量供需失衡會(huì)引發(fā)氧代謝異常，導(dǎo)致無氧酵解成為ATP 產(chǎn)生的重要來源，嚴(yán)重?fù)p害細(xì)胞正常功能，加速自由基產(chǎn)生，引起脂質(zhì)過氧化，同時(shí)，誘發(fā)鈣超載破壞心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、壞死，加重心肌缺血，嚴(yán)重影響心肌正常生理功能，臨床上常表現(xiàn)為胸悶、心絞痛等心肌缺血癥狀[24]。 機(jī)體可通過對(duì)能量代謝物質(zhì)含量的調(diào)控，抑制線粒體凋亡通路的激活，減少心肌酶、炎性因子、氧自由基的產(chǎn)生與釋放，保護(hù)缺血心肌[25]。 其中，能量代謝物質(zhì)（ATP、ADP、AMP）作為維持正常生理機(jī)能的主要能量來源，檢測其含量變化是闡釋機(jī)體能量代謝活動(dòng)及其規(guī)律的重要途徑。 cTnI 作為調(diào)節(jié)心肌收縮的主要蛋白之一，正常情況下無明顯表達(dá)，當(dāng)心肌細(xì)胞出現(xiàn)損傷時(shí)，該蛋白以游離形式大量釋放入血[26-27]；CK-MB 在心肌細(xì)胞中含量最多，屬于肌酸激酶同工酶，常作為心肌缺血的輔助診斷指標(biāo)[28]；LDH 作為糖酵解酶，其活性可反映心肌損傷程度[18]。 當(dāng)大鼠因心肌缺血引發(fā)心肌損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，上述3 種心肌酶透過細(xì)胞膜大量釋放入血，致使血清心肌酶含量異常升高，檢測其血清含量變化是診斷機(jī)體心肌損傷及其恢復(fù)程度的重要指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血清心肌酶含量顯著升高，心肌細(xì)胞ATP、EC 水平降低，ADP、AMP 含量升高，提示心肌缺血時(shí)，心肌細(xì)胞中心肌酶大量外溢，導(dǎo)致血清心肌酶含量升高，同時(shí)，ATP 大量分解為ADP、AMP，以維持心肌能量供應(yīng)。團(tuán)隊(duì)前期研究表明，按法可提高缺血心肌的能量代謝物質(zhì)含量，改善局部血液循環(huán)和能量代謝障礙[22]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，按法組大鼠心肌酶含量明顯降低，ATP、EC 水平明顯升高，AMP 含量下降，表明按壓心俞穴可能保護(hù)心肌細(xì)胞膜的完整性，減少心肌酶外溢入血，降低血清心肌酶含量，同時(shí)，減緩心肌細(xì)胞ATP 分解為ADP、AMP 的速度，保護(hù)缺血心肌。 何永剛[29]通過對(duì)心肌缺血模型大鼠予以針刺治療，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)針刺能夠顯著抑制其心電圖ST段抬高，減小心肌梗死面積，升高心肌組織ATP 的含量，降低AMP 的含量，緩解心肌能量代謝障礙，與本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

綜上所述，按壓心俞穴可有效改善心肌缺血大鼠心電和心肌病理變化，抑制心肌細(xì)胞心肌酶釋放和ATP 分解，作用機(jī)制可能是通過抑制心肌ATP分解，減少ADP、AMP 含量，提高ATP 含量和EC 水平，改善能量代謝障礙，同時(shí)，抑制心肌酶外溢入血，保護(hù)心肌細(xì)胞。但是本實(shí)驗(yàn)尚存不足，細(xì)胞自噬和凋亡是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝的重要機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)未在細(xì)胞自噬和凋亡方面進(jìn)行深入研究，因此，在未來的實(shí)驗(yàn)中將會(huì)進(jìn)一步探討。